专利名称：一种基于还原氧化石墨烯-纳米金复合材料的金黄色葡萄球菌无标记电化学适配体传感器的制作方法
一种基于还原氧化石墨烯-纳米金复合材料的金黄色葡萄 球菌无标记电化学适配体传感器技术领域
本发明主要利用适配体传感器对金黄色葡萄球菌进行电化学检测，属于电化学领 域。特点在于由还原氧化石墨烯-纳米金复合材料的引入扩大了检测信号，提升检测灵敏 度。同时在超灵敏电化学阻抗检测中无需引入标记物，使得检测时间更短，耗费也更少。同 时也为金黄色葡萄球菌全菌的检测提供一种新的方法。
背景技术：
金黄色葡萄球菌是革兰氏阳性菌，隶属于葡萄球菌属，是葡萄球均属中最重要的 病原菌之一。金黄色葡萄球菌是一种强致病菌，侵袭人体后可引起化脓性感染，并且还可以 通过分泌肠毒素造成急性肠炎，表现为呕吐、腹泻等。由于金黄色葡萄球可在有氧或无氧的 环境中生长、高度耐盐、并且对温度(7 38. 5°C最适温度37°C )和PH(4. 2 9. 3最适PH 为7. 4)的要求很低，因此它能广泛存在于食品当中，造成严重的食品安全问题。另外金黄 色葡萄球菌也是人和动物化脓性感染最常见的病原菌，由于近年来抗生素的广泛使用，导 致耐药性菌株迅速增多，金黄色葡萄球菌也成为医院感染最常见的致病菌，因此金黄色葡 萄球菌也被列为仅次于大肠杆菌的重要病原菌，金黄色葡萄球菌污染也属于世界性的卫生 问题。
传统的金黄色葡萄球菌检测方法用国标法，这是我国规定的食品中金黄色葡萄球 菌的标准检测方法，其原理主要基于细菌的培养分离，通过接种、预增菌、平板划线培养、然 后对平板上的可见菌落进行计数。此法不仅耗时(3 6天)灵敏度也很低，很难满足现今 快速评价食品中微生物安全性的要求。为此迫切需要扩展金黄色葡萄球菌的检测，尤其是 建立更加灵敏快速的检测方法。近年来金黄色葡萄球菌的快速检测工作不断取得进展，基 于抗原抗体的免疫学方法酶联免疫技术(ELISA)、PCR、环介导等温扩增技术等都可以实现 对金黄色葡萄球菌的快速检测，但是这些方法检测的目标物质多为金黄色葡萄球菌分泌的 肠毒素或者某一段基因片段等，直接针对整体菌的检测方法相对较少。
适配体传感器由于其快速、高灵敏、高特异性和造价低廉等优点在生物诊断、环境 监测和食品安全方面发挥着越来越重要的作用。核酸适配体是经指数富集配体系统进化 (SELEX)技术筛选出来的能够特异性结合蛋白质、核酸、金属离子等小分子物质和病原菌等 生物大分子的一段单链DNA或者RNA片段。由于适配体可以I)与目标物质的特异性结合 具有高度亲和力和严格识别性；2)能够在体外合成，并且能在不影响其生物活性的基础上 根据需要修饰不同的功能集团。并且适配体可反复变性复性、易于保存、造价低廉，这些优 点确保适配体用于生物传感器相比于传统纳米材料具有更高的灵敏度和更短的耗时。发明内容
本发明通过引入金黄色葡萄球菌全菌适配体捕获探针，利用超灵敏电化学阻抗技 术，根据适配体结合金黄色葡萄球菌前后阻抗值得变化实现定量检测。同时引入了 ssDNA连接的还原氧化石墨烯-纳米金复合纳米材料，提高电子传输和比表面积，扩大检测信号， 提升了检测的灵敏度。本发明所构建的适配体传感器特异性高，灵敏度好、耗时短、造价低廉。当捕获探针结合有金黄色葡萄球菌有，会降低电极表面电子传输，响应电流也随之减弱，电化学阻抗值下降。以此现象对金黄色葡萄球菌标准品进行检测，建立标准曲线，以达到对含有金黄色葡萄球菌样品进行定量检测的目的。
为了实现本发明的目的，本发明采用以下技术方案
(I)裸电极依次用粒径为ΙμπκΟ. 3μπι、0. 05μπι的氧化铝粉末在麂皮上各打磨 8min，每次换不同粒径氧化铝粉末前都用超纯水将麂皮和电极上的残余粉浆冲洗干净。然后分别用超纯水、无水乙醇、超纯水分别超声5min，电极用氮气极吹干备用。
(2)裸玻碳电极的测试称取3. 73gKCl及O. 082gK3Fe (CN)6溶于50mL容量瓶中， 配成5mMFe(CN)63_和lmol/L KCl溶液；打磨清洗好的电极为工作电极，银/氯化银为参比电极，钼丝为对电极组成三电极体系进行循环伏安测试，工作电压为-O. 2 O. 6V，扫速为 100mV/S，直到得到峰形稳定、形状良好、峰与峰差值小于65mV的循环伏安图。
(3)合成巯基化金黄色葡萄球菌适配体序列为5' -HS-(CH2)6-GCA ATG GTA CGG TAC TTC CTC GGC ACG TTC TCA GTA GCG CTC GCT GGT CAT CCC ACA GCT ACG TCA AM GTG CAC GCT ACT TTG CTA A-3' (上海生工生物工程股份有限公司完成)。
(4)电极修饰取10 μ L的ssDNA溶于ImL的lmg/mL氧化石墨烯中，超声30min, 用移液枪吸取5μ L混合液滴涂在电极表面，置于37°C下自然晾干；在电化学工作站中，在 O. lmol/L的KH2PO4溶液中用循环伏安的方法，将氧化石墨烯还原为还原氧化石墨烯。工作条件如下工作电压为-0. 2 1. 0V，扫速lOOmv/s，圈数为20圈；用计时电流的方法，在含硝酸钾为支持电解质的1%的氯金酸中恒电位沉积。工作条件如下工作电压为-200mv，工作时间为20s ;电极晾干后，用移液枪吸取5μ L的巯基化金黄色葡萄球菌适配体滴涂在电极表面，置于37°C下自然晾干，得到固定有金黄色葡萄球菌全菌捕获链的电极；
本发明的优点如下
(I)本发明设计的金黄色葡萄球菌适配体捕获探针能够特异性识别并捕获金黄色葡萄球菌全菌，为金黄色葡萄球菌的全菌检测提供了新的方法；
(2)本发明所用的电化学阻抗的检测方法，在于捕捉并记录电极表面微电流的变化，能够大大提闻检测的灵敏度；
(3)本发明中所用的DNA连接的还原氧化石墨烯-纳米金复合纳米材料，兼具石墨烯优异的电子传输性能和纳米金大比表面积的物理特性，扩大了检测信号。引入ssDNA作为连接物，为还原氧化石墨烯与纳米金之间的连接构造了 “桥梁”，利用分子间作用力使其结合`更加稳固，也提升了传感器的稳定性。
图1 :基于还原氧化石墨烯-纳米金复合材料的金黄色葡萄球菌无标记电化学适配体传感器的原理图。
图2 :制备还原氧化石墨烯-纳米金的扫描电镜表征图。a :吸附有ssDNA的还原氧化石墨烯；b :表面连接纳米金后的还原氧化石墨烯。
图3 :修饰不同材料后电极的阻抗表征图。
图4 :金黄色葡萄球菌检测的图。a :不同浓度金黄色葡萄球菌的阻抗图及拟合电路图；b :标准曲线。
具体实施方式
以下结合说明书附图和实施例对本发明作进一步的说明，但不是限制本发明。
实施例1 :
用生理盐水依次将金黄色葡萄球菌液稀释成8个浓度梯度，编号从KT1 10Λ在 37°C恒温下，将制备好的修饰捕获探针的工作电极与稀释到10_8浓度的菌液孵育。30min 后在三电极体系中用电化学阻抗法进行测量。工作条件如下电解液为含O. lmol/LKCl的 5mmol/LK3[Fe (CN) 6] /K4 [Fe (CN) 6] (I 1)，PH= 7. 4，外加电压为 O. 24V，频率范围为 IO5 IO-1HZ,振幅为5mV。同样的条件，依次在10_7 10—1浓度的菌液中37°C恒温孵育30min后测量阻抗值。每次测量前后轻柔的用超纯水淋洗电极表面，并小心用滤纸吸干。
根据公式AR = Rn-R0 (Rn为第η次捕获金黄色葡萄球菌后测量的阻抗值，R0为未捕获金黄色葡萄球菌的修饰好的电极阻抗值)并据此与对应的金黄色葡萄球菌标准品浓度建立标准曲线y = 35. 6x+10. 733，其检测的线性范围是lOicfu/mLKfcfu/mUR2 = O. 9933)。
实施例2
按发明所述方法制备修饰有金黄色葡萄球菌适配体的工作电极，并测得其阻值 Ro ；
取3只离心管，各加入市售纯牛奶900 μ L，分别加入浓度为102cfu/mL、IO3Cfu/ mL、104cfu/mL的金黄色葡萄球菌标准品各100 μ L，配成含有浓度为lOkfu/mL、102cfu/mL、 103cfu/mL金黄色葡萄球菌的牛奶标样；
按发明所述，在37 °C恒温条件下，将工作电极依次在浓度为Io1CfVmUio2Cfu/ mLU03cfu/mL金黄色葡萄球菌的牛奶样品中孵育30min，小心淋洗后置于电化学工作站中进行测量，测量条件如下电解液为含O. lmol/L KCl的5mM K3 [Fe (CN)6]/K4 [Fe (CN)6] (I I)，PH = 7. 4，外加电压为O. 24V，频率范围为IO5 KT1HZ,振幅为5mV。得出阻值R， 并根据公式AR = R-Rci算出AR的值，根据标准曲线算出测量样品中金黄色葡萄球菌的浓度，并算得回收率。
表1:制备的适配体传感器对纯牛奶中金黄色葡萄球菌的加标回收实验
权利要求
1.基于还原氧化石墨烯-纳米金复合材料的适配体传感器用于金黄色葡萄球菌的无标电化学检测，其特征在于；对裸玻碳电极抛光处理，将固定有巯基化的SSDNA的氧化石墨烯滴涂在电极表面，用电化学的方法将氧化石墨烯还原，然后在其表面电沉积一层纳米金， 纳米金与DNA巯基端依靠Au-S键稳固结合。再用层层自组装的方法引入巯基化的金黄色葡萄球菌全菌捕获探针，通过Au-S键固定在纳米金表面，制成适配体传感器对金黄色葡萄球菌标准品进行检测，并建立标准曲线，以实现对含金黄色葡萄球菌样品的定量检测。
2.如权利要求1所述的基于还原氧化石墨烯-纳米金复合材料的适配体传感器的制备，其特征在于电极的修饰1)取10μL的ssDNA溶于ImL的lmg/mL氧化石墨烯中，超声30min,用移液枪吸取5 μ L 混合液滴涂在电极表面，置于37°C下自然晾干；2)在电化学工作站中，在O.lmol/L的KH2PO4溶液中用循环伏安的方法，将氧化石墨烯还原为还原氧化石墨烯。工作条件如下工作电压为-O. 2 1. 0V,扫速100mv/s,圈数为20 圈；3)在电化学工作站中，用计时电流的方法，在1%的氯金酸中恒电位沉积。工作条件如下工作电压为-200mv，工作时间为20s ；4)电极晾干后，用移液枪吸取5μL的巯基化金黄色葡萄球菌适配体滴涂在电极表面， 置于37°C下自然晾干，得到固定有金黄色葡萄球菌全菌捕获探针的电极；5)在浓度O.lmol/L的2-巯基乙醇封闭1. 5小时，以消除非特异性吸附，至此工作电极制备完成。
3.基于还原氧化石墨烯-纳米金复合材料的适配体传感器的使用，在37°C恒温下，将工作电极在金黄色葡萄球菌溶液中的孵育30min。然后在三电极体系中，利用电化学阻抗法进行测量。工作条件如下电解液为含0. lmol/LKCl的5mmoI/LK3[Fe (CN)6]/K4 [Fe (CN)6] (I I)，PH = 7. 4，外加电压为0.24V，频率范围为IO5 KT1HZ,振幅为5mV。
全文摘要
基于还原氧化石墨烯-纳米金复合材料结合适配体检测金黄色葡萄球菌的方法，属于电化学领域。其基本原理是利用还原氧化石墨烯-纳米金复合材料，用层层自组装的方法修饰巯基化的金黄色葡萄球菌全菌捕获探针。当探针在金黄色葡萄球菌菌液中孵育，它的有效结合位点会与金黄色葡萄球菌结合，将其包裹在三维空间结构中，实现对目标菌的全菌“捕获”。由于结合目标菌后会阻碍电极表面的电子传输，使电化学阻抗值增大，我们利用阻值的变化实现对金黄色葡萄球菌的定量检测。石墨烯优异的电子传输能力和纳米金的大比表面积可以放大检测信号、缩短检测时间。本发明为金黄色葡萄球菌的全菌检测提供了一种新的方法，也为基于阻抗的电化学无标检测扩展了应用，同时兼具特异性强、灵敏度高、便宜、快速等优点。
文档编号G01N27/327GK103048369SQ201310017600
公开日2013年4月17日 申请日期2013年1月18日 优先权日2013年1月18日
发明者王周平, 贾飞, 段诺, 夏雨, 马小媛 申请人:江南大学