对nedd8活化酶(nae)抑制剂的反应的生物标记的制作方法
【专利摘要】本发明揭示标记，其突变状态与对用NAE抑制剂治疗的敏感性相关。突变状态通过测量与标记基因相关的标记的特征确定。提供用于评定标记基因的标记以预测对NAE抑制治疗的反应的组合物和方法。
【专利说明】对NEDD8活化酶(NAE)抑制剂的反应的生物标记
[0001]相关申请案
[0002]本申请案要求2011年10月28日提交的美国临时申请案第61/552，686号的优先权。上述申请案的全部内容以引用的方式并入本文中。
[0003]序列表
[0004]本申请案包含以电子可读形式与此一起提交的序列表。所述序列表文件创建于2012年10月26日，命名为“序列表.txt”并且其大小是149kb(153，088个字节)。序列表.txt文件中的序列表的全部内容以这种引用的方式并入本文中。
【背景技术】
[0005]当细胞的基因型或表型以不受正常组织环境限制的不受控制生长的方式改变时，这些细胞发生癌变。一或多个基因突变、扩增、缺失、过度表达或表达不足。染色体部分会丢失或从一个位置移动到另一个。一些癌症具有特征性图案，基因型或表型借此改变。
[0006]许多基因具有与癌症相关的突变。一些基因具有可以发生突变的多个位点。许多癌症具有一个以上基因的突变和/或错误表达。基因突变会促进肿瘤进展、肿瘤生长率或肿瘤是否将转移。 一些突变会影响肿瘤细胞是否将对疗法起反应。
[0007]多种药剂治疗癌症。血液和骨髓的癌症通常用类固醇/糖皮质激素、酰亚胺、蛋白酶体抑制剂和烷基化剂治疗。其它组织的癌症通常用烷基化剂、拓扑异构酶抑制剂、激酶抑制剂、微管抑制剂、血管生成抑制剂或其它药剂治疗。一些患者对一种疗法的反应优于另一种，呈现患者遵从有效疗法的多种治疗途径的潜能。继续进行最终证实对患者无效的疗法会丢失所述患者治疗计划早期的宝贵时间。许多患者承受不起治疗方案的试误选择的时间。有利并准确的治疗决策促成疾病的有效管理。
【发明内容】
[0008]本发明涉及通过测量本文中所提供的标记的量、存在或变化对肿瘤进行预后和计划治疗。这些标记可预测在用NEDD8活化酶(NAE)抑制剂，例如1_取代的氨基磺酸甲酯治疗之后，是否将存在有利结果(例如良好反应、长进展时间和/或长期存活)。例如体外测定遗传标记的存在、量或变化(例如至少一个标记基因的突变状态)的包含肿瘤细胞的测试样品鉴别特定患者，这些患者预期例如用NAE抑制剂，例如1-取代的氨基磺酸甲酯治疗具有有利结果并且其疾病可以进行可管理地标准治疗或较不具有侵袭性的治疗；以及那些患者，这些患者预期具有不利的治疗结果并且可能需要组合治疗和/或用NAE抑制剂更具侵袭性的治疗的替代性治疗以确保有利结果和/或成功管理疾病。
[0009]在一个方面，本发明提供适用于测定所述标记的特征(例如量、存在或变化)的试剂盒。在另一个方面，本发明提供确定预后和治疗或疾病管理策略的方法。在这些方面，测量包含肿瘤细胞的样品中的标记的特征，例如大小、序列、组成或量。在一个实施例中，所述肿瘤是液体肿瘤，例如血液肿瘤，例如急性骨髓性白血病、骨髓发育不良综合症或多发性骨髓瘤。在另一个实施例中，所述肿瘤是实体肿瘤，例如黑素瘤、非小细胞肺癌、食道癌、膀胱癌、成神经细胞瘤癌、间皮瘤、胰脏癌。
[0010]在各种实施例中，测量对应于本文所述的具有一或多个突变(例如体细胞突变)的标记基因的特征，例如DNA的大小、序列、组成或量；RNA的大小、序列、组成或量和/或蛋白质的大小、序列、组成或量。当分析显示关于标记基因的信息时，例如基因是否突变、突变的一致性和/或突变基因的RNA或蛋白质量表明过度表达抑或表达不足，获得促成预后或治疗或疾病管理策略的有用信息。在一个实施例中，确定El酶抑制，例如NAE抑制，例如MLN4924疗法策略。
[0011]适用于确定预后或治疗或疾病管理策略的测试的标记基因选自由以下组成的群组:神经纤维瘤蛋白2 (NF2)、母亲抗DPP同源物4 (mothers against decapentaplegichomolog4 ；SMAD4)、赖氨酸特异性脱甲基酶6A(KDM6A)、肿瘤蛋白p53 (TP53)、周期素依赖性激酶抑制剂2A(⑶KN2A)、周期素依赖性激酶抑制剂2A pl4变异体(⑶KN2A_pl4)，在一些情况下，F盒和包含7的WD重复结构域(FBXW7)以及在一些情况下，腺瘤性结肠息肉病(APC)。每一标记基因包括突变或改变，所述突变或改变在DNA中的存在或例如其对标记RNA和/或蛋白质特征(例如量、大小、序列或组成)的影响可以提供关于确定预后或治疗或疾病管理的信息。在一些实施例中，例如在包含肿瘤细胞的样品中适用作标记的基因或突变体或其修饰形式所具有的DNA、RNA和/或蛋白质特征(例如大小、序列、组成或量)不同于正常的DNA、RNA和/或蛋白质。本文中描述称为“标记基因”的这些基因的修饰的实例，所述基因的突变或量可以提供此类信息。
[0012] 本发明标记的突变提供关于例如用NAE抑制剂，例如1-取代的氨基磺酸甲酯治疗之后的结果的信息。通过检查肿瘤中所鉴别的标记中的一或多者的特征，例如大小、序列、组成或量，有可能确定何种治疗剂、药剂组合、给药和/或投药方案预期在治疗之后提供有利结果。通过检查癌症中所鉴别的标记或标记组中的一或多者的特征，例如大小、序列、组成或量，还有可能确定何种治疗剂、药剂组合、给药和/或投药方案在治疗之后较不可能提供有利结果。通过检查所鉴别的标记中的一或多者的特征，例如大小、序列、组成或量，有可能因此消除无效或不当的治疗剂或治疗方案。重要地，可以基于逐个患者(patient-by-patient)进行这些确定。因此，可以确定特定治疗方案是否可能有益于特定患者或患者类型，和/或特定方案是否应该开始抑或避免、继续、中断或改变。
[0013]本发明是针对鉴别和/或选择癌症患者的方法，所述癌症患者预期在投与治疗方案，例如包含NAE抑制剂的治疗方案，例如1-取代的氨基磺酸甲酯治疗之后展现有利结果。此外提供鉴别预期在投与此类治疗方案之后具有不利结果的患者的方法。这些方法通常包括测量、确定、接收、储存或传递关于患者的肿瘤(例如患者的癌细胞，例如血液癌细胞或实体肿瘤细胞)中的一或多个标记或标记基因的突变的特征，例如大小、序列、组成或量的信息，任选地将所述特征与参考标记的特征，例如大小、序列、组成或量进行比较；并且在又一实施例中，鉴别或建议样品的结果是否对应于治疗方案，例如NAE抑制剂，例如1-取代的氨基磺酸甲酯治疗方案的有利结果。
[0014]此外提供的方法包括治疗方法，其进一步包括以下步骤:当在标记基因中突变的存在或患者标记的特征，例如大小、序列、组成或量表明所述患者预期用疗法，例如NAE抑制剂，例如1-取代的氨基磺酸甲酯治疗方案展现有利结果时，相应地开始、继续或启动疗法。另外，所述方法包括治疗方法，其进一步包括以下步骤:例如如相比于经鉴别具有有利结果的接受相同治疗方案的患者，当标记基因中突变的存在或患者标记的特征，例如大小、序列、组成或量表明所述患者预期用治疗，例如用NAE抑制剂，例如1-取代的氨基磺酸甲酯方案展现不利结果时，相应地停止、中断、改变或暂停疗法。在另一个方面，提供基于标记基因中突变的存在或本文所述的患者标记中的一或多者的特征，例如、大小、序列、组成或量来分析尚未用疗法，例如NAE抑制剂，例如1-取代的氨基磺酸甲酯疗法治疗的患者并且鉴别和预测治疗结果的方法。这些方法可包括不用所述疗法，例如NAE抑制剂，例如1-取代的氨基磺酸甲酯疗法治疗，用疗法，例如NAE抑制剂治疗或用1-取代的氨基磺酸甲酯疗法与一种另外的附加疗法的组合治疗；用NAE抑制剂，例如1-取代的氨基磺酸甲酯疗法的替代性疗法治疗；或用更具侵袭性的给药和/或投药方案疗法，例如El酶抑制剂，例如NAE抑制剂治疗，例如如相比于经鉴别具有标准NAE抑制剂，例如1-取代的氨基磺酸甲酯疗法的有利结果的患者的给药和/或投药方案。因此，所提供的本发明方法可以消除疗法，例如NAE抑制剂，例如1-取代的氨基磺酸甲酯疗法方案的无效或不当的使用。
[0015]附加方法包括测定药剂活性、药剂功效或鉴别新治疗剂或组合的方法。这些方法包括基于药剂影响标记基因中突变的存在或本发明标记的特征，例如大小、序列、组成或量的能力，鉴别所述药剂适用作例如NAE抑制剂，例如1-取代的氨基磺酸甲酯，用于治疗癌症，例如血液癌症(例如多发性骨髓瘤、白血病、淋巴瘤等)或实体肿瘤癌症(例如黑素瘤、食道癌或膀胱癌)的方法。举例来说，以表明患癌症患者的有利结果的方式减少或增加标记基因中突变的存在或所提供的标记的特征，例如大小、序列、组成或量的抑制剂将是癌症的候选药剂。或者，能够降低肿瘤细胞活力的药剂将是癌症的候选药剂，所述肿瘤细胞包含指示不利结果的标记。
[0016]本发明还针对用治疗方案，例如NAE抑制剂，例如1-取代的氨基磺酸甲酯疗法方案(例如单独或与附加药剂组合，所述附加药剂例如化学治疗剂，例如糖皮质激素剂、蛋白酶体抑制剂、烷基化剂、激酶抑制剂或拓扑异构酶抑制剂)治疗癌症患者的方法，其包括以下步骤:选择治疗其标记特征，例如大小、序列、组成或量表明所述患者预期具有所述治疗方案的有利结果的患者，并用所述疗法，例如NAE抑制，例如1-取代的氨基磺酸甲酯疗法治疗所述患者。在一些实施例中，所述方法可包括以下步骤:选择其标记特征，例如大小、序列、组成或量表明患者预期具有有利结果的患者并且投与除NAE抑制剂疗法以外表明与NAE抑制剂，例如1-取代的氨基磺酸甲酯疗法类似的预期存活时间的疗法。
[0017]治疗癌症患者的附加方法包括选择在用癌症疗法(例如NAE抑制剂,例如1-取代的氨基磺酸甲酯疗法)治疗之后不太可能经历有利结果的患者。这些方法可以进一步包括以下一或多者:如相比于经鉴别用标准疗法具有有利结果的患者的剂量或给药时程，投与更高剂量或增加给药时程的疗法，例如NAE抑制剂，例如1-取代的氨基磺酸甲酯；投与除NAE抑制剂，例如1-取代的氨基磺酸甲酯疗法以外的癌症疗法；投与NAE抑制剂，例如1-取代的氨基磺酸甲酯药剂与附加药剂的组合。进一步提供选择具有侵袭性疾病的患者的方法，所述患者预期展现更迅速的进展和死亡时间。
[0018]附加方法包括以下方法:通过检查患者的指示癌症疗法(例如NAE抑制剂，例如1-取代的氨基磺酸甲酯疗法方案)的结果的标记的量，评估是否治疗癌症抑或支付癌症的治疗，所述癌症例如血液癌症(例如多发性骨髓瘤、白血病、淋巴瘤等)或实体肿瘤癌症(例如黑素瘤、食道癌或膀胱癌)；并且作出关于是否应该支付的决策或建议。
[0019]本文中所提到的所有公开案、专利申请案、专利和其它参考文献的全部内容都以引用的方式并入文本中。
[0020]本发明的其它特征和优势将从以下【具体实施方式】、图式以及从权利要求书显而易知。
【专利附图】
【附图说明】
[0021]图1.1-取代的氨基磺酸甲酯的通式结构。G1是-O-或-CH2- ；G2是-H或-OH ；G3是-H或-OH ；G4是-NH-、-O-或共价键；以及G5是被取代的杂芳基。
[0022]图2.用于蛋白质底物的科林-环(cullin-ring)连接酶(CRL)泛素化和用于类泛素化修饰的通用路径。在CRL中，科林次单位必须通过泛素样蛋白NEDD8修饰保守赖氨酸以活化全酶活性。NEDD8活化和与科林蛋白的结合是通过酶级联催化的，所述酶级联与涉及NEDD8的El (NAE)和E2 (Ubc12)的泛素化是类似的。从科林去除NEDD8是通过C0P9信号体催化的。去类泛素化修饰有助于CRL组分的解离。科林-环核心通过结合到CANDl以非活性状态隔离直到得到补充以形成新CRL为止。
[0023]图3.第2组细胞系对MLN4924的反应。每个点表示一种细胞系。
[0024]图4A-B.比较各组细胞系对MLN4924的反应。A.通过EC50对第2组细胞系排序。黑线表示存在于第I组中的细胞系。在两个组中存在114个具有相同名称的细胞系。B.比较存在于两个组中的细胞系的对照百分比(POC)活力。重叠细胞系的结果具有0.72的斯皮尔曼等级相关系数，P值< 2.2e_16。
[0025]图5.在TP53突变的情况下抗性的组织相关性。相比于TP53wt细胞系，TP53突变体结肠癌细胞系对MLN4924治疗更具抗性(更高的对照百分比活力)。
[0026]图6A-D.在用不同剂量的MLN4924处理之后在多个时间点TP53 Loss对癌细胞系活力的影响。通过ATPlite，在一系列MLN4924浓度和时间点下测量TP53基因剔除对成对的HCT-116结肠癌细胞系对MLN4924的敏感性的影响。数据表示为平均值土SEM，N = 3。虚线，P53基因剔除；实线，p53野生型。
【具体实施方式】
[0027]癌症患者疗法的持续问题之一是响应于疗法的个体差异。虽然在开发成功癌症疗法方面有所进展，但是仅一个子集的患者对任一特定疗法起反应。在许多可获得的癌症疗法的窄治疗指数和潜在毒性的情况下，这些差别反应可能造成患者经历不必要的、无效的并且甚至可能有害的疗法方案。如果能够优化所设计的疗法以治疗个别患者，那么可以减少或甚至消除这些情况。此外，目标设计疗法可以提供总体而言更集中的成功患者疗法。因此，需要鉴别预期当投与特定癌症疗法时具有有利结果的特定癌症患者以及使用更具侵袭性的和/或替代性癌症疗法(例如替代向所述患者投与的先前癌症疗法)可以具有有利结果的特定癌症患者。因此提供癌症患者的诊断、分期、预后和监控将是有利的，所述癌症患者包括例如血液癌症患者(例如多发性骨髓瘤、白血病、淋巴瘤等)或实体肿瘤癌症(例如黑素瘤、食道癌或膀胱癌)，所述癌症患者将受益于特定癌症抑制疗法以及所述癌症患者将受益于更具侵袭性的和/或替代性癌症抑制疗法，例如替代患者已接受的癌症疗法，从而产生恰当的预防性测量。
[0028]本发明部分地基于以下认知:标记基因的突变可以与包含突变基因的细胞对NAE抑制剂、例如1-取代的氨基磺酸甲酯的敏感性相关。在一些实施例中，标记基因参与科林-环连接酶(CRL)路径，例如所编码的蛋白质与CRL或CRL相关蛋白质相互作用的基因，或是CRL底物。由标记基因编码的蛋白质可以具有作为肿瘤抑制基因的野生型功能。标记基因的实例包括NF2、SMAD4和/或KDM6A。标记基因的其它实例包括TP53、APCXDKN2A和/或CDKN2A_pl4。标记基因可以展现突变，例如体细胞突变，突变的存在会影响所编码的基因产物的表达或活性。在一些实施例中，在肿瘤细胞或肿瘤中可以在标记基因中存在一种以上突变或可以存在一个以上具有突变的标记基因。在附加实施例中，可以在附加基因中具有突变的细胞中存在标记基因突变，包括可以引起肿瘤发生的突变，但附加突变基因可以不是如本文中所认为的标记基因。在一些实施例中，所述突变是失活性突变。在其它实施例中，所述突变影响标记基因的表达。在其它实施例中，突变可以改变所编码的基因产物与细胞结合伴侣的相互相用。鉴别和/或测量标记基因的突变可以用于确定通过例如用NAE抑制剂、例如1-取代的氨基磺酸甲酯疗法处理肿瘤是否可以预期有利结果；或用例如NAE抑制剂、例如1-取代的氨基磺酸甲酯抑制剂的替代性疗法和/或更具侵袭性的疗法是否可以延长预期存活时间。举例来说，本文中所提供的组合物和方法可以用于确定是否预期患者对NAE抑制剂、例如1-取代的氨基磺酸甲酯治疗剂或NAE抑制剂、例如1-取代的氨基磺酸甲酯给药或投药方案具有有利结果。一般来说，本文所述的肿瘤抑制基因标记基因的突变与对NAE抑制剂的敏感性或NAE抑制剂处理的有利结果相关。可以在与科林-环连接酶相关的路径中充当肿瘤抑制基因并且其突变与对NAE抑制的敏感性相关的标记基因的实例包括 NF2、SMAD4、KDM6A、FBXW7、CDKN2A 和 / 或 CDKN2A_pl4。然而，TP53 和 APC 也是肿瘤抑制基因标记基因。具体来说，TP53路径基因与NAE抑制剂作用相关。如本文所述，在许多肿瘤类型的一些实施例中，TP53和APC(在一些情况下)的突变产生对NAE抑制的抗性。因此，来自TP53和APC组成的群组的野生型标记基因会与NAE敏感性相关。在一些实施例中，选自由TP53和APC组成的群组的标记基因的突变与对NAE抑制剂的抗性相关。
[0029]基于这些鉴别，本发明提供(但不限于):1)用于确定NAE抑制剂、例如1-取代的氨基磺酸甲酯疗法方案是否可有效获得有利结果和/或管理癌症的方法和组合物；2)用于监控用于治疗肿瘤的NAE抑制剂、例如1-取代的氨基磺酸甲酯疗法(单独或与药剂组合)和给药与投药的有效性的方法和组合物；3)用于治疗肿瘤的方法和组合物，包含例如NAE抑制剂、例如1-取代的氨基磺酸甲酯抑制疗法方案；4)用于鉴别可有效治疗特定患者的肿瘤的特定治疗剂和治疗剂组合以及给药和投药方案的方法和组合物；以及5)用于鉴别疾病管理策略的方法和组合物。
[0030]泛素和其它泛素样分子(Ubl)是通过特异性酶(El酶)活化的，所述特异性酶催化形成与ubl的C端甘氨酸的酰基-腺苷酸中间物。活化的ubl然后通过形成硫酯键中间物转移到El酶内的催化性半胱氨酸残基中。El-ubl中间物和E2结合，产生硫酯交换，其中ubl转移到E2的活性位点半胱氨酸。ubl然后直接地或连同E3连接酶一起，通过与目标蛋白中的赖氨酸侧链的氨基形成异肽键而结合到目标蛋白。名为神经前体细胞-表达发育下调8 (NEDD8)的ubl是通过杂二聚体NEDD8活化酶(NAE，也称为APPBP1_UBA3、UBE1C (泛素活化酶ElC))活化的并且转移到两种E2结合酶(泛素载体蛋白12(UBC12)和UBC17)中的一种，最终通过科林-环亚型泛素连接酶产生NEDD8与科林蛋白的连接(参见图2)。类泛素化修饰的功能是活化基于科林的泛素连接酶，所述连接酶参与许多细胞周期和细胞信号传导蛋白、包括P27和Ι-κΒ的转换。参见潘(Pan)等人，《致癌基因》(Oncogene) 23:1985-97(2004)。抑制NAE可以破坏科林-环连接酶介导的蛋白质转换并且可以在细胞(例如肿瘤细胞或病原性生物体(例如寄生虫)的细胞)中引起细胞凋亡性死亡。参见苏西(Soucy)等人(2010)《基因与癌症》(Genes&Cancer) 1:708_716。
[0031]如本文所用，术语“E1”、“E1酶”或“El活化酶”是指参与活化或促进泛素或泛素样(统称为“ubl”)与目标分子的结合的相关ATP依赖性活化酶家族中的任一者。El活化酶通过腺苷酰化作用/硫酯中间物形成起作用以通过转硫醇反应将恰当的ubl转移到相应E2结合酶中。所得活化的ubl-E2促进ubl与目标蛋白的最终结合。在细胞信号传导、细胞周期和蛋白质转换中起作用的各种细胞蛋白是用于ubl结合的底物，所述结合通过El活化酶(例如NAE、UAE、SAE)进行调节。除非上下文另有指示，否则术语“E1酶”打算是指任何El活化酶蛋白质，包括(但不限于)NEDD8活化酶(NAE(APPBP1/Uba3))、泛素活化酶(UAE (Ubal))、sumo 活化酶(SAE (Aosl/Uba2))、UBA4、UBA5、UBA6、ATG7 或 I SG 15 活化酶(UbelL)。
[0032]术语“E1酶抑制剂”或“E1酶的抑制剂”是用于表示具有如本文中所定义的结构的化合物，其能够与El酶相互作用并抑制其酶活性。抑制El酶活性意指降低El酶活化泛素(如ubl)与底物肽或蛋白质结合(例如泛素化、类泛素化修饰、苏素化)的能力。在一些实施例中，El酶抑制剂可以抑制一种以上El酶。在其它实施例中，El酶抑制剂对特定的El酶具有特异性。在各种实施例中，El酶活性的此类降低是至少约50%，至少约75%，至少约90%，至少约95%或至少约99%。在各种实施例中，降低El酶活性所需的El酶抑制剂的浓度小于约I μ Μ,小于约500ηΜ，小于约ΙΟΟηΜ，小于约50nM或小于约10nM。
[0033] 如本文所用，术语“ΝΑΕ抑制剂”是指NAE杂二聚体的抑制剂。NAE抑制剂的实例包括1-取代的氨基磺酸甲酯(参见图1)，包括MLN4924。兰斯顿(Langston)S.等人的美国专利申请案第11/700,614号，其PCT申请案公开为W007/092213、W006084281和W02008/019124(上述公开专利申请案中每一个的全部内容在此以引用的方式并入本文中)，揭示作为El活化酶的有效抑制剂的化合物，例如ΝΑΕ。在一些实施例中，NAE抑制剂不抑制或极差地抑制其它(非ΝΑΕ)Ε1酶。所述化合物适用于体外和体内抑制El活性并且适用于治疗细胞增殖病症，例如癌症；和与El活性相关的其它病症，例如病原性感染和神经退化性病症。兰斯顿等人所描述的一类化合物是4-取代的氨基磺酸((lS，2S，4R)-2-羟基-4-{7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-基}环戊基)甲酯。
[0034]MLN4924 (氨基磺酸((1S，2S，4R) _4_ {4_[ (IS) _2，3_ 二氢-1H-茚-1-基氨基]-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-基} -2-羟基环戊基)甲酯)是一种NAE特异性El抑制剂，其通过扰动细胞蛋白质体内平衡破坏科林-环连接酶介导的蛋白质转换，引起人类肿瘤细胞的细胞凋亡性死亡(苏西等人(2009)《自然》(Nature) 458:732-736)。细胞和肿瘤异种移植研究中的MLN4924评估已显示两种不同的作用机制。第一种是通过MLN4924介导的CRLIskp2和CRL4DDB1底物Cdt-1的调节异常来诱导DNA再复制、DNA损伤和细胞死亡(米尔霍林(Milhollen)等人(2011)《癌症研究》(Cancer Res.) 71:3042-3051)。已经显示，P53状态不影响诱导DNA再复制但会使细胞更易于经历细胞凋亡或衰老，这取决于恰当的遗传背景(米尔霍林等人(2011)，同前文献；林(Lin)等人(2010)《自然》464 =374-379和林等人(2010)《癌症研究》70:10310-20)。第二种机制是主要通过CRLl e?GP介导的磷酸化I K B α转换的调节异常来抑制NF- K B依赖性弥漫性大B细胞淋巴瘤中的NF- κ B路径活性(米尔霍林等人(2010)《血液》(Blood) 116:1515-1523)。另外，急性骨髓性白血病(AML)的临床前模型对在细胞系和原始患者胚细胞两者中通过与Cdt-1调节异常、NF-κ B抑制和诱导活性氧物质相关的机制进行的MLN4924抑制是敏感的(索兹(Swords)等人(2010)《血液》115:3796-3800)。
[0035]例如NF2(由阿罗诺维茨(Ahronowitz)等人(2007)《人类突变》(HumanMutat1n) 28:1-2 综述)；KDM6A(由凡.哈福坦(van Haaften)等人(2009)《自然.遗传学》(Nat.Genet.) 41:521-523 综述)、FBXW7、TP53、CDKN2A 和 CDKN2A_pl4 的基因在许多癌症类型中发生突变。SMAD4在多种癌症中突变，但许多SMAD4突变发现于肠癌、胰腺癌(由宫木(Miyaki)和黑木(Kuroki) (2003)《生物化学与生物物理研究通讯》(B1chem.B1phys.Res.Commun.) 306 =799-804 综述)或甲状腺癌中。
[0036]如本文所用，“NF2”是指与基因库寄存编号NM_000268，SEQ ID NO:1(开放阅读框架是SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:1的核苷酸444到2231)相关的编码基因肽寄存编号NP_000259 (SEQ ID NO:3)的基因的较长同功异型物。NF2的其它名称包括ACN、BANF、SCH和梅林蛋白(merlin)(膜突蛋白-埃兹蛋白-根蛋白样蛋白(moesin-ezrin-radixin-likeprotein))。NF2充当肿瘤抑制基因并且可见于22号染色体上。NF2与细胞骨架、细胞表面蛋白相互作用并且可以参与细胞骨架动力学和调节离子转运。NF2的可以涉及对NAE抑制、例如MLN4924的敏感性的功能包括其抑制E3泛素连接酶CRL4DGAF1的能力(李(Li)等人(2010)《细胞》(Cell) 140 =477-490)。NF2突变可以破坏其抑制活性并导致CRL4DGAF1的底物不受控制的泛素化和含有突变基因的细胞的增殖。
[0037]如本文所用， “SMAD4”是指与基因库寄存编号NM_005359，SEQ ID NO:4(开放阅读框架是SEQ ID N0:5, SEQ ID NO:4的核苷酸539到2197)相关的编码基因肽寄存编号NP_005350, SEQ ID NO:6的基因。SMAD4的其它名称包括胰腺癌缺失基因座4 (DPC4)、JIP或母亲抗果蝇DPP同源物4(MAD4)。SMAD4是参与转型生长因子(TGF)_i3信号传导的一种信号转导蛋白。SMAD4可以充当肿瘤抑制基因并且可以靶向它以通过Skp-科林-F盒蛋白(SCF)复合物泛素化进行降解。
[0038]如本文所用，“KDM6A”是指与基因库寄存编号NM_021140，SEQ ID NO:7(开放阅读框架是SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:7的核苷酸376到4581，或SEQ ID NO:9)相关的编码基因肽寄存编号 NP_066963，SEQ ID NO:10 或 SEQ ID NO: 11 (SEQ ID NO: 10 在位置 173 处是V而不是L并且在584处是R而不是L，在位置601处是N而不是S和/或在位置629处是K而不是E)的基因。KDM6A的其它名称包括泛转录的三十四肽重复蛋白X连接或X染色体(UTX)上的泛转录的TPR基因或bA286N14.2。KDM6A是组蛋白脱甲基酶并且可以充当肿瘤抑制基因。
[0039]如本文所用，“FBXW7”是指与基因库寄存编号NM_033632，SEQ ID NO:12(开放阅读框架是SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:12的核苷酸150到2273)相关的编码基因肽寄存编号NP_361014，SEQ ID NO:14的基因。FBXW7的其它名称包括秀丽隐杆线虫sel_10的同源物(SEL10)、群岛同源物(AGO)、F盒蛋白FBX30 (FBX030)或细胞分裂控制蛋白4(CDC4)。FBXW7可以结合到泛素蛋白连接酶复合物中参与蛋白质的磷酸化依赖性泛素化，包括参与细胞周期和存活的蛋白质。FBXW7可以充当肿瘤抑制基因。使用FBXW7作为标记基因可以是器官特异性的，即，其可以是在一些组织中而不是其它组织中出现肿瘤的敏感性标记。举例来说，FBXW7可以是子宫、子宫颈或肝脏的肿瘤的敏感性标记，但不是消化道肿瘤的敏感性标记，其中其它基因突变可以占主导以引起来自那些肿瘤的细胞对MLN4924的不敏感性或抗性。
[0040]如本文所用，“TP53”是指与基因库寄存编号NM_000546，SEQ ID NO:15(开放阅读框架是SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:15的核苷酸203到1384，或一种变异体，其中在位置417处的核苷酸是鸟嘌呤而不是胞嘧啶)相关的编码基因肽寄存编号NP_000537，SEQ IDNO:17或一种变异体(其中在位置72处的氨基酸残基是精氨酸R而不是脯氨酸P)的基因。TP53的其它名称包括BCC7、LFS1和p53。TP53结合DNA并活化转录因子，而且可以充当肿瘤抑制基因。
[0041]如本文所用，“CDKN2A”是指与基因库寄存编号NM_000077，SEQ ID NO:18(开放阅读框架是SEQ ID NO: 19，SEQ ID NO:18的核苷酸307到777)相关的编码基因肽寄存编号NP_000068,SEQ ID NO:20的基因。CDKN2A的其它名称包括交替开放阅读框架(ARF)、pl6、P16ARF、周期素依赖性激酶4的抑制剂(INK4)和多肿瘤抑制基因-1(MTSl)。⑶KN2A的变异体在第一外显子方面有所不同。一种变异体是“⑶KN2A_pl4”或“⑶KN2A.pl4”，也称为P14ARF，是与基因库寄存第号NM_058195，SEQ ID NO:21 (开放阅读框架是SEQ ID NO:22,SEQ ID NO:21 的核苷酸 38 到 559);基因肽 NP_478102，SEQ ID NO:23 或始于 SEQ ID NO:23的氨基酸残基42处的变异体相关。CDKN2A_pl4产生于不同于pl6ARF(pl6INK4a，CDKN2A)的阅读框架的转译。⑶KN2A和⑶KN2A_pl4抑制周期素依赖性激酶4，可以稳定p53并且可以调节细胞周期Gl进展。CDKN2A和CDKN2A_pl4可以充当肿瘤抑制基因。
[0042]如本文所用，“APC”是指腺瘤性结肠息肉病，所述基因与基因库寄存编号NM_000038, SEQ ID NO:24 (开放阅读框架SEQ ID NO:25，或在核苷酸1458处具有胸腺嘧啶而不是胞嘧啶的变异体)相关，编码基因肽寄存编号NP_000029，SEQ ID NO:26。APC的其它名称包括BTSP2和DP2。APC结合微管并抑制Wnt信号传导路径，而且可以充当肿瘤抑制基因。
[0043]对与癌症相关的突变进行公共编目一直受到关注。包括关于与癌症相关的突变的信息的公用数据库的实例是由美国国家生物技术信息中心(马里兰州的贝塞斯达(Bethesda, MD))维护的基因型和表型的数据库(dbGaP)以及由维康信托桑格研究所(Wellcome Trust Sanger Institute)(英国剑桥(Cambridge, UK))维护的癌症体细胞突变目录(COSMIC)数据库。
[0044]提供测定突变状态，例如鉴别血液肿瘤(例如多发性骨髓瘤、白血病、淋巴瘤等)或实体肿瘤(例如黑素瘤、食道癌、肺癌或膀胱癌)中标记基因的突变以预测对治疗的反应，进展时间和治疗之后的存活的组合物和方法。本文中所提供的组合物和方法也可以鉴别实体肿瘤，例如来自结肠癌、乳癌、头颈癌或中枢神经系统癌的标记基因的突变。
[0045]标记是基于展现对MLN4924治疗的敏感性的肿瘤细胞的遗传概况来鉴别的。TP53标记也是基于在TP53基因的缺失方面有所不同的同基因细胞系的行为来鉴别的。所观察到的敏感性可以在通过一种以上方法测试的肿瘤细胞中取得一致。
[0046]除非另外定义，否则本文中所使用的所有技术和科技术语具有本发明本领域的普通技术人员的通常所理解的含义。一般来讲，本文中所述的与分子生物学以及蛋白质和寡核苷酸或聚核苷酸化学和杂交结合使用的命名法以及其细胞与组织培养技术是本领域中已知的那些。基因库或基因肽寄存编号和有用的核酸和肽序列可见于由马里兰州贝塞斯达的美国国家生物技术信息中心维护的网站。贯穿本申请案(包括表格)所引用的所有数据库寄存记录(例如来自昂飞HG133注释文件(Affymetrix HG133annotat1n files)、英特兹(Entrez)、基因库、RefSeq、COSMIC)的内容在此以引用的方式并入本文中。使用标准技术进行重组DNA、寡核苷酸合成、蛋白质纯化、组织培养和转型以及转染(例如电穿孔、脂质体转染等)。酶促反应是根据制造商的说明书或如此项技术中通常所实现或如本文中所述来进行。以上技术和程序一般可根据本领域中已知的方法，例如如贯穿本发明说明书所引用并论述的各个一般性和较特定的参考文献中所述来进行。参见例如萨姆布鲁克(Samtoook)等人(2000)《分子克隆实验手册》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)(第 3版，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press),冷泉港,纽约)或哈洛(Harlow)，E.和莱恩(Lane)，D.(1988)《抗体实验手册》(Antibodies:A LaboratoryManual)(冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约)。本文中所述的与分析化学、合成有机化学和药物与医药化学结合使用的命名法以及其实验室程序和技术是本领域中已知的。标准技术用于化学合成、化学分析、医药制备、调配和传递以及治疗患者。此外，除非另外为情形所需，否则单数术语应包括复数并且复数术语应包括单数。倘若有冲突，那么将以本说明书(包括定义)为主。
[0047]本文中使用冠词“一 (a/an) ”和“至少一个”来指所述冠词的一个或一个以上语法宾语。举例来说，“一个要素”意指一个或一个以上要素、至少一个要素。倘若有冲突，那么将以本说明书(包括定义)为主。
[0048]如本文所用，“有利”结果或预后是指长期存活、长进展时间(TTP)和/或良好反应。反之，“不利”预后是指短期存活、短进展时间(TTP)和/或不良反应。
[0049]如本文所用的“标记”包括与标记基因相关的材料，所述标记基因已经被鉴别为具有患者肿瘤细胞的突变并且此外，所述突变是患者用例如NAE抑制剂、例如1-取代的氨基磺酸甲酯治疗的结果是有利或不利的表征。标记的实例包括材料，例如染色体基因座、基因的DNA、基因的RNA或基因的蛋白质。举例来说，标记包括标记基因材料，例如展示指示短期存活患者的特征(例如大小、序列、组成或量)的染色体基因座、DNA、RNA或蛋白质；或者标记包括标记基因材料，例如展示指示长期存活患者的突变或特征(例如大小、序列、组成或量)的染色体基因座、DNA、RNA或蛋白质。在另一实例中，标记包括标记基因材料，例如染色体基因座、DNA、RNA或蛋白质,其突变或特征(例如大小、序列、组成或量)指示患者具有不良的治疗反应；或者标记包括标记基因材料，例如染色体基因座、DNA> RNA或蛋白质,其突变或特征(例如大小、序列、组成或量)指示患者具有良好反应。在另一实例中，标记包括标记基因材料，例如染色体基因座、DNA、RNA或蛋白质，其突变或特征(例如大小、序列、组成或量)指示患者的疾病在治疗之后具有短进展时间(TTP);或者标记包括标记基因材料，例如染色体基因座、DNA、RNA或蛋白质，其突变或特征(例如大小、序列、组成或量)指示患者的疾病具有长TTP。在又另一实例中,标记包括标记基因材料,例如染色体基因座、DNA、RNA或蛋白质,其突变或特征(例如大小、序列、组成或量)指示患者的疾病在治疗之后具有短期存活；或者标记包括标记基因材料，例如染色体基因座、DNA、RNA或蛋白质，其突变或特征(例如大小、序列、组成或量)指示患者的疾病具有长期存活。因此，如本文所用，标记是打算包括这些可能性中的每一个，并且可以进一步包括每个单一标记单独地作为标记；或者当提及“标记”或“标记组”时可共同地包括一或多个或所有特征。
[0050]适用于测量以确定预后或治疗或疾病管理策略的染色体基因座标记选自由以下组成的群组:染色体22ql2.2(NF2)，例如从碱基对29999545到30094589 ;染色体18q21.1-21.2(SMAD4)，例如从碱基对 48556583 到 48611412 ;染色体 Xpll.2 (KDM6A)，例如从碱基对44732423到44971847 ;染色体4q31.3 (FBXW7)，例如从碱基对153242410到153456172 ;染色体 17pl3.1 (TP53)，例如从碱基对 7571720 到 7590868 ;以及 9p21 (CDKN2A和⑶KN2A_pl4)，例如从碱基对21967751到21994490。染色体基因座编号是基于NCBI基因数据库中的参考人类基因组Build37.3(从2011年10月5日至今)。标记DNA、标记RNA或标记蛋白质可以对应于染色体基因座标记上的碱基对。举例来说，标记DNA可以包括来自染色体基因座标记的基因组DNA，标记RNA可以包括从基因座标记转录的聚核苷酸，并且标记蛋白质可以包括由样品，例如包含肿瘤细胞的样品中的染色体基因座标记处表达产生的多肽。
[0051]“标记核酸”是一种由本发明的标记基因编码或对应于本发明的标记基因的核酸(例如基因组DNA、mRNA、cDNA)。这些标记核酸包括DNA，例如基因组DNA的有义和反义链(例如包括本文中出现的任何内含子)，包含完整或部分序列，例如基因组DNA的外显子中的一者或多者，最多并包括任何标记基因的开放阅读框架或此类序列的互补序列。标记核酸也包括包含任何标记的完整或部分序列或此类序列的互补序列的RNA，其中所有胸苷残基被尿苷残基置换，RNA通过基因组DNA的转录产生(即在剪接之前)，RNA通过剪接从基因组DNA转录的RNA产生，并且蛋白质通过转译所剪接的RNA产生(即包括在通常裂解区域(例如跨膜信号序列)的裂解之前和之后的两种蛋白质)。如本文所用，“标记核酸”还可以包括通过反转录RNA (包括剪接RNA)制得的cDNA，所述RNA是通过转录基因组DNA产生的。标记核酸还包括此类序列，其由于遗传代码的简并而不同于某些核酸的核苷酸序列，所述核酸编码对应于本发明的标记(例如突变标记)的蛋白质，并因此编码相同蛋白质，例如突变蛋白。如本文所用，短语“等位变异体”是指出现在指定基因座或通过核苷酸序列编码的多肽的核苷酸序列。这些天然产生的等位变异通常会在指定基因的核苷酸序列中引起1-5%变化。交互等位基因可以通过对多个不同个体中，例如不患有癌症的个体的细胞中，例如生殖系细胞中的相关基因进行测序来鉴别。此测序可以通过使用杂交探针容易地进行，从而鉴别各种个体中的相同遗传基因座。任何和所有这些核苷酸变异和所得氨基酸多形现象或变异(这是天然产生的等位变异的结果并且不改变野生型标记基因的功能活性)的检测打算属于本文所述标记的野生型形式的范围内。“标记蛋白”是一种通过本发明的标记(例如突变体核酸)编码或与此对应的蛋白质。术语“蛋白质”和“多肽”可互换地使用。标记的蛋白质可以特定地通过其名称或氨基酸序列来提及，但本领域的普通技术人员应了解，突变、缺失和/或转译后修饰会影响蛋白质结构、外观、细胞定位和/或行为。除非另外规定，否则这些差异在本文中不进行区分，并且本文所述的标记打算包括任何或所有此类变种。
[0052]如本文所用，“标记基因”是指可以具有突变以使得其DNA、RNA和/或蛋白质具有能在治疗之后提供关于预后的信息(即“提供信息的”)的特征(例如大小、序列、组成或量)的基因。本文中联系NAE抑制剂、例如1-取代的氨基磺酸甲酯(例如MLN4924)治疗之后的结果描述的标记基因是上文所述的染色体基因座标记内的基因的实例并且提供在表1中。对应于标记基因的mRNA的序列、开放阅读框架和蛋白质也列举在表1中。表1中所列举的标记基因可以具有同功异型物，其或者普遍存在或者表达受限。除了 CDKN2A_pl4同功异型物的独立清单之外，表1中的DNA SEQ ID NO是指编码主要或最长同功异型物的mRNA并且蛋白质SEQ ID NO至少表示此类同功异型物的前体并且不一定是成熟蛋白质。这些序列并不打算限制与所述同功异型物或前体的标记基因一致性。通过检查在英特兹基因(由马里兰州贝塞斯达的美国国家生物技术信息中心维护的数据库)下所提供，通过表1中列举的ID编号鉴别的信息，本领域的普通技术人员可容易地获取并理解附加同功异型物和成熟蛋白质。
[0053]表1关于NAE抑制剂治疗的标记基因描述
[0054]
【权利要求】
1.一种用于确定是否用NEDD8活化酶NAE抑制剂治疗患者的方法，其包含: a)测量包含肿瘤细胞的患者样品中与至少一个标记基因相关的至少一个标记的至少一个特征； b)鉴别在步骤a)中所测量的所述至少一个特征是否提供关于在用所述NAE抑制剂治疗之后的结果的信息；以及 c)如果所述提供信息的特征表明所述肿瘤细胞包含至少一个其突变状态表明NAE抑制疗法的有利结果的标记基因，那么确定用NAE抑制剂治疗所述患者， 其中所述至少一个标记基因是与科林-环连接酶的活性具有相关性的肿瘤抑制基因。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一个特征选自由大小、序列、组成和量组成的群组。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一个标记基因的所述突变状态是突变体。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一个标记基因选自由NF2、SMAD4、KDM6A和FBXW7组成的群组。
5.根据权利要求1所述的方法，其中在所述至少一个标记基因中的突变是失活性突变。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述至少一个标记基因选自由NF2、SMAD4和KDM6A组成的群组。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一个标记选自由对应于所述至少一个标记基因的核酸和蛋白质组成的群组。
8.根据权利要求1所述的方法,其中所述患者样品包含血液肿瘤细胞。
9.根据权利要求1所述的方法,其中所述患者样品包含实体肿瘤细胞。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一个标记是至少两个标记。
11.根据权利要求2所述的方法，其中所述至少一个特征是至少一个标记的序列。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述至少一个标记是核酸。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述核酸选自由DNA、mRNA和cDNA或上述中的任一者的任何部分组成的群组，其中所述部分对应于所述至少一个标记基因的至少一个突变位点。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述NAE抑制剂是氨基磺酸((1S，2S，4R) -4- {4- [ (IS) -2，3- 二氢-1H-茚-1-基氨基]-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-基} -2-羟基环戍基)甲基酷。
15.一种用于确定是否继续患者癌症的NAE抑制剂治疗的方法，其包含: a)获得来自患者的包含肿瘤细胞的第一生物样品和来自所述患者的包含肿瘤细胞的第二生物样品，其中所述第一样品是在所述第二样品之前获得并且在所述第二样品之前用NAE抑制剂治疗所述患者； b)测量所述两个样品中至少一个标记的至少一个特征； c)比较b)中所述测量的结果；以及 d)如果所述比较表明在所述第二样品中的所述肿瘤细胞包含至少一个其突变状态表明有利结果的标记基因，那么确定继续用所述NAE抑制剂治疗，其中所述至少一个标记基因是与科林-环连接酶的活性具有相关性的肿瘤抑制基因。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述至少一个特征选自由大小、序列、组成和量组成的群组。
17.根据权利要求15所述的方法，其中所述至少一个标记基因的所述突变状态是突变体。
18.根据权利要求15所述的方法，其中所述至少一个标记基因选自由NF2、SMAD4、KDM6A和FBXW7组成的群组。
19.根据权利要求15所述的方法，其中所述至少一个标记选自由对应于所述至少一个标记基因的核酸和蛋白质组成的群组。
20.根据权利要求15所述的方法，其中所述患者样品包含血液肿瘤细胞。
21.根据权利要求15所述的方法，其中所述患者样品包含实体肿瘤细胞。
22.根据权利要求15所述的方法，其中所述至少一个标记是至少两个标记。
23.根据权利要求16所述的方法，其中所述至少一个特征是至少一个标记的序列。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述至少一个标记是核酸。
25.根据权利要求24所 述的方法，其中所述核酸选自由DNA、mRNA和cDNA或上述中的任一者的任何部分组成的群组，其中所述部分对应于所述至少一个标记基因的至少一个突变位点。
26.根据权利要求15所述的方法，其中所述NAE抑制剂是氨基磺酸((1S，2S，4R) -4- {4- [ (IS) -2，3- 二氢-1H-茚-1-基氨基]-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-基} -2-羟基环戍基)甲基酷。
27.—种试剂盒，其包含用于测量患者样品中的至少一个标记的至少一个特征的试剂，其中对应于至少一个标记基因的所述至少一个标记是与科林-环连接酶的活性具有相关性的肿瘤抑制基因。
28.根据权利要求27所述的试剂盒，其中所述至少一个特征选自由大小、序列、组成和量组成的群组。
29.根据权利要求27所述的试剂盒，其中所述至少一个标记选自由与所述至少一个标记基因相关的核酸和蛋白质组成的群组。
30.根据权利要求27所述的试剂盒，其中所述至少一个标记基因选自由NF2、SMAD4、KDM6A和FBXW7组成的群组。
31.根据权利要求27所述的试剂盒，其进一步包含用于添加到所述样品中的稳定剂。
32.根据权利要求29所述的试剂盒，其中所述至少一个标记是核酸并且所述试剂是至少一个引物。
33.根据权利要求32所述的试剂盒，其中所述至少一个引物与选自由以下组成的群组的核酸序列杂交:SEQ ID NO:1、2、4、5、7、8、9、12、13，在从碱基对 29999545 到 30094589 的染色体22q上的序列、在从碱基对48556583到48611412的染色体18q上的序列、在从碱基对44732423到44971847的染色体Xp上的序列、在从碱基对153242410到153456172的染色体4q上的序列，以及上述中的任一者的互补序列。
34.根据权利要求32所述的试剂盒，其进一步包含第二引物。
35.根据权利要求32所述的试剂盒，其进一步包含探针。
36.根据权利要求8所述的方法，其中包含血液肿瘤细胞的所述患者样品是血液。
37.根据权利要求36所述的方法，其进一步包含针对肿瘤细胞浓缩所述患者样品。
38.一种用于鉴别作为NAE抑制剂之化合物的方法，其包含: a)使包含至少一个标记基因的细胞与测试化合物接触；以及 b)测定所述测试化合物对所述细胞的生长或活力的作用， 其中所述至少一个标记基因是肿瘤抑制基因，其突变状态与用NAE抑制剂治疗的结果相关并且与科林-环连接酶的活性具有相关性， 并且其中如果 所述测试化合物降低所述细胞的所述生长或活力，那么所述测试化合物是NAE抑制剂。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述至少一个标记基因的所述突变状态是突变体。
40.一种用于支付用NAE抑制剂治疗癌症的方法，其包含: a)记录包含肿瘤细胞的患者样品中至少一个标记基因的突变状态，以及 b)如果所述突变状态表明有利结果，那么授权支付所述NAE抑制剂治疗。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述至少一个标记基因的所述突变状态是突变体。
42.根据权利要求40所述的方法，其中所述至少一个标记基因选自由NF2、SMAD4、KDM6A和FBXW7组成的群组。
【文档编号】G01N33/50GK104080926SQ201280065180
【公开日】2014年10月1日 申请日期:2012年10月26日 优先权日:2011年10月28日
【发明者】斯蒂芬·J·布莱克莫尔, 斌·李, 乔治·J·马利根, 马修·C·舒, 彼得·G·史密斯 申请人:米伦纽姆医药公司