一种前列腺肿瘤标志物的多元悬浮芯片检测方法
【专利摘要】本发明涉及一种多前列腺肿瘤标志物的高通量悬浮芯片检测方法。前列腺肿瘤是男性最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率都名列前茅。单一的肿瘤标志物在检测过程中存在漏诊和误诊的不足，多种前列腺肿瘤肿瘤标志物的同时检测不仅有利于前列腺肿瘤的早期诊断，而且在前列腺肿瘤的发生、发展与转移的检测、治疗效果监测以及预后判断等方面均具有很高的价值。本方法将间接竞争免疫分析与悬浮芯片技术进行结合，将抗原(肿瘤标志物)固定在微球上，建立针对血清中前列腺肿瘤标志物的新型的悬浮芯片检测技术，实现对患者生物样品中前列腺肿瘤标志物的快速、特异、准确和高效的定量检测，为临床多种肿瘤标志物快速检测分析提供了新方法和思路。
【专利说明】一种前列腺肿瘤标志物的多元悬浮芯片检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种前列腺肿瘤标志物的多元悬浮芯片检测方法，所述的前列腺肿瘤标志物包括:前列腺特异性抗原(Prostate-specific antigen, PSA)、前列性干细胞抗原(Prostate stem cell antigen, PSCA)、前列腺特异性膜抗原(Prostate-specificmembrane antigen, PSMA)和喊性憐酸酶(Prostatic acid phosphatase, PAP)。
【背景技术】
[0002]近年来，全球范围内肿瘤发病率呈逐年上升趋势，恶性肿瘤的发病率成为仅次于心脑血管疾病外的人类第二大死亡原因。在恶性肿瘤中，前列腺肿瘤是男性最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率在恶性肿瘤中都名列前茅。前列腺肿瘤在许多西方国家中是男性最常见的恶性肿瘤，其占男性肿瘤死亡的第二位。在我国，随着环境污染的日益加剧以及饮食结构方面的改变，前列腺肿瘤的发病率也在不断增加，并且已在我国男性泌尿生殖系统恶性肿瘤中跃居第三位，但随着诊断技术的不断提高，以及前列腺肿瘤诊断方法的不断改进，前列腺肿瘤能够得以早期发现并展开治疗。
[0003]肿瘤标志物是肿瘤细胞自身合成、释放，或机体对肿瘤细胞反应而产生的特定的一类物质，可反映细胞各阶段表型及基因特性，在肿瘤的普查、诊断、判断预后、转归以及评价疗效等方面具有很强的实用价值。在临床上，已成为肿瘤患者的重要检查指标，在临床医学中得到了广泛应用。肿瘤标志物的使用降低了筛查人群的死亡率，可以改善预后，降低治疗费用，减少根治法使用率。前列腺肿瘤标志物的检测不仅有助于前列腺肿瘤的早期诊断，而且对前列腺肿瘤的发生、发展与转移，监测治疗效果以及判断预后等方面均有很高的临床应用价值。由于单一的肿瘤标志物在检测的过程中存在特异性不强，准确性不高等缺点，因此，在实际临床应用中常采用针对同一肿瘤的多种肿瘤标志物进行联合检测，应用多变量同时进行相应的检测，提高其检测准确度。
[0004]PSA是目前诊断前列腺肿瘤常用的敏感指标之一，可用于前列腺肿瘤的早期诊断、监测治疗及预测复发。它主要由前列腺上皮细胞分泌，具有极高的组织器官特异性；PSMA是一种含有750个氨基酸的相对分子质量为IO5的II型跨膜糖蛋白，特异地表达于前列腺上皮，在前列腺外组织只有少量表达，在90%以上的原发和继发前列腺肿瘤患者中，血清中PSMA的水平上升；PSCA是新近发现的前列腺肿瘤标志物，它是前列腺特异表达的糖化磷脂酰肌醇，也是锚定的细胞膜表面抗原，比PSA更敏感、特异性更高的前列腺肿瘤肿瘤标志物，可在患者血液中高表达，是前列腺肿瘤分子分级最有希望的检测标志物，PSCA表达升高与前列腺肿瘤的相关性可达48% -94%；PAP为前列腺分泌的酶，正常时PAP很少进入血液，患前列腺肿瘤时，恶性细胞产生PAP而进入血液，常用于预测肿瘤的转移。
[0005]目前前列腺肿瘤标志物的检测方法包括生物化学、免疫学及分子生物学等，但最常应用的是免疫学方法。近年来，基于抗原抗体反应的免疫分析方法不断成熟，肿瘤标志物的免疫学测定方法也得到逐步完善。多种前列腺肿瘤标志物的联合检测对于肿瘤的确诊、病情的发生发展、预后恢复和复发监测具有重要意义。悬浮芯片技术是基于多元荧光编码微球而发展起来的一种高通量同步快速检测技术，在保持高通量检测的同时，将固相-悬浮的反应体系发展到完全接近人体内部环境的完成悬浮反应体系，这样既有利于保持生物样品的三维活性结构，又有利于检测的准确度；在进行多样本的同时快速定量分析检测的同时，血清或者其他生物样品的检测，最低只需要μ L到数十μ L数量级的量就可以进行检测；工作区间跨度可达2-5个数量级，灵敏度达到pg级；短时间内可完成上万个分析数据的处理；检测项目灵活，可针对多达100个不同样品的多种不同组合进行同时检测。
[0006]目前发展起来的悬浮芯片技术主要用于实验室检测方法的建立和方法评价及优化，但针对临床上患者的各种生物样本中的多种前列腺肿瘤标志物还未有报道；因此，建立一种快速、灵敏、多元的检测方法，可弥补现有临床检验方法的不足。本发明方法可将悬浮芯片技术应用到肿瘤筛查、临床肿瘤的辅助诊断及预后判断等方面，使临床医生和患者全面了解机体健康状况，有助于肿瘤的早期发现，为临床提供早期诊断、治疗的依据，并将创造良好的社会效益和经济效益。
【发明内容】
[0007]因此，本发明的目的是提供一种前列腺肿瘤标志物的多元悬浮芯片检测方法，是克服现有临床检验中多种前列腺肿瘤标志物检测工作量大、费时费力、成本较高的缺陷。根据本发明的一种对四种前列腺肿瘤标志物PSA、PSCA、PSMA和PAP进行多元检测的悬浮芯片技术方法，包括以下步骤:
[0008](I)四种前列腺肿瘤肿瘤标志物悬浮芯片检测微球的制备
[0009]先将四种荧光微球用偶联试剂1-(3- 二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基硫代琥珀酰亚胺分别活化，然后将四种前列腺肿瘤标志物PSA、PSCA、PSMA和PAP通过氨基化反应分别偶联于所述四种活化的荧光微球上，制成四种前列腺肿瘤标志物的荧光探针微球；
[0010](2)悬浮芯片检测条件优化
[0011]对悬浮芯片检测条件进行全面的优化，包括:反应缓冲液的选择(PBS/PBS-TB/PBS-TBN-人血清)、最佳抗原抗体反应时间(I?2h)、偶联抗原量(6-15 μ g)、抗体加入量(2?6ng)、突光报告分子-链霉亲和素-藻红蛋白(Strepavidin-phycoerythrin, SA-PE)的稀释比例(I: 10(Tl: 800)和作用时间(5?45min)等反应条件。经过优化，该发明摒弃了常规悬浮芯片检测技术步骤繁琐、实验耗时长的不足，基本达到抗原抗体的完全反应，在实验中无需常规悬浮芯片实验所必需的昂贵的滤膜板和抽滤泵，仅需普通96孔细胞培养板或酶标板即可，也无需进行多次反复抽滤的步骤，因此，本发明提供的技术方法，操作简单、快捷；可显著提高检测中位突光强度值(mean-fluorescent intensity,MFI),使结果获得稳定可靠；同时显著降低了检测成本；
[0012](3)四种前列腺肿瘤肿瘤标志物的悬浮芯片多元检测方法的建立
[0013]在步骤⑵对悬浮芯片检测条件进行全面的优化后的基础上，将四种前列腺肿瘤标志物的单克隆抗体等比例进行混合；取96孔酶标板，在反应孔中，加入混合抗体，保证每种抗体2?6ng，并同时设定相应的阴性对照孔和重复孔，用配置好的标准品稀释液将PSA、PSCA、PSMA、PAP抗原稀释成不同的浓度梯度，并等比例混合；将步骤(I)所获得的多种微球探针等比例混合，微球数量1800?2300/孔，用稀释缓冲液补足50 μ L/孔，检测酶标板漩涡中速振荡I?2h，然后每孔加入稀释好的SA-PE50y L，中速反应5?45min，悬浮芯片读取100个荧光微球，获得MFI，以减去本底值所获得的MFI值与阳性对照孔MFI的比值(即荧光信号强度比值)为Y轴，以标志物的浓度为X轴，作出前列腺肿瘤标志物的悬浮芯片多元标准回归曲线方程；从而建立前列腺肿瘤肿瘤标志物的多元检测方法；
[0014](4)实际血清样品的检测
[0015]采集患者实际血液样品后，加入抗凝剂并离心后储存于4°C待用；检测步骤同步骤(3)，由获得荧光信号强度比值代入标准曲线方程中，推算出对应的前列腺肿瘤标志物的具体浓度。
[0016]通过本发明的多前列腺肿瘤标志物的高通量悬浮芯片联合检测方法，实现了同时对多种前列腺肿瘤标志物的高通量多元检测，可初步用于对实际样品中前列腺肿瘤标志物的高通量分析，检测灵敏、特异、快速和高效，为多种前列腺肿瘤标志物的快速检测提供了新方法，可应用到肿瘤筛查、临床肿瘤的辅助诊断及预后判断等方面，使临床医生和患者全面了解机体健康状况，有助于肿瘤的早期发现，为临床提供早期诊断、治疗的依据，并将创造良好的社会效益和经济效益。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1为四种前列腺肿瘤肿瘤标志物的悬浮芯片多元检测标准曲线【具体实施方式】
[0018]下面结合具体实施例对本方法进行进一步阐述，应理解，这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲述的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
[0019]1.实验材料
[0020]PSMA(ab97421)和 PSMA 单克隆抗体(abl9071):英国 Abcam 公司
[0021]PSA、PSA 抗体 IgGlM701041、PAP10-P45A、PAP 抗体 10-P45B M01010922:美国Fitzgerald 公司
[0022]PSCA和PSCA单克隆抗体:康威世纪有限公司，北京
[0023]羧基化微球:美国Luminex公司
[0024]Bio-Plex?氨基偶联试剂盒:美国Bio-Rad公司
[0025]1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基硫代琥珀酰亚胺:美国SIGMA公司
[0026]SA-PE:美国 Pierce 公司
[0027]2.四种前列腺肿瘤肿瘤标志物悬浮芯片检测微球的制备
[0028]先将四种荧光微球用偶联试剂1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基硫代琥珀酰亚胺分别活化，然后将四种前列腺肿瘤标志物:前列腺特异性抗原(Prostate-specific antigen, PSA)、前列性干细胞抗原(Prostate stem cell antigen,PSCA)、前列腺特异性膜抗原(Prostate-specific membrane antigen, PSMA)和喊性憐酸酶(Prostatic acid phosphatase, PAP)通过氨基化反应分别偶联于所述四种活化的突光微球上，制成四种前列腺肿瘤标志物的荧光探针微球；
[0029]3.悬浮芯片检测条件优化
[0030]对悬浮芯片检测条件进行全面的优化，包括:反应缓冲液的选择(PBS/PBS-TB/PBS-TBN-人血清)、最佳抗原抗体反应时间(I~2h)、偶联抗原量(6-15 μ g)、抗体加入量(2~6ng)、荧光报告分子SA-PE的稀释比例(I: 100~I: 800)和作用时间(5~45min)等反应条件；
[0031]4.四种前列腺肿瘤肿瘤标志物的悬浮芯片多元检测方法的建立
[0032]在步骤⑵对悬浮芯片检测条件进行全面的优化后的基础上，将四种前列腺肿瘤标志物的单克隆抗体等比例进行混合；取96孔酶标板，在反应孔中，加入混合抗体，保证每种抗体2~6ng，并同时设定相应的阴性对照孔和重复孔，用配置好的标准品稀释液将PSA、PSCA、PSMA、PAP抗原稀释成不同的浓度梯度，并等比例混合；将步骤(1)所获得的多种微球探针等比例混合，微球数量1800~2300/孔，用稀释缓冲液补足50 μ L/孔，检测酶标板漩涡中速振荡I~2h，然后每孔加入稀释好的SA-PE50y L，中速反应5~45min，悬浮芯片读取100个荧光微球，获得MFI，以减去本底值所获得的MFI值与阳性对照孔MFItl的比值(即荧光信号强度比值)为Y轴，以标志物的浓度为X轴，作出前列腺肿瘤标志物的悬浮芯片多元标准回归曲线方程(如表1所示)；从而建立四种前列腺肿瘤肿瘤标志物的多元检测方法;
[0033]表1四种前列腺肿瘤标志物的悬浮芯片多元检测标准方程及参数
[0034]
【权利要求】
1.一种前列腺肿瘤标志物的多元悬浮芯片检测方法，其特征包括如下步骤: (1)四种前列腺肿瘤肿瘤标志物悬浮芯片检测微球的制备； (2)悬浮芯片检测条件优化； (3)四种前列腺肿瘤肿瘤标志物的悬浮芯片多元检测方法的建立； (4)实际血清样品的检测； 其中，所述的悬浮芯片检测微球为直径5.6μπι的、分别包被了四种前列腺肿瘤肿瘤标志物的聚苯乙烯荧光编码微球。
2.根据权利要求1所述的一种前列腺肿瘤标志物的多元悬浮芯片检测方法，其特征是所述步骤(I)为:先将四种荧光微球用偶联试剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基硫代琥珀酰亚胺分别活化，然后将四种前列腺肿瘤标志物:前列腺特异性抗原(Prostate-specific antigen, PSA)、前列性干细胞抗原(Prostate stem cellantigen, PSCA)、前列腺特异性膜抗原(Prostate-specific membrane antigen, PSMA)和喊性磷酸酶(Prostatic acid phosphatase, PAP)通过氨基化反应分别偶联于所述四种活化的突光微球上，制成四种前列腺肿瘤标志物的突光探针微球。
3.根据权利要求1所述的一种前列腺肿瘤标志物的多元悬浮芯片检测方法，其特征是所述步骤(2)为:对悬浮芯片检测条件进行全面的优化，包括:反应缓冲液的选择(PBS/PBS-TB/PBS-TBN-人血清)、最佳抗原抗体反应时间(I?2h)、偶联抗原量(6_15 μ g)、抗体加入量(2?6ng)、突光报告分子-链霉亲和素-藻红蛋白(Strepavidin-phycoerythrin,SA-ΡΕ)的稀释比例(1: 100?1: 800)和作用时间(5?45min)等反应条件；经过优化，该发明摒弃了常规悬浮芯片检测技术步骤繁琐、实验耗时长的不足，基本达到抗原抗体的完全反应，在实验中无需常规悬浮芯片实验所必需的昂贵的滤膜板和抽滤泵，仅需普通96孔细胞培养板或酶标板即可，也无需进行多次反复抽滤的步骤，因此，本发明提供的技术方法，操作简单、快捷；可显著提高检测中位突光强度值(mean-fluorescent intensity,MFI)，使结果获得稳定可靠；同时显著降低了检测成本。
4.根据权利要求1所述的一种前列腺肿瘤标志物的多元悬浮芯片检测方法，其特征是所述步骤(3)为:在步骤(2)对悬浮芯片检测条件进行全面的优化后的基础上，将四种前列腺肿瘤标志物的单克隆抗体等比例进行混合；取96孔酶标板，在反应孔中，加入混合抗体，保证每种抗体2?6ng，并同时设定相应的阴性对照孔和重复孔，用配置好的标准品稀释液将PSA、PSCA、PSMA、PAP抗原稀释成不同的浓度梯度，并等比例混合；将步骤(I)所获得的多种微球探针等比例混合，微球数量1800?2300/孔，用稀释缓冲液补足50 μ L/孔，检测酶标板漩涡中速振荡I?2h，然后每孔加入稀释好的SA-PE50y L，中速反应5?45min，悬浮芯片读取100个荧光微球，获得MFI，以减去本底值所获得的MFI值与阳性对照孔MFI的比值(即荧光信号强度比值)为Y轴，以标志物的浓度为X轴，作出前列腺肿瘤标志物的悬浮芯片多元标准回归曲线方程；从而建立四种前列腺肿瘤肿瘤标志物的多元检测方法。
5.根据权利要求1所述的一种前列腺肿瘤标志物的多元悬浮芯片检测方法，其特征是所述步骤(4)为:采集患者实际血液样品后，加入抗凝剂并离心后储存于4°C待用；检测步骤同步骤(3)，由获得的获得荧光信号强度比值代入标准曲线方程中，推算出对应的前列腺肿瘤标志物的具体浓度。
【文档编号】G01N33/577GK103926407SQ201310013495
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2013年1月15日 优先权日:2013年1月15日
【发明者】刘楠, 高志贤, 马新华, 李晓丽, 欧国荣 申请人:中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所