专利名称：应用于骨髓干细胞运动轨迹追踪的细胞标记检测方法
技术领域：
本发明涉及内源性骨髓干细胞标记追踪领域，具体涉及一种应用荧光染料标记骨髓干细胞并用来观察细胞运动轨迹的方法。
背景技术：
干细胞是一类具有高度自我更新能力和多向分化潜能的特殊细胞，是原始且未特化的细胞，具有再生各种组织器官的潜在功能。骨髓是干细胞的重要来源之一。对哺乳动物来说，干细胞分为两大类:胚胎干细胞与成体干细胞，胚胎干细胞来源于囊胚里的内细胞团；而成体干细胞则来自各式各样的组织。干细胞可以自我更新，繁殖产生更多的干细胞，同时也可以分化成各种各样的祖细胞，后者可进一步成熟发育成许多有特化的不同类型的细胞。自2006年iPS技术问世以来，伴随着对干细胞研究认识的深入及分子生物学和细胞生物工程技术的发展，干细胞的临床应用前景也越来越广阔。人们对于干细胞的应用前景，尤其是骨髓来源的干细胞充满了更多的美好期望，在器官移植、细胞治疗(如:糖尿病、白血病治疗等)等许多领域都具有良好的前景。然而，无法准确地标记并追踪来自身体内的干细胞的运动轨迹，尤其是不能准确、快速、简便地标记追踪骨髓来源干细胞是限制干细胞科研活动和临床研究与应用的一个重要因素。目前大多数的干细胞的标记工作都是在体外环境下进行，其鉴定与分离的理论基础是建立在对细胞表面特异性标记物的识别的基础上，通过特异性的标记分子来鉴定和区分不同的干细胞群体。其中包括荧光标记细胞分选(FACS)、免疫磁珠分离(MACS)和亲和吸附柱分离(CEPRATE)等。其中以FACS方法最常用，且具有比较高的细胞分选纯度和回收率(1-5)。但是，因为长时间的体外操作会对造成细胞损伤，因此该方法的使用也收到了很大的限制。
发明内容
本发明提供了一种应用于骨髓干细胞运动轨迹追踪的细胞标记检测方法，该方法操作简便、成本低、结果可靠并且结果稳定。实现本发明上述目的所采用的技术方案为:一种应用于骨髓干细胞运动轨迹追踪的细胞标记检测方法，采用以下步骤:(I )、将荧光染料CFSE溶解于生理盐水中制得CFSE溶液，CFSE溶液中CFSE的浓度为50-100ug/mL ；(2)、将具有生物活性的大腿骨或小腿骨置于生理环境中使其保持生物活性；(3)、采用ImL注射器抽取CFSE溶液，在室温条件下，将CFSE溶液注射入大腿骨或小腿骨的骨髓腔中，注射量为50-100 ill ；(4)、在标记后20天内的不同时间段抽取骨髓腔中的骨髓细胞以及生理环境中的液体进行检测。所述的大腿骨与小腿骨均来自于大鼠或小鼠。
步骤(3)在注射CFSE溶液的过程中，注射器的针头随着注射的进行逐步后退。本发明所提供的技术方案中将采用医学注射器直接穿刺将荧光染料注入骨髓腔，使骨髓腔中的细胞染上荧光染料，与现有技术相比操作时间短，不会对骨髓细胞造成损伤；同时本发明所采用的设备成本较低。本发明所提供的技术方案还能够在活体中进行使用。本发明提供的技术方案有以下优点:本发明提供的技术方案中避免了大型、昂贵仪器设备的使用，降低了实验操作的技术要求，简化了操作流程，易于实现。同时，本发明所提供的技术方案经多次重复试验证实了其有效性和稳定性，试验结果证明该方法应用于骨髓干细胞运动轨迹追踪的细胞标记检测方法是可行的，能够有效的检测出骨髓干细胞的运动轨迹。
图1为实施例1中标记后30分钟时骨髓细胞的检测图；图2为实施例1中标记后6天时骨髓细胞的检测图；图3为实施例1中标记后6天时血液细胞检测图；图4为实施例1中标记后9天时血液细胞检测图。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明做详细具体的说明。实施例1本实施例中荧光染料CFSE购买于Sigma公司，将荧光染料CFSE溶解于生理盐水中制得CFSE溶液，CFSE溶液中CFSE的浓度为50ug/mL。然后从小鼠的体内取出大腿骨，并将大腿骨放置于体外模拟生理环境中培养，使其保持生物活性。用ImL医用注射器抽取CFSE溶液，在室温下，将CFSE溶液注射入大腿骨的骨髓腔中，注射量为100 iil，在注射的过程中，注射器的针头随着注射的进行逐步后退，从而为荧光染料CFSE溶液的进入提供充足的空间。标记完成后将大腿骨继续培养，并分别在标记后30分钟、6天、9天、19天时抽取大腿骨髓腔中骨髓细胞以及体外模拟生理环境中的血液，并将获取的物质采用倒置荧光显微镜观察，记录荧光细胞的数量。观察结果如下表所示，“ + ”代表能够检测到荧光细胞，“％”表示荧光细胞的数量比例。
权利要求
1.一种应用于骨髓干细胞运动轨迹追踪的细胞标记检测方法，其特征在于采用以下步骤:(I )、将荧光染料CFSE溶解于生理盐水中制得CFSE溶液，CFSE溶液中CFSE的浓度为50-100 ug/mL ； (2)、将具有生物活性的大腿骨或小腿骨置于生理环境中使其保持生物活性； (3)、采用ImL注射器抽取CFSE溶液，在室温条件下，将CFSE溶液注射入大腿骨或小腿骨的骨髓腔中，注射量为50-100 ill ； (4)、在标记后20天内的不同时间段抽取骨髓腔中的骨髓细胞以及生理环境中的液体进行检测。
2.根据权利要求1所述的应用于骨髓干细胞运动轨迹追踪的细胞标记方法，其特征在于:所述的大腿骨与小腿骨均来自于大鼠或小鼠。
3.根据权利要求1所述的应用于骨髓干细胞运动轨迹追踪的细胞标记方法，其特征在于:步骤(3)在注射CFSE溶液的过程中，注射器的针头随着注射的进行逐步后退。
全文摘要
本发明提供了一种应用于骨髓干细胞运动轨迹追踪的细胞标记检测方法，其特征在于采用以下步骤将荧光染料CFSE溶解于生理盐水中制得CFSE溶液，CFSE溶液中CFSE的浓度为50-100 ug/mL；将具有生物活性的大腿骨或小腿骨置于生理环境中使其保持生物活性；采用1mL注射器抽取CFSE溶液，将CFSE溶液注射入大腿骨或小腿骨的骨髓腔中，注射量为50-100μl；在标记后20天内的不同时间段抽取骨髓腔中的骨髓细胞以及生理环境中的液体进行检测。所述的大腿骨与小腿骨均来自于大鼠或小鼠。本发明提供的避免了标记过程中大型、昂贵仪器设备的使用，降低了实验操作的技术要求，简化了操作流程，易于实现。同时，本发明能够有效的检测出骨髓干细胞的运动轨迹。
文档编号G01N21/64GK103091294SQ20131002182
公开日2013年5月8日 申请日期2013年1月21日 优先权日2013年1月21日
发明者刘庆华, 于孟飞, 陈微微, 谈丽, 李文尔 申请人:中南民族大学