专利名称：一种用于诊断或辅助诊断远东斑点热病的蛋白组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种用于诊断或辅助诊断远东斑点热病的蛋白组合物。
背景技术：
立克次体病是一种严重威胁人类健康的人兽共患自然疫源性疾病，在历史上曾严重威胁人类的健康，当今仍是造成人类发病和死亡的重要病因之一，其由立克次体引起，经蝶传播的感染性疾病。黑龙江立克次体(Rickettsia heilongjiangensis)是我国新发现的斑点热群立克次体，引起蝶传远东斑点热(Far-eastern tick-borne spotted fever),其疫区主要分布在我国东北地区、俄罗斯远东及日本。
在我国，斑点热报告较少，其重要原因是误诊和漏诊现象相当普遍。斑点热常被误诊为上呼吸道感染、疟疾、钩端螺旋体病、斑疹伤寒、恙虫病等热性病。造成误诊和漏诊的原因其一是斑点热还未被大多数人所了解，包括医务人员在内；其二是实验室诊断方法，包括间接免疫荧光(IFA)技术，酶联免疫吸附(ELISA)技术等，这些检测方法特异性较高，但对样本需求量大、步骤较为繁琐费时、并且都需要纯化的立克次体全菌作为抗原，而培养、纯化立克次体的防护要求高，工艺复杂，成本昂贵，因此难以被广泛推广和使用。发明内容
本发明的一个目的是提供一种具有如下I)或2)功能的的蛋白组合物；1)用于诊断或辅助诊断远东斑点热病；
2)用于检测或辅助检测黑龙江立克次体(Rickettsia heilongjiangensis)感染样本。本发明提供的蛋白组合物，由如下5种蛋白组成:RplA蛋白、RplY蛋白、OmpA蛋白、OmpB蛋白和GroEL蛋白；
所述RplA蛋白为如下Ι-a)或l_b):
1-a)为序列表中序列I的氨基酸残基组成的蛋白质；
Ι-b)为将序列表中序列I所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由l_a衍生的蛋白质；
所述RpH蛋白为如下2-a)或2_b):
2-a)为序列表中序列2的氨基酸残基组成的蛋白质；
2-b)为将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由2-a衍生的蛋白质；
所述OmpA蛋白为如下3_a)或3_b):
3-a)为序列表中序列3的氨基酸残基组成的蛋白质；
3-b)为将序列表中序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由3-a衍生的蛋白质；
所述OmpB蛋白为如下4_a)或4_b):
4-a)为序列表中序列4的氨基酸残基组成的蛋白质；
4-b)为将序列表中序列4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由4-a衍生的蛋白质；
所述GroEL蛋白为如下5-a)或5-b):
5-a)为序列表中序列5的氨基酸残基组成的蛋白质；
5-b)为将序列表中序列5所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由5-a衍生的蛋白质。
上述一个或 几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
上述蛋白组合物中，所述远东斑点热病是由黑龙江立克次体(Rickettsiaheilongjiangensis)弓丨起的蝶传远东斑点热(Far-eastern tick-borne spotted fever)。在本发明的实施例中黑龙江立克次体(Rickettsia heilongjiangensis)为黑龙江立克次体(Rickettsia heilongjiangensis) 054 型株。
上述检测或辅助检测的样本为人或动物的血样本。
含有上述蛋白组合物的蛋白芯片也是本发明保护的范围。
上述蛋白芯片为用于诊断或辅助诊断远东斑点热病的蛋白芯片；
所述远东斑点热病具体是由黑龙江立克次体(Rickettsia heilongjiangensis)引起的蝶传远东斑点热(Far-eastern tick-borne spotted fever)
本发明的另一个目的是提供一种制备所述蛋白芯片的方法。
本发明提供的蛋白芯片，将上述的蛋白组合物中的5种蛋白作为5种检测点与阳性质控点和阴性质控点一起点制在基底上，得到蛋白芯片。
上述蛋白芯片中，所述蛋白以蛋白溶液的形式点制在基底上；
上述蛋白溶液为将蛋白溶解于洗脱缓冲液得到的溶液；上述每I升洗脱缓冲液组成:将 NaH2PO4.H20、NaCl、咪唑、0.3L 甘油和水混合，NaH2PO4.H2O 终浓度为 50mmol/L、NaCl终浓度为300mmol/L、咪唑终浓度为250mmol/L，用NaOH调节pH至8.0，用水定容至1L，得到洗脱缓冲液。
上述蛋白芯片检测的样本为人或动物的血样本。
上述蛋白芯片中，所述基底可为任何制备蛋白芯片时所用的基底，具体可如醛基化玻片。
上述蛋白芯片中，所述阴性质控对照可为任何本领域中常用的阴性质控对照，具体可如水、PBS缓冲液，还具体可为蛋白洗脱缓冲液或转入空载体pET-32a(+)的BL21(DE3)的细胞裂解液。
其中，转入空载体pET_32a(+)的BL21(DE3)的细胞裂解液按照如下方法制备:将转入空载体pET-32a(+)的BL21(DE3)接入氨苄青霉素抗性(Amp+)的LB液体培养基中，37°C震摇过夜，次日按1:100接种新鲜氨苄青霉素抗性(Amp+)的LB液体培养基，37°C震摇至0D600 = 0.4，加入诱导剂IPTG，浓度为0.4mM，于37°C继续震摇4小时，得到发酵液。取诱导表达的发酵液100ml,8000rpm/min离心5min,集菌,弃上清液。用30ml裂解缓冲液重悬菌体，以25%振幅超声破碎(超3s，停9s) I小时，得到转入pET-32a(+)的BL21 (DE3)的细胞裂解液。
每I升裂解缓冲液按照如下方法制备:将NaH2PO4.H2O, NaCl、咪唑和水混合，NaH2PO4.H2O终浓度为50mmol/L、NaCl终浓度为300mmol/L、咪唑终浓度为10mmol/L，用NaOH调节pH至8.0，用水定容至1L，得到裂解缓冲液。
上述蛋白芯片中，所述阳性质控点由人源IgG或IgM或除人外的其它动物来源的IgG或IgM点制而成，本发明的实施例中阳性质控点为2个，为由鼠源IgG和人源IgG点制。
本发明的第三个目的是提供一种具有如下I)或2)功能的的试剂盒；
I)用于诊断或辅助诊断远东斑点热病；
2)用于检测或辅助检测黑龙江立克次体(Rickettsia heilongjiangensis)感染样本。
上述检测或辅助检测的样本为人或动物的血样本。
本发明提供的试剂盒，包括上述的蛋白组合物或上述的蛋白芯片。
上述试剂盒还包括荧光素标记的二抗、封闭液和漂洗液；
所述试剂盒为如下I)或2):
I)所述的试剂盒由是上述的蛋白组合物、所述封闭液、所述漂洗液和所述荧光素标记的二抗组成；
2)所述的试剂盒由上述的蛋白芯片、所述封闭液、所述漂洗液和所述荧光素标记的二抗组成。
所述封闭液按照如下方法制备得到:将BSA溶于pH值为7.4的PBS缓冲液中，BSA与PH值为7.4的PBS缓冲液的配比为Ig:100ml，得到的溶液即为封闭液；
漂洗液:PBST缓冲液。
上述荧光素标记的二抗为Cy5标记的羊抗人IgG或Cy5标记的羊抗除人以外其它动物来源的IgG ;在本发明的实施例中荧光素标记的二抗为Cy5标记的羊抗鼠IgG。
每I升磷酸盐缓冲液(pH值为7.4的PBS缓冲液)按照如下方法制备:将Sg NaCl,0.2gKCl、3.53gNa2HP04.12Η20、0.24g KH2PO4和水混合，用水定容至I升，得到的溶液的pH值为7.4，即得到PBS缓冲液。
每I升PBST缓冲液按照如下方法制备:将磷酸盐缓冲液(PBS)与Tween-20混合，磷酸盐缓冲液(PBS)与T ween-20的配比为I升:1ml，得到PBST缓冲液。
上述试剂盒中，所述远东斑点热病是由黑龙江立克次体(Rickettsiaheilongjiangensis)弓丨起的蝶传远东斑点热(Far-eastern tick-borne spotted fever)。在本发明的实施例中黑龙江立克次体(Rickettsia heilongjiangensis)为黑龙江立克次体(Rickettsia heilongjiangensis) 054 型株。
上述的蛋白组合物在制备具有如下I)或2)功能的产品中的应用也是本发明保护的范围。上述应用中，上述产品为蛋白芯片或试剂盒；I)用于诊断或辅助诊断远东斑点热病；2)用于检测或辅助检测黑龙江立克次体(Rickettsia heilongjiangensis)感染样本。
上述的蛋白芯片在制备具有如下I)或2)功能的产品中的应用也是本发明保护的范围。上述应用中，上述产品为试剂盒；1)用于诊断或辅助诊断远东斑点热病；2)用于检测或辅助检测黑龙江立克次体(Rickettsia heilongjiangensis)感染样本。
上述检测或辅助检测的样本为人或动物的血样本。
上述应用中，所述远东斑点热病是由黑龙江立克次体(Rickettsiaheilongjiangensis)弓丨起的蝶传远东斑点热(Far-eastern tick-borne spotted fever)。在本发明的实施例中黑龙江立克次体(Rickettsia heilongjiangensis)为黑龙江立克次体(Rickettsia heilongjiangensis) 054 型株。
本发明的实验证明，本发明发现了由5种蛋白组成的蛋白组合物及将这5种蛋白点制在基底上的蛋白芯片，运用该组合物或芯片可以对远东斑点热病人或动物的血清进行快速、准确的血清学分析诊断，结果准确可靠，操作简便，样本用量少，省时省力，可以代替传统的繁琐、累人、耗时的血清学诊断方法做远东斑点热血清学诊断。
图1为蛋白的电泳结果
图2为蛋白RplA与各血清组中血清反应荧光信号值分布散点图
图3为蛋白RpH与各血清组中血清反应荧光信号值分布散点图
图4为蛋白OmpA与各血清组中血清反应荧光信号值分布散点图
图5为蛋白OmpB与各血清组中血清反应荧光信号值分布散点图
图6为蛋白GroEL与各血清组中血清反应荧光信号值分布散点图具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例中所用的黑龙江立克次体(Rickettsia heilongjiangensis)均为黑龙江立克次体 054 型株:在文献“Changsong Duan, Yanfen Meng, Xile Wang, Xiaolu Xiong, andBohai Wen.2011.Exploratory Study on Pathogenesis of Far-Eastern Spotted Fever.Am.J.Trop.Med.Hyg.，85(3)，2011，pp.504 - 509.”中公开过，公众可在法律及军队相关规定允许的范围内从中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所获得。
实施例中所用的立氏立克次体(Rickettsia rickettsii)均为立氏立克次体 sheila smith 型株:在文献“Ellison DWj Clark TRj Sturdevant DEj VirtanevaK，Porcella SF，et al.(2007)Genomic Comparisonof Virulent Rickettsia rickettsiiSheila Smith and Avirulent Rickettsia rickettsii 1wa.1nfection andimmunity76:542-550.”中公开过，公众可在法律及军队相关规定允许的范围内从中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所获得。
实施例中所用的普氏立克次体(Rickettsia prowazekii)均为普氏立克次体Madrid E 型株:在文献 “J.-Z.Zhang, J.-F.Haoj D.H.Walker, X.-J.Yu.(2006)A mutationinactivating the methyItransferase gene in avirulent Madrid E strain ofRickettsia prowazekii reverted to wild type in the virulent revertant strainEvir,Vaccine24:2317 - 2323.”中公开过，公众可在法律及军队相关规定允许的范围内从中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所获得。
实施例中所用的Q热病原体(贝氏柯克斯体)(Coxiella burnetii)均为贝氏柯克斯体 Xinqiao I 相株:在文献 “Xiong Xj Wang Xj Wen B, Graves S，Stenos J (2012)Potential serodiagnostic markers for Q fever identified in Coxiella burnetiiby immunoproteomic and protein microarray approaches.BMC Microbiol 12:35.，，中公开过，公众可在法律及军队相关规定允许的范围内从中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所获得。
实施例中所用的恙虫病东方体(Orientia tsutsugamushi)均为恙虫病东方体Karp型株:在文献“余跃飞，温博海，牛东升等.恙虫病东方体Karp株47kDa蛋白成熟肽的克隆与表达[J].汕头大学医学院学报，2003，16(3):132-134.”中公开过，公众可在法律及军队相关规定允许的范围内从中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所获得。
实施例中所用立氏立克次体(Rickettsia rickettsii)、普氏立克次体(Rickettsia prowazekii)、Q 热病原体(或贝氏柯克斯体)(Coxiella burnetii)、恙虫病东方体(Orientia tsutsugamushi)感染小鼠血清均为中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所保存。公众可在法律及军队相关规定允许的范围内从中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所获得。
实施例1、5种抗原蛋白的制备
载体pET_32a(+)购自Novagen公司，产品目录号为69015
载体pQE-30购自Qiagen公司，产品目录号为33203。
大肠杆菌M15购自Novagen公司，产品目录号为34210。
大肠杆菌BL21 (DE3)购自Novagen公司，产品目录号为69450。
—、5种抗原蛋白的蛋白序列及编码基因序列
5种抗原蛋白的蛋白的氨基酸序列及编码基因的核苷酸序列如表I所示。
表I为蛋白及基因序列
权利要求
1.一种具有如下I)或2)功能的蛋白组合物，由如下5种蛋白组成:RplA蛋白、Rp；LY蛋白、OmpA蛋白、OmpB蛋白和GroEL蛋白； 1)用于诊断或辅助诊断远东斑点热病； 2)用于检测或辅助检测黑龙江立克次体(Rickettsiaheilongjiangensis)感染样本；所述RplA蛋白为如下1-a)或1-b): 1-a)为序列表中序列I的氨基酸残基组成的蛋白质； Ι-b)为将序列表中序列I所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由l_a衍生的蛋白质； 所述Rp；LY蛋白为如下2-a)或2-b): 2-a)为序列表中序列2的氨基酸残基组成的蛋白质； 2_b)为将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由2-a衍生的蛋白质； 所述OmpA蛋白为如下3-a)或3_b): 3-a)为序列表中序列3的氨基酸残基组成的蛋白质； 3_b)为将序列表中序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由3-a衍生的蛋白质； 所述OmpB蛋白为如下4-a)或4_b): 4-a)为序列表中序列4的氨基酸残基组成的蛋白质； 4_b)为将序列表中序列4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由4-a衍生的蛋白质； 所述GroEL蛋白为如下5_a)或5_b): 5-a)为序列表中序列5的氨基酸残基组成的蛋白质； 5_b)为将序列表中序列5所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由5-a衍生的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的蛋白组合物，其特征在于:所述远东斑点热病是由黑龙江立克次体(Rickettsia heilongjiangensis)引起的蝶传远东斑点热(Far-easterntick-borne spotted fever)。
3.含有权利 要求1或2所述蛋白组合物的蛋白芯片。
4.一种制备权利要求3所述蛋白芯片的方法，包括如下步骤:将权利要求1或2所述的蛋白组合物中的5种蛋白作为5种检测点与阳性质控点和阴性质控点一起点制在基底上，得到蛋白芯片。
5.根据权利要求4所述的蛋白芯片，其特征在于:所述蛋白以蛋白溶液的形式点制在基底上。
6.一种具有如下I)或2)功能的试剂盒，包括权利要求1或2所述的蛋白组合物或权利要求3所述的蛋白芯片； 1)用于诊断或辅助诊断远东斑点热病； 2)用于检测或辅助检测黑龙江立克次体(Rickettsiaheilongjiangensis)感染样本。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒还包括荧光素标记的二抗、封闭液和漂洗液；所述试剂盒为如下I)或2): 1)所述的试剂盒由权利要求1或2所述的蛋白组合物、所述封闭液、所述漂洗液和所述荧光素标记的二抗组成； 2)所述的试剂盒由权利要求3或4所述的蛋白芯片、所述封闭液、所述漂洗液和所述荧光素标记的二抗组成。
8.根据权利要求6或7所述的试剂盒，其特征在于: 所述远东斑点热病是由黑龙江立克次体(Rickettsia heilongjiangensis)引起的蝶传远东斑点热(Far-eastern tick-borne spotted fever)。
9.权利要求1或2所述的蛋白组合物在制备具有如下I)或2)功能的产品中的应用；或权利要求3所述的蛋白芯片在制备具有如下I)或2)功能的产品中的应用； 1)用于诊断或辅助诊断远东斑点热病； 2)用于检测或辅助检测黑龙江立克次体(Rickettsiaheilongjiangensis)感染样本。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于:所述远东斑点热病是由黑龙江立克次体(Rickettsia heilongjiangensis)弓丨起的蝶传远东斑点热(Far-eastern tick-bornespotte d fever)。
全文摘要
本发明公开了一种用于诊断或辅助诊断远东斑点热病的蛋白组合物。本发明提供了提供的蛋白组合物，由如下5种蛋白组成RplA蛋白、RplY蛋白、OmpA蛋白、OmpB蛋白和GroEL蛋白；本发明的实验证明，本发明发现了由5种蛋白组成的蛋白组合物及将5这种蛋白点制在基底上的蛋白芯片，运用该组合物或芯片可以对远东斑点热病人或动物的血清进行快速、准确的血清学分析诊断，结果准确可靠，操作简便，样本用量少，省时省力，可以代替传统的繁琐、累人、耗时的血清学诊断方法做远东斑点热血清学诊断。
文档编号G01N33/68GK103149365SQ201310049378
公开日2013年6月12日 申请日期2013年2月7日 优先权日2013年2月7日
发明者齐永, 温博海, 王锡乐, 熊小路, 段长松, 李佳明, 贾引军, 龚文平, 焦俊 申请人:中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所