专利名称：检测离体鼠胫骨钙的激光共聚焦同步应力加载方法及装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种离体鼠胫骨骨细胞实时钙信号检测技术，用于研究骨力学信号转导和骨适应的相关机理，为临床骨质疏松症的病因学和治疗学的研究提供更深入而科学的理论依据。
背景技术：
骨质疏松症(OP)是临床上最为常见的疾病之一，表现为骨量的降低、骨组织的微结构衰退以及骨脆性的增加，常导致骨折的发生及肢体功能永久性丧失。随着我国人口老龄化速度的加剧，OP给我国带来的经济和社会负担也逐年加重。19世纪著名的WolfT定律提出:骨骼作为机体的应力承载系统，其能够通过改变自身的结构以对外界应力刺激作出适应性改变，而OP发生的主要原因之一就是骨骼上的应力负荷不足或骨骼自身应力响应能力衰退，造成骨钙大量丢失，进而诱发0P。但是，这种骨适应原理的具体发生机制目前仍未彻底阐明，骨组织是如何响应、转导外界应力刺激的，目前仍不得而知。骨细胞(OCY)是成骨细胞(OB)的终端分化细胞,约占骨中细胞总数的95%，它们沉积在骨矿化基质中，彼此相连形成OCY细胞网络。OCY细胞网络是响应外界力学刺激的主要组件，OCY能响应外界的应力刺激从而调控OB和破骨细胞(OC)的生物活性和功能。因此，深入研究OCY力学信号响应及转导的机制，对于进一步揭示骨适应的机制，深入了解OP的发生机理具有重要的意义。钙信号是机体中最重要的第二信使分子 ，它可以将细胞外的信号传导入细胞内，从而调控细胞的各种生理功能，包括增殖、分化及凋亡等。同时，钙信号也是最重要的力学信号转导分子，已被发现是多个机体组织内在应力刺激下最早发生变化的信号转导分子。目前，国际上研究应力刺激对于骨细胞钙信号响应的方法主要采用体外实验的方法，即在细胞表面施加应力的刺激，包括流体剪切力、细胞压痕、基底拉伸等。但是，体外细胞实验无法真实的模拟骨细胞的原位生长环境，同时体外骨细胞分离培养也很难保持其生物学特性与其在体环境中的完全一致。因此，能够实时的监测原位细胞内钙信号并深入研究其特征对于研究细胞力学信号转导有着十分重要的意义，它相比于体外细胞钙信号研究具有更加明显的优势。目前国内外尚未见研究报道。在动态的应力载荷作用下，会引起组织发生压缩和弯曲形变，而即使极其细微的形变也会引起激光共聚焦焦距的显著偏移。因此，原位骨细胞钙信号应力转导的主要技术挑战在于如何在周期载荷的作用下克服组织在显微镜下的焦点偏移。
发明内容
本发明针对上述周期载荷作用下原位骨细胞钙信号研究存在的技术挑战，提出了一种离体鼠胫骨骨细胞钙信号实时检测的方法及装置，该方法采用激光共聚焦采集和应力加载同步的技术，能够显著抑制周期载荷作用引起的激光共聚焦显微镜焦点偏移，从而能够精确采集和测量原位骨细胞钙信号响应。
为达到以上目的，本发明是采取如下技术方案予以实现的:—种检测离体鼠胫骨钙的激光共聚焦同步应力加载方法，其特征在于，包括下述步骤:(I)将标记有Fluo-SAM钙荧光探针的鼠胫骨固定于一个腔室中的组织固定器中间，腔室内填充以37°C细胞培养液淹没该鼠胫骨，将一个激光共聚焦显微镜镜头对着于腔室下面的石英晶片，使胫骨前内侧平坦区域的钙离子在激光共聚焦显微镜中成像，组织固定器的一端固定，另外一端施以应力加载作用于鼠胫骨产生轴向的压缩载荷，使胫骨前内侧的钙成像表面同时产生轴向的压缩形变和垂直于轴向的弯曲形变；(2)激光扫描共焦显微镜每5秒进行一次面扫描,共进行180巾贞的图像扫描,其中前5帧的采样作为基线控制；(3)应力加载开始于第5巾贞和第6巾贞扫描的间歇,米用周期动态加载方式,基本波形为斜坡加载，包括2-N的预加载，0.5秒的斜坡上升以及0.5秒的斜坡下降，通过控制加载的速率分别产生斜坡尖峰为8-N的加载波形，两个加载周期之间的滞留时间为4秒，共加载175周期。上述方法中，所述的激光扫描共焦显微镜每5秒进行一次面扫描包括1.1秒的扫描时间以及3.9秒的间歇时间。所述每个加载周期中的斜坡上升位移及斜坡下降位移相
坐寸ο一种检测离体鼠胫骨钙的激光共聚焦同步应力加载装置，其特征在于，包括依次轴向连接的线性促动器、压力传感器、组织固定器、信号采集和处理模块，其中，组织固定器用于夹持鼠胫骨试样并置于一个盛 有细胞培养液的腔室中，腔室的底部为石英晶片，组织固定器的一端固定，另一端通过线性促动器在鼠胫骨试样上产生轴向的压缩载荷；石英晶片下方设有激光共聚焦显微镜镜头，激光共聚焦显微镜发射的荧光通过石英晶片到达鼠胫骨试样组织中的任意层面，通过捕获反射光从而观测骨细胞的原位钙信号；所述信号采集和处理模块将离体鼠胫骨应力、位移和应变电信号进行调制放大后进行转换，再通过PC中的Labview控制程序通过运动控制器控制线性促动器的动作。上述方案中，所述的组织固定器固定端通过线性轴承固定。本发明应力加载装置以及激光扫描共聚焦采集与应力加载同步方法可以显著地克服在动态载荷作用下所产生的焦点偏移，从而能够进行精确的实时原位骨细胞钙信号的采集和分析。本发明方法使研究原位的骨细胞力学信号转导成为可能，而原位骨细胞钙信号响应的研究具有体外细胞实验所无法比拟的优势。该研究代表着骨力学信号转导研究领域的一个重要的技术突破，为我们深入的探究骨适应和骨力学信号转导的相关机制提供了重要的方法学上的支撑。
以下结合附图及具体实施方式
对本发明作进一步的详细描述。
图1为本发明的与激光共聚焦显微镜整合的离体鼠胫骨应力加载装置的结构示意图。图2为图1加载装置中离体鼠胫骨应力加载信号采集、处理及控制的原理框图。图3为本发明激光共聚焦采集和应力加载同步的方法示意图。其中A图为图1加载装置中被测式样及装载部分；B图为小鼠胫骨试样示意图；C图为激光共聚焦采集和应力加载同步示意图。图1至图3中:1、线性促动器；2、压力传感器；3、线性轴承；4、组织固定器；5、腔室；6、石英晶片；7细胞培养液；8、应力加载；9、激光共聚焦显微镜镜头；10、平坦区域。图4为图1加载装置与液压式万能材料试验机的杨氏模量比较图。图5为使用本发明方法进行动态应力载荷作用下的小鼠胫骨原位骨细胞和成骨细胞钙信号采集示意图。其中:A图为成骨细胞在Fluo-SAM钙荧光探针染色后使用激光共聚焦显微镜采集的照片图为骨细胞在Fluo-SAM钙荧光探针染色后使用激光共聚焦显微镜采集的照片；C图的六个信号曲线分别为A图中所标记的六个成骨细胞所对应的标准化的细胞钙荧光信号；D图的六个信号曲线分别为B图中所标记的六个骨细胞所对应的标准化的细胞钙荧光信号。
具体实施例方式如图1所示，一种可与激光共聚焦显微镜整合的离体鼠胫骨应力加载装置，包括线性促动器1、压力传感器2、线性轴承3、组织固定器4、腔室5。腔室为一个直径为10cm，深度为2cm的圆形腔室，用以填充细胞培养液7以维持实验小(大)鼠的胫骨中骨细胞的活性。腔室的底部是厚度为Imm的圆形石英晶片6。组织固定器4置于腔室中，组织固定器底端具有圆形的孔洞，用以固定鼠胫骨并防止加载中的滑动。组织固定器固定端通过线性轴承固定，以防止侧向位移的发生。组织固定器与线性促动器之间由压力传感器连接，以测量胫骨所承受的压缩应力。该应力加载装置可以与激光扫描共聚焦显微镜相整合，即在石英晶片下方设有激光共聚焦显微镜镜头(图3A)，激光共聚焦显微镜发射的荧光通过石英晶片6到达鼠胫骨试样组织中的任意层面，通过捕获反射光从而观测骨细胞的原位钙信号；并同步在鼠胫骨两端产生动态的生理水平的压缩载荷(应力为0-20N，应变为0-2000 μ ε )，参见图2，应力加载装置采集的应力(压力传感器)、位移(线性促动器)和应变(骨试样上粘附微应变片测量获得)电信号通过信号采集和处理模块中的调制放大器进行信号的滤波和放大，放大后的三路模拟信号信送入数据采集卡DAQ进行信号的转换和数据采集。通过PC端的Labview控制程序可以通过人机交互界面实时的显示采集的应力、位移和应变信息，并可以通过Labview控制端发送命令至线性促动器的运动控制器从而可以控制线性促动器的动作。如图3所示，本发明激光共聚焦采集和应力加载同步方法如下:三月龄雌性C57BL/6J小鼠购于第四军医大学实验动物中心，采用CO2吸入法至小鼠死亡，立即采用无菌医用外科手术剪刀和镊子迅速提取小鼠胫骨组织。在无菌条件下，使用a-MEM细胞培养液浸湿的无菌医用纱布剥离包绕胫骨的肌肉和其表面的骨膜。使用a-MEM细胞培养液反复清洗胫骨5分钟，清洗完毕后立即将胫骨浸入a -MEM细胞培养液中，于37°C、5%C02环境培养2小时。将小鼠胫骨浸于15 μ M的Fluo-8AM钙荧光探针的a -MEM细胞培养液中30分钟，反复清洗3遍后将胫骨样本固定于组织固定器4中间。
如图3Α所示，腔室5中填充以37°C的a -MEM细胞培养液7以维持细胞的正常生物学活性。组织固定器4的一端固定，另一端施以应力加载8作用于小鼠胫骨远端产生轴向的压缩载荷，将一个激光共聚焦显微镜镜头9对着于腔室下面的石英晶片6，胫骨前中侧的平坦区域10面向激光共聚焦显微镜镜头。从而在胫骨前内侧的钙成像表面同时产生轴向的压缩形变和垂直于轴向的弯曲形变。调节激光共聚焦显微镜镜头9的焦点，大量的成骨细胞可以在位于骨膜下方 ο μ M位置发现，而大量的骨细胞则位于骨膜下方>40 μ M的位置。激光扫描共焦显微镜每5秒进行一次面扫描(包括1.1秒的扫描时间以及3.9秒的间歇时间)，每帧图像大小为512X512像素。激光扫描共焦显微镜共进行180帧(共900秒)的图像扫描，其中前5帧的采样作为基线控制。应力加载开始于第5帧和第6帧激光共聚焦扫描的间歇。应力加载8采用周期动态加载方式，基本加载的波形为斜坡加载，包括2-Ν的预加载，0.5秒的斜坡上升以及0.5秒的斜坡下降，通过控制加载的速率分别产生斜坡尖峰为8-Ν的加载波形，两个加载周期之间的滞留时间为4秒，共加载175周期。在进行激光扫描共聚焦的过程中，整个系统严格地工作在位移控制模式，即每个加载周期中的斜坡上升位移及斜坡下降位移相等。该套应力加载装置以及激光扫描共聚焦采集与应力加载同步方法可以明显克服在动态载荷作用下所产生的焦点偏移。为了评价该应力加载系统的测量精度，我们通过使用长为15mm、直径为3mm超高分子量的聚乙烯(UHMWPE)材料的圆柱体样本对该应力加载系统进行校验。其方法包括，使用本发明中的可与激光共聚焦显微镜整合的离体鼠胫骨应力加载系统对该UHMWPE小圆柱体样本进行轴向压缩实验，将该样本固定于组织固定器4中间，预加载大小为0.5N，确保该样本的轴向保持完全的水平，通过Labview控制端向线性促动器I发送命令，令其施加5 μ m/sec的轴向压缩载荷，直至样本所承受的载荷达到12N，立刻停止线性促动器的动作，实时的记录位移和应力随时间的变化关系，通过以下公式计算该样本的杨氏模量(Young’sModulus):
权利要求
1.一种检测离体鼠胫骨钙的激光共聚焦同步应力加载方法，其特征在于，包括下述步骤: (1)将标记有F1U0-8AM钙荧光探针的鼠胫骨固定于一个腔室中的组织固定器中间，腔室内填充以37°C细胞培养液淹没该鼠胫骨，将一个激光共聚焦显微镜镜头对着于腔室下面的石英晶片，使胫骨前内侧平坦区域的钙离子在激光共聚焦显微镜中成像，组织固定器的一端固定，另外一端施以应力加载作用于鼠胫骨产生轴向的压缩载荷，使胫骨前内侧的钙成像表面同时产生轴向的压缩形变和垂直于轴向的弯曲形变； (2)激光扫描共焦显微镜每5秒进行一次面扫描，共进行180帧的图像扫描，其中前5帧的采样作为基线控制； (3)应力加载开始于第5帧和第6帧扫描的间歇，采用周期动态加载方式，基本波形为斜坡加载，包括2-N的预加载，0.5秒的斜坡上升以及0.5秒的斜坡下降，通过控制加载的速率分别产生斜坡尖峰为8-N的加载波形，两个加载周期之间的滞留时间为4秒，共加载175周期。
2.如权利要求1所述的检测离体鼠胫骨钙的激光共聚焦同步应力加载方法，其特征在于，所述激光扫描共焦显微镜每5秒进行一次面扫描包括1.1秒的扫描时间以及3.9秒的间歇时间。
3.如权利要求1所述的检测离体鼠胫骨钙的激光共聚焦同步应力加载方法，其特征在于，所述每个加载周期中的斜坡上升位移及斜坡下降位移相等。
4.一种检测离体鼠胫骨钙的激光共聚焦同步应力加载装置，其特征在于，包括依次轴向连接的线性促动器、压力传感器、组织固定器、信号采集和处理模块，其中，组织固定器用于夹持鼠胫骨试样并置于一个盛有细胞培养液的腔室中，腔室的底部为石英晶片，组织固定器的一端固定，另一端通过线性促动器在鼠胫骨试样上产生轴向的压缩载荷；石英晶片下方设有激光共聚焦显微镜镜头，激光共聚焦显微镜发射的荧光通过石英晶片到达鼠胫骨试样组织中的任意层面，通过捕获反射光从而观测骨细胞的原位钙信号；所述信号采集和处理模块将离体鼠胫骨应力、位移和应变电信号进行调制放大后进行转换，再通过PC中的Labview控制程序通过运动控制器控制线性促动器的动作。
5.如权利要 求4所述的检测离体鼠胫骨钙的激光共聚焦同步应力加载装置，其特征在于，所述的组织固定器固定端通过线性轴承固定。
全文摘要
本发明公开了一种检测离体鼠胫骨钙的激光共聚焦同步应力加载方法及装置，其特征在于，将鼠胫骨固定于一个腔室中的组织固定器中间，腔室内充以细胞培养液，一个激光共聚焦显微镜镜头通过腔室下面的石英晶片，每5秒进行一次面扫描，将胫骨前内侧平坦区域的钙在显微镜中成像；组织固定器的一端固定，另外一端施以动态、周期的应力加载方式作用于鼠胫骨产生轴向的压缩载荷，使胫骨前内侧的钙成像表面同时产生轴向的压缩形变和垂直于轴向的弯曲形变。本发明能够显著抑制周期载荷作用引起的激光共聚焦显微镜焦点偏移，使精确的采集和测量应力诱发的原位骨细胞钙信号响应成为可能，从而有利于揭示骨力学信号转导、骨适应及骨质酥松症发生的相关机理。
文档编号G01N21/64GK103245645SQ201310132379
公开日2013年8月14日 申请日期2013年4月17日 优先权日2013年4月17日
发明者景达, 罗二平, 郭向东, 申广浩, 姜茂刚, 李飞江, 谢康宁, 吴小明, 汤池, 郭伟 申请人:中国人民解放军第四军医大学