专利名称：抗Cyfip蛋白的单克隆抗体及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及抗Cyfip蛋白的单克隆抗体,产生该抗体的杂交瘤细胞株及其制备和应用。
背景技术：
脆性X染色体综合症是人类常见的遗传性智力发育迟滞疾病，在男性人群中的发病率为 1/3000 4000，女性人群中约为 1/6000 1/8000 (Hantash et al.,2010)。研究认为，脆性X智力低下蛋白(Fragile X mental retardation protein, FMRP)缺失是导致该疾病症候群的主要原因(P印rah，2012 ;Santoro et al.，2012)。FMRP主要在神经系统富集，已有的研究结果提示FMRP通过识别结合特殊的RNA结构，调控其靶mRNA的运输、翻译和/或稳定，从而在神经突触发挥功能(Schaeffer et al.，2001)。然而，到目前为止，FMRP究竟通过什么分子机制造成脆性X染色体综合症的一系列病理变化仍然不清楚。Schenck等人2001年的研究中报道了一个在胞质内与FMRP互作的蛋白Cyfip(cytoplasmic FMRP interacting protein) (Schenck et al., 2001) 根据对已知序列的分析,Cyfip属于一个保守的蛋白家族。人类有两个同源蛋白，分别称为Cyfipl和Cyfip2,它们同小鼠中相应的同源蛋白具有98.7%的序列一致性和99.9%的相似性。在果蝇和线虫中各有一个Cyfip同源蛋白，与人类的蛋白序列比对分别具有67%和51%的一致性。目前对Cyfip功能的认识还十分有限。在对多发性硬化病人的研究中发现，Cyfip2在T细胞中过高表达导致T细胞运动减弱，推测这与多发性硬化病理过程中神经炎性、脱髓鞘、轴突缺失等病理变化密切相关(Mayne et al.,2004)。在果蝇和线虫的研究中也发现Cyfip缺失会造成神经轴突生长导向障碍(Bogdan et al., 2004 ；Kawano et al., 2005 ；Schenck etal., 2003) ο 另一方面，Cyf ip 还能特异性的与 Rho GTPase Racl 结合(Kobayashi et al.,1998)，提示Cyfip可能 还参与了 Rho GTPase信号途径，而这一途径中也有数个成员与人类智力低下疾病密切相关(Vaillend et al.,2008)。由此可见，Cyfip对神经系统的发育和功能起着非常重要的作用。然而，Cyfip究竟如何发挥功能，它如何参与FMRP介导的局部翻译调控途径和GTPase介导的细胞骨架调控途径，以及这两条途径之间如何相互作用调控神经系统的发育和功能仍然不清楚。所以，Cyfip为研究神经发育和功能的调控提供了新的切入点。同时，作为一个进化上十分保守的蛋白，对Cyfip功能的研究也为了解人类智力低下疾病的病因病理提供了线索。为了研究Cyfip的功能，Schenck等以及Bogdan等分别独立制备了针对果蝇Cyfip蛋白的兔源多克隆抗体，这两个多抗能够识别果蝇胚胎的内源Cyfip蛋白(Bogdanet al., 2004 ；Schenck et al.,2003)。然而,众所周知，与单克隆抗体相比多克隆抗体还是有一些局限性。首先，多抗是多种种类和亚类的免疫球蛋白的混合物，所以即便是使用相同抗原制备的不同批次的多抗也不能保证其一致性；而单抗只有一种免疫球蛋白亚类，是纯度很高的均一抗体，每个抗体的化学结构和氨基酸顺序都相同，单抗一旦制备成功就可以永续生产完全一致的抗体。其次，多抗能与抗原上的多种抗原决定簇结合，所以特异性较差，较易引起交叉反应；而单抗针对抗原的单一的决定簇，所以特异性强，敏感性高，一般不发生交叉反应。加之考虑到免疫沉淀、免疫荧光、细胞免疫化学以及免疫组化等试验对抗体的应用要求，制备针对Cyfip蛋白的单克隆抗体是目前研究Cyfip功能的首要任务。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种杂交瘤细胞，其保藏编号为CGMCC N0.7409。本发明的另一个目的是提供由杂交瘤细胞CGMCC N0.7409分泌得到的单克隆抗体。本发明的还一个目的是提供所述单克隆抗体在检测或标记Cyfip蛋白中的应用。本发明的再一个目的是提供所述单克隆抗体在制备检测或标记Cyfip蛋白的产品中的应用。具体的,所述Cyfip蛋白为果蝇内源Cyfip蛋白。本发明制备了针对果蝇Cyfip蛋白N端1-300氨基酸的鼠源单克隆抗体。单抗制备过程如图1所示，简而言之:设计免疫原序列并使用免疫原免疫动物(Balb/c小鼠)，取尾血检测后选择滴度高的小鼠进行杂交瘤细胞融合，筛选阳性杂交瘤细胞株并克隆化，验证后收集纯化单克隆抗体并冻存细胞株。经酶联免疫吸附(ELISA)试验初筛复筛后得到6个阳性单克隆抗体(如图2所示)，其中2F5单抗具有较高的灵敏度(如图4所示)。蛋白免疫印迹(Western Blot)实验检测证实6个单抗都能识别体外重组的Cyfip抗原(如图3所示)。挑选2F5单抗进一步纯化，纯化后的单抗在Western Blot检测正常果蝇大脑提取物中识别单一目的条带，而在Cyfip缺失的突变体果蝇中不能检测出条带(如图5所示)。免疫组化染色实验显示，在神经系统过表达Cyfip的果蝇中，2F5单抗能够清晰的标记大脑腹侧神经节中规则排列的神经元胞体(如图6中右侧图片所示)。综上所述，本发明制备的鼠源单克隆抗体2F5能够特异地检测和标记果蝇内源的Cyfip蛋白。
图1为单克隆抗体制备的流程图。图2为6个抗Cyfip蛋白单克隆抗体的ELISA实验结果及相应的OD值，其中*表示超出测量上限。图3为6个抗Cyfip蛋白单克隆抗体识别体外重组Cyfip蛋白的Western Blot检测结果图4为抗Cyfip蛋白单克隆抗体2F5的灵敏度检测及相应OD值，其中*表示超出测量上限。图5为抗Cyfip蛋白单克隆抗体2F5识别野生型和cyfip基因缺失突变体果蝇大脑蛋白中Cyfip蛋白的Western Blot结果,其中WT表示野生型果蝇,cyffip表示cyfip基因缺失突变体果蝇cyfip851。图6为抗Cyfip蛋白单克隆抗体2F5识别野生型和在神经系统内过量表达Cyfip蛋白的果蝇大脑腹侧 神经节中Cyfip蛋白的免疫荧光标记结果，其中WT表示野生型果蝇，cyfipN0E表示在神经系统内过量表达Cyfip蛋白的果蝇。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、分泌抗Cyfip蛋白单克隆抗体的杂交瘤的制备单克隆抗体制备的流程图如图1所示，具体步骤如下所述:1.免疫小鼠小鼠的选择:选择与所用骨髓瘤细胞同源的Balb/c健康雌性小鼠，鼠龄在8 12周。免疫原的制 备:以Cyfip蛋白N端第1_300氨基酸残基和组氨酸标签的体外重组蛋白作为免疫原。Cyfip蛋白N端第1-300氨基酸残基的具体氨基酸序列为SEQ ID N0.1所示。重组Cyfip蛋白的具体制备方法如下:人工合成SEQ ID N0.2所示基因。将SEQ ID N0.2所示基因插入表达载体pET30a的EcoR I和Xhol酶切位点间，得到重组表达载体，记作重组表达载体CYl-His。将重组表达载体导入宿主菌BL-21，得到重组菌。重组菌扩大培养，诱导表达后收集菌体，镍柱亲和层析纯化得到重组蛋白。用免疫原多次免疫上述Balb/c健康雌性小鼠，采小鼠尾静脉血清测效价，选取血清效价高的阳性小鼠用于细胞融合。2.细胞融合免疫小鼠处死，取脾脏制备脾细胞悬液，稀释计数待用。取生长状态良好的(活细胞数> 95% )骨髓瘤细胞，稀释计数待用。脾细胞与骨髓瘤按比例混合，加入助融剂搅拌细胞。终止融合后，细胞重悬，培养观察。HAT培养液筛选杂交细胞，在HAT培养基中生长的细胞为发生了细胞融合的杂交瘤细胞。3.筛选分泌抗体的杂交瘤细胞融合后当杂交细胞集落生长到一定大小，收集上清，用酶联免疫吸附(ELISA)法和Western Blot方法检测抗体识别体外重组Cyfip蛋白的活性，从而得到分泌识别重组Cyfip蛋白的抗体的杂交瘤细胞。酶联免疫吸附(ELISA)法的检测结果如图2所示。WesternBlot方法检测结果如图3所示。结果共筛选到6个分泌抗重组Cyfip蛋白的抗体的杂交瘤细胞，其中，2F5杂交瘤细胞分泌的单抗的免疫性和特异性较强。将2F5杂交瘤细胞进行保藏，保藏中心的名称是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2013年4月3日，保藏编号为CGMCC N0.7409，分类命名为小鼠杂交瘤细胞。实施例2、单抗的制备及性能检测一、单抗的制备1.老鼠致敏液体石蜡致敏Balb/c小鼠，6 8周，注射体积500ul/只。10天后可制备腹水。2.注射细胞收集杂交瘤细胞并用1640或PBS洗细胞两遍，取100到150万细胞注射于老鼠腹腔，一周后可见老鼠状态不活跃并且老鼠的腹腔肿大
3.腹水采集注射细胞一周后用无菌注射器于老鼠腹腔采集腹水，每隔一到两天采集一次，这样多次反复采集直到老鼠自然死亡。采集到的腹水用PiOtein-G免疫亲和层析方法进行纯化得到单克隆抗体。二、单抗的灵敏度检测使用酶联免疫吸附(ELISA)法对单抗的灵敏度进行检测。1.抗原包被Cyfip重组蛋白(即实施例1制备的免疫原)用包被液稀释后按100、30、10、3ng/孔的梯度加入聚苯乙烯酶联检测板相应孔中，4°C包被过夜后，洗液洗涤3次。2.封闭每孔加200 μ I封闭液，37°C两小时(或4°C过夜)后，洗涤3次，拍干。3.ELISA 检测Cyfip单抗稀释1000倍后100 μ I/孔加入包被好的酶标板，取小鼠心血同比稀释作为阳性对照，以5% miIk-PBS为阴性对照，37°C孵育30min，洗涤3次，拍干。羊抗鼠IgG (H+L)酶标二抗37°C孵育30min，洗涤3次，拍干。加入等体积显色液A液、B液37°C显色15min，反应结束后加入终止液。4.读数以450nm单波长 测定各孔OD值，以与阴性对照孔OD值的比值大于2.1为限，作为判断为阳性的标准。结果如图4所示。结果表明，本发明单抗的最低检测限至少可达到0.03μ g/ml。三、单抗的特异性检测1.蛋白样品制备分别解剖野生型果蝇和突变体果蝇幼虫大脑，加入裂解液研磨匀浆，分装保存备用。突变体果蚬幼虫为cyfip85.1,记载在文献“CYFIP/Sra-lcontrols neuronalconnectivity in Drosophila andlinks the RaclGTPase pathway to the Fragile Xprotein.(Schenck et al.，2003) ”中。现有技术中记载:野生型果蝇幼虫大脑中含有Cyfip蛋白，突变体果蝇幼虫大脑中不含有Cyfip蛋白。2.跑胶配制分离胶、浓缩胶，制胶板。蛋白样品加上样缓冲液煮沸变性，加入胶孔，置于电泳槽中恒定电压电泳分离。3.转膜PVDF膜置甲醇中浸泡饱和，滤纸、海绵置转膜缓冲液中浸泡平衡。胶取出适当裁修，置转膜缓冲液中浸泡。按海绵-滤纸-胶-膜-滤纸-海绵的顺序组装，胶置于负极恒定电流转膜。4.免疫杂交与显色PBST缓冲液洗膜，5%脱脂牛奶封闭。取实验一用杂交瘤细胞2F5制得的单抗，单抗的起始浓度为5.007mg/ml，l: 500稀释，室温孵育2小时或4°C过夜。辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗室温孵育I小时，发光工作液显色，曝光。结果见图5，2F5单抗在正常果蝇大脑提取物中识别单一目的条带，而在Cyfip缺失的突变体果蝇中不能检测出条带。Western检测结果显示本发明制备的鼠源单克隆抗体2F5能够特异地检测果蝇内源的Cyfip蛋白。四、单抗的应用1.免疫组化染色样品制备分别挑选野生型和突变体爬山试管壁的三龄果蝇幼虫，在解剖盘上置于HL3解剖液中解剖出大脑及腹侧神经节，4%多聚甲醛室温固定30分钟，随即用含0.3% Triton的PBST缓冲液清洗。过表达果蝇幼虫为cyfip.，记载在文献“CYFIP/Sra-lcontrolsneuronal connectivity in Drosophila and links the Racl GTPase pathway to theFragile X protein.(Schenck et al.，2003)”中。现有技术中记载:野生型果蝇幼虫大脑中含有Cyfip蛋白，过表达果蝇cyfipN°E在神经系统内过量表达Cyfip蛋白。2.染色2F5单抗室温孵育3小时(或4°C过夜)，PBST缓冲液清洗，荧光标记的羊抗鼠二抗室温2小时，PBST缓冲液清洗。3.封片观察 染色完成的样品置载玻片上，加封片剂封片，在共聚焦显微镜下观察拍摄，结果见图6。如图6右侧图片所示，在神经系统过表达Cyfip蛋白的果蝇cyfipN°E中，2F5单抗能够清晰的标记大脑腹侧神经节中规则排列的神经元胞体。尽管在图6左侧图片显示的野生型果蝇中并没有观察到类似的结果，这可能是由于免疫组化实验的灵敏度范围有限造成的，要检测到荧光信号需要一定量蛋白在观察区域的富集，推测野生型果蝇大脑神经元中的Cyfip蛋白量很少,2F5单抗识别并标记Cyfip蛋白，但是很弱的突光信号不能达到实验的检出限；而当在果蝇神经系统内过量表达Cyfip蛋白时,2F5单抗标记Cyfip蛋白并且信号强度足以能被检测到。
权利要求
1.一种杂交瘤细胞，其保藏编号为CGMCC N0.7409。
2.由杂交瘤细胞CGMCCN0.7409分泌得到的单克隆抗体。
3.权利要求2所述单克隆抗体在检测或标记Cyfip蛋白中的应用。
4.权利要求2所述单克隆 抗体在制备检测或标记Cyfip蛋白的产品中的应用。
全文摘要
本发明公开了鼠源抗Cyfip蛋白的单克隆抗体及分泌该抗体的杂交瘤细胞。本发明所提供的杂交瘤细胞，其保藏编号为CGMCC No.7409。Western检测结果证明本发明制备的鼠源单克隆抗体2F5能够特异地识别果蝇大脑中Cyfip蛋白，为深入研究Cyfip蛋白功能奠定基础。
文档编号G01N33/577GK103224912SQ20131016697
公开日2013年7月31日 申请日期2013年5月8日 优先权日2013年5月8日
发明者赵璐, 张永清 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所