专利名称：一种利用双向电泳技术检测大麦种子纯度的方法
技术领域：
本发明具体涉及一种检测大麦种子纯度的方法。
背景技术：
大麦是酿造啤酒的重要原料，品种的纯度是大麦质量的一项重要指标，不同纯度大麦由于可能掺杂其他品种大麦，带来不同类型蛋白质，导致酿造特征也不尽相同。所以，用于啤酒生产的大麦纯度对制麦工艺和啤酒酿造性能影响很大。不同纯度大麦也存在价格差异，而仅从外观和经验无法准确检测纯度，造成制麦和啤酒企业在大麦原料选取上容易造成一定损失，因此对大麦纯度检测方法的建立十分必要。本研究利用蛋白质双向电泳技术和TOQuest分析软件对不同纯度大麦水溶蛋白的电泳图谱进行分析，通过纯品种大麦的差异性蛋白点，得到纯度与其差异点3D图高度关系的标准曲线，利用该曲线可以检测大麦品种的纯度。本方法具有准确、快捷的特点，是一种有效检测大麦品种纯度的方法。
发明内容
本发明提供一种检测大麦种子纯度的方法，将纯种大麦去皮粉碎后加缓冲液浸提，再通过一系列步骤提纯，得到大麦的水溶蛋白，将人工混种不同纯度大麦的蛋白进行双向电泳，分析双向电泳图可以找到混种的差异性蛋白点。应用TOQuest软件分析人工混种的3D效果图，利用差异蛋白点高度与纯度关系的标准曲线，可以准确检测大麦种子的纯度。具体步骤如下:第一步、蛋白提取:取人工混种不同纯度的大麦经手工去皮后液氮研磨，取0.3g样品加入0.9mL提取液室温提取2h，并漩涡震荡3飞次，IOOOOg离心lOmin，取上清液加入等体积pH8.8Tris平衡酹,室温提取30min, IOOOOg离心IOmin,酹相加入4倍体积清洗液A，-80°C提取3h，IOOOOg离心IOmin ;离心得到的蛋白分别用清洗液A和清洗液B各洗涤、离心3次后，冷冻干燥；将得到全蛋白样品干粉加入100 μ L裂解液，室温漩涡振荡裂解lh，4°C裂解过夜，13000ppm4°C离心lOmin，取5 μ L上清液以考马斯亮蓝法测蛋白含量，按上样量分装，准备电泳。第二步、双向电泳:取蛋白上清液加入适量样品缓冲液，上样于自制胶条，上样量为 110μ g ;电泳条件:倒入电泳缓冲液，接通电源，室温下200V恒压电泳30min，500V恒压电泳30min, 1350V恒压电泳4h,进行等电聚焦。等点聚焦完成后将胶条从玻璃管中均匀挤出，在平衡缓冲液中平衡30min，转移至12%的分离胶上，20mA恒流垂直电泳。第三步、染色及分析:电泳结束后将凝胶置于固定液中固定f2h，考马斯亮蓝法进行染色，利用凝胶成像系统获取图像并通过TOQuest软件找到该纯品种与混种的差异性蛋白点，进行3D效果图的比较，绘制差异性蛋白点3D图高度与纯度关系的标准曲线；第四步、对待测样品进行电泳，得到同一区域蛋白点的3D图，并计算其纯度。以上所述配方中，提取液所用试剂均为优级纯，其余试剂均为分析纯，所用水为双蒸水或超纯水，其中:提取液:0.1M/L Tris-HCl(pH8.8),50mM/L 二巯基苏糖醇(DTT)，20mM/L 乙二胺四乙酸(EDTA)，ImM/L苯甲基磺酰氟(PMSF)，I μ M/L胃蛋白酶抑制剂(P印statin)，和10mM/L亮肽素，余量为水。清洗液A:100mM/L醋酸铵、10mM/L 二巯基苏糖醇的甲醇溶液。清洗液B:10mM/L 二巯基苏糖醇的90%乙醇。裂解液:7M/L尿素，2M/L硫脲，4%(w/v)3-[3-(胆酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐，l%(w/v) 二巯基苏糖醇,0.5%(v/v)载体两性电解质pH310, 2%(v/v)载体两性电解质pH4 6，10mM/L苯甲基磺酰氟，余量为水。样品缓冲液:7M/L尿素，2M/L硫脲，4%(w/v)3-[3-(胆酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐，l%(w/v) 二巯基苏糖醇,0.5%(v/v)载体两性电解质pH3 10, 2%(v/v)载体两性电解质pH4 6,1OmM/L苯甲基磺酰氟，10mg/L溴酹蓝,余量为水。自制胶条配方:0.6g尿素、540 μ L水、30%丙烯酰胺溶液200 μ L、ρΗ4 6载体两性电解质24 μ L、ρΗ3^1 0载体两性电解质溶液4.8 μ L，轻缓混匀后加入5 μ L10%过硫酸胺和4μ L四甲基乙二胺，轻轻混匀；快速吸取上述混合液，从直径1mm、长Ilcm玻璃管的一端缓慢均勻灌入约7cm,室温聚合lh。电泳缓冲液中，阴极电泳缓冲液:20mM/L氢氧化钠溶液150mL，阳极电泳缓冲液:10mM/L磷酸溶液200mL。平衡缓冲液:0.05M/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液(pH8.8)、30%(W/V)甘油、
2.3%(ff/V)十二烷基硫酸钠、6mM/L尿素，余量为水。分离胶:3.3mL 水、4.0mL30% 丙烯酰胺、2.5mLl.5M/L Tris-HCl.0.lmL10%SDS、
0.1mL 10%过硫酸铵、0.004mL四甲基乙二胺。固定液:10%乙酸，40%乙醇，余量为水。染色液:0.12%考马斯亮蓝G-250，10%硫酸铵，10%磷酸，20%甲醇，余量为水。本发明能够快速准确地得到纯种大麦的双向电泳图谱，通过图谱比对得到差异蛋白点，应用TOQuest软件分析人工混种的3D效果图，利用差异蛋白点高度与纯度关系的标准曲线，可以准确检测大麦的纯度。
图1、不同纯度大麦差异蛋白点1、2的变化，其中A-E依次对应纯度100、65、40、18,0%的大麦。图2、不同纯度差异蛋白点1、2的3D图，其中a-e依次为对应纯度100、65、40、18、
0%大麦对应高度。图3、差异蛋白点高度变化与纯度关系的标准曲线I。图4、差异蛋白点高度变化与纯度关系的标准曲线2。
图5、样品a、b在差异点1、2的3D高度图。
具体实施例方式实施例一、大麦纯度与差异性蛋白3D图高度的标准曲线I第一步、蛋白提取:取甘啤4号纯种大麦以单2号作为混种为纯度为100、65、40、18、0%的甘啤四号大麦样品。手工去皮后液氮研磨，取0.3g样品加入3倍体积提取液室温浸提2h。IOOOOg离心IOmin,取上清液加入等体积pH8.8的Tris平衡酹,室温提取30min。IOOOOg离心IOmin,上清液吸出，Tris平衡酚再次提取。两部分酚相合并加入4倍体积清洗液A，-80°C提取3h，IOOOOg离心lOmin。离心得到的蛋白分别用清洗液A和清洗液B各洗涤、离心3次后，冷冻干燥。将得到蛋白样品干粉加入100 μ L裂解液，室温漩涡振荡裂解lh，4°C裂解过夜。13000ppm4°C离心lOmin，取5 μ L上清液Bradford法测蛋白含量，按上样量分装，准备电泳。第二步、双向电泳:取蛋白上清加入适量样品缓冲液，上样于自制胶条；电泳条件:倒入电泳缓冲液(阴极电泳缓冲液:20mM/L氢氧化钠150mL，阳极电泳缓冲液:10mM/L磷酸200mL)。接通电源，室温下200V恒压电泳30min，500V恒压电泳30min，1350V恒压电泳4h，进行等电聚焦。等点聚焦完成后将胶条从玻璃管中均匀挤出，在平衡缓冲液中平衡30min，转移至12%的分离胶上，20mA恒流电泳。第三步、染色及分析:``
电泳结束后将凝胶放入固定液中固定lh，进行“Blue silver”考马斯亮蓝染色，利用凝胶成像系统获取图像，通过TOQuest软件选取甘啤4号区别于单2号蛋白点，3D图的高度与纯度见表1，通过该蛋白的3D图的高度得到其与纯度关系的标准曲线1，y=30.825x2+7.9949x_0.8631，R2=0.9936。表1:
权利要求
1.一种利用双向电泳检测大麦种子纯度的方法，具体操作步骤如下: 第一步、蛋白提取:取人工混种不同纯度的大麦经手工去皮后液氮研磨，取0.3g样品加入0.9mL提取液室温提取2h，并漩涡震荡3飞次，IOOOOg离心lOmin，取上清液加入等体积pH8.8Tris平衡酹，室温提取30min, IOOOOg离心IOmin,酹相加入4倍体积清洗液A，-80°C提取3h，IOOOOg离心IOmin ;离心得到的蛋白分别用清洗液A和清洗液B各洗涤、离心3次后，冷冻干燥；将得到全蛋白样品干粉加入100 μ L裂解液，室温漩涡振荡裂解lh，4°C裂解过夜，13000ppm4°C离心lOmin，取5 μ L上清液以考马斯亮蓝法测蛋白含量，按上样量分装，准备电泳； 第二步、双向电泳:取蛋白上清液加入适量样品缓冲液，上样于自制胶条，上样量为llOyg； 电泳条件:倒入电泳缓冲液，接通电源，室温下200V恒压电泳30min，500V恒压电泳30min, 1350V恒压电泳4h,进行等电聚焦； 等点聚焦完成后将胶条从玻璃管中均匀挤出，在平衡缓冲液中平衡30min，转移至12%的分离胶上，20mA恒流垂直电泳； 第三步、染色及分析: 电泳结束后将凝胶置于固定液中固定f2h，考马斯亮蓝法进行染色，利用凝胶成像系统获取图像并通过TOQuest软件找到该纯品种与混种的差异性蛋白点，进行3D效果图的比较，绘制差异性蛋白点3D图高度与纯度关系的标准曲线； 第四步、对待测样品进行电泳，得到同一区域蛋白点的3D图，并计算其纯度； 以上所述配方中，提取液所用试剂均为优级纯，其余试剂均为分析纯，所用水为双蒸水或超纯水,其中:提取液:0.1M/L Tris-HCl pH8.8，50mM/L 二巯基苏糖醇，20mM/L 乙二胺四乙酸，ImM/L苯甲基磺酰氟，I μ M/L胃蛋白酶抑制剂和10mM/L亮肽素，余量为水； 清洗液A: 100mM/L醋酸铵、10mM/L 二巯基苏糖醇的甲醇溶液； 清洗液B:10mM/L 二巯基苏糖醇的90%乙醇； 裂解液:7M/L尿素，2M/L硫脲，4%(w/v)3-[3-(胆酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐，l%(w/v) 二巯基苏糖醇,0.5%(v/v)载体两性电解质pH3 10,2%(v/v)载体两性电解质pH4 6，10mM/L苯甲基磺酰氟，余量为水； 样品缓冲液:7M/L尿素，2M/L硫脲，4%(w/v)3-[3-(胆酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐，l%(w/v) 二巯基苏糖醇,0.5%(v/v)载体两性电解质pH3 10,2%(v/v)载体两性电解质pH4 6，10mM/L苯甲基磺酰氟，10mg/L溴酚蓝，余量为水； 自制胶条配方:0.6g尿素、540 μ L水、30%丙烯酰胺溶液200 μ L、ρΗ4 6载体两性电解质24 μ L、ρΗ3^10载体两性电解质溶液4.8 μ L，轻缓混匀后加入5 μ L10%过硫酸胺和4 μ L四甲基乙二胺，轻轻混匀；快速吸取上述混合液，从直径1mm、长Ilcm玻璃管的一端缓慢均勻灌入约7cm,室温聚合Ih ； 电泳缓冲液中，阴极电泳缓冲液:20mM/L氢氧化钠溶液150mL，阳极电泳缓冲液:10mM/L磷酸溶液200mL ； 平衡缓冲液:0.05M/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液pH8.8、30%(W/V)甘油、2.3%(ff/V)十二烧基硫酸钠、6mM/L尿素,余量为水；分离胶:3.3mL 双蒸水、4.0mL30% 丙烯酰胺、2.5mLl.5M/L Tris-HCl.0.lmL10%SDS、.0.lmL10%过硫酸铵、0.004mL四甲基乙二胺，余量为水； 固定液:10%乙酸，40%乙醇，余量为水； 染色液:0.12%考马斯亮蓝G-250 ，10%硫酸铵，10%磷酸，20%甲醇，余量为水。
全文摘要
本发明提供一种检测大麦种子纯度的方法，将纯种大麦去皮粉碎后加缓冲液浸提，再通过一系列步骤提纯，得到大麦的水溶蛋白，将人工混种不同纯度大麦的蛋白进行双向电泳，分析双向电泳图可以找到混种的差异性蛋白点。应用PDQuest软件分析人工混种的3D效果图，利用差异蛋白点高度与纯度关系的标准曲线，可以准确检测大麦种子的纯度。
文档编号G01N1/28GK103115950SQ201310045900
公开日2013年5月22日 申请日期2013年2月5日 优先权日2013年2月5日
发明者赵长新, 刘宝祥, 尹亚辉, 安文涛, 姚继兵, 张铭振 申请人:大连工业大学