专利名称：一种肺表面活性物质相关蛋白a适配子及其筛选方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，尤其是一种肺表面活性物质相关蛋白A适配子及其筛选方法。
背景技术：
肺表面活性物质相关蛋白A (Surfactant Protein A, SP_A)是一种多功能糖蛋白，在调节肺表面活性物质(PS)代谢、基因表达、肺内免疫及炎症反应方面具有十分重要作用。SP-A主要在肺泡II型上皮细胞中合成，在肺外表达量很少，在肺内则为高浓度表达，表现为肺特异性。其表达水平的高低与临床某些肺部疾病直接相关，是某些肺部疾病的特异性诊断和判断预后的指标。很多肺部疾病在早期依据临床表现、X线征象以及一些创伤性检查，难以做到早期诊断并评价肺泡一毛细血管屏障损伤程度。近年来很多实验表明，血清SP-A是反映肺功能障碍和血气屏障损伤敏感而可靠的指标。当疾病导致肺部损伤后，肺内SP-A可通过损伤的肺泡一毛细血管膜屏障进入血液循环而成为肺损伤的血清标志物。血清中SP-A的量和肺损伤程度密切相关，肺部损伤越重血清中SP-A浓度就越高，检测患者血循环中SP-A水平可以判断肺损伤程度，预测疾病转归情况。但是目前检测SP-A的方法都较为繁琐。指数式富集的配体系统进化(Systematicevolution of ligands byexponential enrichment, SELEX)技术是一种新的组合化学技术,应用大容量的随机寡核苷酸，并结合PCR体外扩增技术，以指数级富集与靶分子特异结合的寡核苷酸，经几轮或数轮的筛选过程，获得高亲和力、高特异性的核酸配基。在实验诊断和临床治疗的分子识别领域，它提供了一个比抗体更快速、灵敏的技术手段。目前，该技术已成功应用于许多靶物质的筛选，包括蛋白、小分子、金属离子，甚至病毒、细菌、细胞等一些复杂靶标，部分核酸适配子已进入临床试验阶段。
通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种与SP-A结合率高、特异性强的肺表面活性物质相关蛋白A适配子及其筛选方法。本发明实现目的的技术方案是:—种肺表面活性物质相关蛋白A适配子，其基因序列为:SEQ ID No: 1，或 SEQ ID No:2，或 SEQ ID No:3。而且，其二级结构为:
权利要求
1.一种肺表面活性物质相关蛋白A适配子，其特征在于:其基因序列为:SEQ ID No: 1，或 SEQ ID No:2，或 SEQ ID No:3。
2.根据权利要求1所述的肺表面活性物质相关蛋白A适配子，其特征在于:其二级结构为:
3.—种如权利要求1或2所述的肺表面活性物质相关蛋白A适配子的筛选方法，其特征在于:步骤如下: ⑴SELEX筛选:SP-A蛋白包被于96孔酶联板上，包被液为pH9.6,0.05mol/LNaHCO31OOuL，于4 °C过夜，同时设空白对照孔；SP-A蛋白包被孔和空白对照孔均以质量分数3%的BSA200uL37°C封闭2h ;取IOOOpmol随机ssDNA与IOOuL结合缓冲液与经3%BSA封闭的空白对照孔37°C结合45min，反筛去除与BSA结合的ssDNA，转移到SP-A蛋白包被孔与SP-A蛋白37°C结合45min ;然后用200uL冲洗缓冲液洗去未结合的ssDNA ;再加200uL洗脱缓冲液于80°C作用lOmin，洗脱下与SP-A蛋白结合的ssDNA，取200uL酚:氯仿抽提，乙醇沉淀，将ssDNA溶解于20 X TE缓冲液中； ⑵PCR优化: PCR反应体系为:钽分wmssDNAIuL;上游fj丨物IOuM0.5uL卜'游'j丨物IOuMOJuLdNTPs IOuM0.5uLI OxPCE Buffer2.5uL Tacj 聚介ft 2U/uL 0.5uLCtdH2O19.5iiL总律系25uL;PCR 反应条件:A.94°C，3min ；B.94°C，45s, 55°C，30s ；72°C，40s ;共 12 个循环；C.72°C，7min ； ⑶适配子亲和力及特异性检测:将带有SP-A适配子序列的克隆质粒进行PCR扩增，切胶回收，纯化PCR产物，将5ug SP-A蛋白包被于96孔板上，37°C孵育2h，取IOug纯化物与400uL结合缓冲液混合，加入到蛋白孔中结合30min，然后用洗脱缓冲液洗去未结合ssDNA，再加入50uL洗脱缓冲液，80°C孵育lOmin，洗脱下与蛋白结合的ssDNA，测定其含量，分析各适配子的亲和力；根据适配子亲和力测定结果，筛选出亲和力高的几个适配子按上述过程将各适配子分别与SP-A及BSA进行结合反应，通过适配子对两种蛋白亲和力的不同判断其特异性； ⑷克隆与测序及适配子结构分析:经9轮筛选得到的ssDNA，经PCR扩增成dsDNA，回收纯化后连PuClS载体，经蓝白斑筛选，挑选亲和力及特异性高的3个克隆进行序列测定，使用DNAMAN软件分析，即得肺表面活性物质相关蛋白A适配子。
4.根据权利要求3所述的筛选方法，其特征在于:所述步骤⑴中结合缓冲液为SHCMK液:20mmol/L Hepes pH7.35,5mmol/L KCl,120mmol/L NaCl,lmmol/L MgCl2,lmmol/LCaCl2。
5.根据权利要求3所述的筛选方法，其特征在于:所述步骤⑴中冲洗缓冲液为SHCMK液与质量分数为0.05%的TWeen20的混合液，Vshcmk:Vlween20为20:1。
6.根据权利要求3所述的筛选方法，其特征在于:所述步骤⑴中洗脱缓冲液为:20mmol/L Tris-Hcl,4mol/L 异硫氰酸狐，lmmol/L DTT, ρΗ8.3。
7.根据权利要求3所述的筛选方法，其特征在于:所述步骤⑴中酚:氯仿的体积比为1:1。
8.根据权利要求3所 述的筛选方法，其特征在于:所述步骤⑶中克隆质粒的制备方法为:将第9轮筛选SP-A适配子进行扩增，产物纯化后与PuClS载体分别进行双酶切，再将两者的双酶切产物在16°C条件下过夜连接，将连接产物转入大肠杆菌中，即得。
全文摘要
本发明涉及一种肺表面活性物质相关蛋白A适配子，其基因序列为SEQ ID No:1，或SEQ ID No:2，或SEQ ID No:3。本发明以SP-A蛋白为靶分子，利用指数富集配基系统进化法技术从随机ssDNA文库筛选SP-A特异结合的寡核苷酸适配子，并对所筛选出的适配子结构进行了初步分析，为进一步筛选以寡核苷酸适配子为基础的肺疾病治疗药物奠定基础。
文档编号G01N33/68GK103243102SQ201310187180
公开日2013年8月14日 申请日期2013年5月20日 优先权日2013年5月20日
发明者张娟琨, 刘利娟, 陈怡 申请人:天津前方科技有限公司