一种鳞状上皮细胞癌抗原生物传感器的制备方法及应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种鳞状上皮细胞癌抗原生物传感器的制备方法及应用，属于新型纳米功能材料与生物传感【技术领域】。具体是基于氮掺杂石墨烯（N-GS）和Pd-Au/C负载型纳米催化剂，制备一种鳞状上皮细胞癌抗原的夹心型电化学免疫传感器，用于检测血清中的鳞状上皮细胞癌抗原。其特征在于：（1）氮掺杂石墨烯的制备；（2）Pd-Au/C-鳞状上皮细胞癌抗原的二抗复合物的制备；（3）电化学免疫传感器的制备。Pd-Au/C对H2O2具有很强的催化能力，有利于固定更多的二抗、保持物质生物活性，本发明制备的传感器优点在于，灵敏度高、特异性好、易于操作、检测限低。
【专利说明】一种鳞状上皮细胞癌抗原生物传感器的制备方法及应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种鳞状上皮细胞癌抗原生物传感器的制备方法及应用。具体是基于氮掺杂石墨烯(N-GS)和Pd-Au/C负载型纳米催化剂(Pd-Au/C)，制备一种鳞状上皮细胞癌抗原的夹心型电化学免疫传感器，用于检测血清中的鳞状上皮细胞癌抗原，属于新型纳米功能材料与生物传感【技术领域】。
【背景技术】
[0002]鳞状上皮细胞癌抗原(SCCA)是一种TA-4的亚型，并且属于丝氨酸蛋白酶抑制剂的卵白蛋白家族，广泛存在于不同器官正常组织(含量极微)和恶性病变的上皮细胞中，是一种诊断鳞癌的肿瘤标志物，本发明基于氮掺杂石墨烯(N-GS)以及Pd-Au/C制备鳞状上皮细胞癌抗原夹心型免疫传感器。
[0003]N-GS为一种通过化学方法，将石墨烯上的部分碳原子替换为氮原子后的一种物质。所谓“掺杂”，是指氮原子与碳原子在石墨烯上骨架上共存的一种状态，具有高的还原水平，并且在多种溶剂中具有良好的分散性。N-GS是透明的薄纱状结构，并且具有大比表面积和良好的导电性。因此，由于N-GS具有良好的信号放大作用，使得N-GS被广泛用于制作电子的传输介质的电化学免疫传感器。
[0004]Pd-Au/C负载型纳米催化剂是一种活性碳负载的Pd-Au双金属合金催化剂，本发明利用Pd-Au/C负载型纳米催化剂作为二抗标记物，有利于固定更多的二抗、保持物质生物活性，并且对H2O2具有很强的催化能力。本发明制得的生物传感器的响应电流与SCCA浓度在0.0050~2.0 ng/mL范围内保持良好的线性关系，检测限为1.6 pg/mL。
[0005]本发明制备的传感器具有灵敏度高、特异性好、检测成本低、能快速检测鳞状上皮细胞癌抗原等优势，有效克服了目前鳞状上皮细胞癌抗原检测方法的不足。
【发明内容】
[0006]本发明的目的之一在于提供了一种快速准确检测鳞状上皮细胞癌抗原的电化学免疫传感器的制备方法。
[0007]本发明的目的之二是将该电化学免疫传感器应用于鳞状上皮细胞癌抗原的检测。
[0008]为了实现上述目的，本发明是通过以下措施来实现的。
[0009]一种鳞状上皮细胞癌抗原生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤:
(1)氧化石墨烯的合成
在 0.1 ~0.6 g 石墨和 0.6 ~4.0g KMnO4 中加入 40 mL、H2SO4-H3PO4 混合溶液，H2SO4和H3PO4体积比9:1，加热至40-60 V，持续12h，停止反应冷却到室温，在冰水浴中加入0.1~0.5 mL、体积分数为30%的H2O2，磁力搅拌30~60 min，将混合物离心，分别用0.2mol.L-1 HCl,乙醇，乙醚进行洗涤，洗涤2次；
(2)氮掺杂石墨烯(N-GS)的合成
将氧化石墨烯分散于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，配成0.5~2.0 mg/mL溶液，超声30~60 min，将混合液在120~160 °C条件下，搅拌回流I~2 h，冷却到室温，在9000 r/min的转速下离心,50~60 °C真空干燥；
(3)钯-金/碳(Pd-Au/C)的合成
30 ~100 mg 活性碳，1.0 ~5.0 mL、0.50 mo 1.171 的 PdCl2 溶液，0.5 ~1.0 mL、质量分数为1%的HAuCl4溶液，依次加入5mL水和5mL四氢呋喃，超声0.5h混匀，磁力搅拌 12 h，缓慢加入 10 ~30 mL 含有 0.1 mo 1.L-1NaBH4 和 0.05 mo 1.L-1Na2CO3 的混合溶液，磁力搅拌I h，得到的固体依次用水和乙醇进行洗涤，洗涤完成后50~60 °C下真空干燥，制得钮-金/碳纳米材料(Pd-Au/C)；
(4)Pd-Au/C-鳞状上皮细胞癌抗原二抗(Ab2)的制备
分别配制Pd-Au/C溶液和Ab2溶液，将Pd-Au/C溶液和Ab2溶液按1:1~2的体积比进行混合，在10°C的光照培养箱内孵化震荡12~24 h，制得的Pd-Au/C-Ab2，用pH = 7.4磷酸盐缓冲溶液清洗，保存在4 0C的冰箱内备用。
[0010]所述的Pd-Au/C溶液的浓度为5~15 mg.πι?Λ所述的Ab2溶液的浓度为5~15μ g.mL 1 ο
[0011](5)电化学免疫传感器的制备方法
1)将直径4mm的玻碳电极依次用1.0,0.3和0.05 mm的三氧化二铝抛光粉抛光处理，乙醇超声清洗，再用超纯水冲洗干净，然后将电极置于5~10 mmol.l-1铁氰化钾溶液中，在一0.2~0.6 V电位下扫描，使峰电位差小于90 mV ；
2)将6μ?、0.4~2.0 mg .ml-1的N-GS溶液滴涂于电极表面，滴加3μ?、2.5%的戊二醛溶液于电极表面，室温干燥；
3)将6μ?、5~15μ g.ml-1的鳞状上皮细胞癌抗原一抗(Ab1)滴涂到步骤2) N-GS修饰的电极表面，置于4°C湿润条件下晾干，洗涤；
4)将浓度为3μ?、100μg.mL—1牛血清白蛋白滴涂到步骤3) Ab1修饰的电极表面，4°C下湿润条件下晾干；
5)将6μ?的鳞状上皮细胞癌抗原(SCCA)分别滴涂在步骤4)牛血清白蛋白修饰的电极表面，4°C下湿润条件下晾干，洗涤；
6 )将6μ?的Pd-Au/C-Ab2滴涂在步骤5 )SCCA修饰的电极表面，4°C下湿润条件下晾干，电化学免疫传感器制备完成。
[0012](6)所述制备的电化学免疫传感器用于SCCA的检测，步骤如下:
1)采用0.066 mo I.L_\ pH = 7.4的磷酸盐缓冲溶液,配制在5pg.mL-1~2ng.mL—1范围内不同浓度的SCCA溶液，将6 μ L不同浓度的SCCA溶液分别滴涂至上述步骤4)牛血清白蛋白修饰的电极表面，晾干后，按照步骤6)修饰电极，连接至电化学工作站中，分别将电极置于10 mL含有3~6 mmol.mL—1 H2O2的pH=6.8的PBS缓冲溶液中测定其电流变化；
2)根据所得电流差值与SCCA浓度呈线性关系，绘制工作曲线；
3)依据工作曲线的绘制方法进行样品检测，检测结果从工作曲线中查得。
[0013]本发明的有益成果
(I)鳞状上皮细胞癌抗原生物传感器，将N-GS引入到鳞状上皮细胞癌抗原生物的制备当中，利用N-GS良好的电子传递能力，显著改善了电极的性能。
[0014](2)将Pd-Au/C与肿瘤标志物二抗直接孵化，利用钯金优异的生物相容性和高的催化性能，在二抗的标记物中不必使用酶，避免了因酶的失活和泄漏造成的检测误差，简化了二抗标记物的制作步骤，显著提高了电化学免疫传感器的重现性和稳定性。
[0015](3)本发明所制备的电化学免疫传感器，操作简单，检测速度快，可在短时间内实现批量样品的测定。
【具体实施方式】
[0016]实施例1氧化石墨烯的合成
在 0.1 ~0.6 g 石墨和 0.6 ~4.0g KMnO4 中加入 40 mL、H2SO4-H3PO4 混合溶液，H2SO4和H3PO4体积比9:1，加热至40-60 V，持续12h，停止反应冷却到室温，在冰水浴中加入
0.1~0.5 mL、体积分数为30%的H2O2，磁力搅拌30~60 min，将混合物离心，分别用0.2mo I.L1 HCl，乙醇，乙醚进行洗涤，洗涤2次。
[0017]实施例2氮掺杂石墨烯(N-GS)的合成
将氧化石墨烯分散于N, N-二甲基甲酰胺(DMF)中，配成0.5 mg/mL溶液,超声30 min,将混合液在120 °C条件下，搅拌回流I h，冷却到室温，在9000 r/min的转速下离心，50 V真空干燥。
[0018]实施例3氮掺杂石墨烯(N-GS)的合成
将氧化石墨烯分散于N, N-二甲基甲酰胺(DMF)中，配成2.0 mg/mL溶液,超声60 min,将混合液在160 °C条件下，搅拌回流2 h，冷却到室温，在9000 r/min的转速下离心，60 V
真空干燥。
[0019]实施例4氮掺杂石墨烯(N-GS)的合成
将氧化石墨烯分散于N, N-二甲基甲酰胺(DMF)中，配成1.0 mg/mL溶液,超声50 min,将混合液在140 °C条件下，搅拌回流1.5h，冷却到室温，在9000 r/min的转速下离心，55°C
真空干燥。
[0020]实施例5钯-金/碳(Pd-Au/C)的合成
30 mg 活性碳，1.0 mL、0.50 mo 1.171 的 PdCl2 溶液，0.5 mL、质量分数为 1% 的 HAuCl4溶液，依次加入5mL水和5mL四氢呋喃，超声0.5 h混匀，磁力搅拌12 h，缓慢加入IOmL含有0.1 mo 1.L-1NaBH4和0.05 mo 1-T1Na2CO3的混合溶液，磁力搅拌I h，得到的固体依次用水和乙醇进行洗涤，洗涤完成后50 °C下真空干燥，制得钯-金/碳纳米材料(Pd-Au/C)。[0021 ] 实施例6钯-金/碳(Pd-Au/C)的合成
100 mg 活性碳，5.0 mL,0.50 mo I ?L1 的 PdCl2 溶液，L O mL、质量分数为 1% 的 HAuCl4溶液，依次加入5mL水和5mL四氢呋喃，超声2 h混匀，磁力搅拌12 h，缓慢加入30 mL含有0.1 mo 1.L-1NaBH4和0.05 mo 1-T1Na2CO3的混合溶液，磁力搅拌I h，得到的固体依次用水和乙醇进行洗涤，洗涤完成后60 °C下真空干燥，制得钯-金/碳纳米材料(Pd-Au/C)。
[0022]实施例7钯-金/碳(Pd-Au/C)的合成
60 mg 活性碳，3.0 mL、0.50 mo I.L—1 的 PdCl2 溶液，0.7 mL、质量分数为 1% 的 HAuCl4溶液，依次加入5mL水和5mL四氢呋喃，超声1.0 h混匀，磁力搅拌12 h，缓慢加入20mL含有0.1 mo 1.L-1NaBH4和0.05 mo 1-T1Na2CO3的混合溶液，磁力搅拌I h，得到的固体依次用水和乙醇进行洗涤，洗涤完成后55 °C下真空干燥，制得钯-金/碳纳米材料(Pd-Au/C)。
[0023]实施例8 Pd-Au/C-鳞状上皮细胞癌抗原二抗(Ab2)的制备分别配制Pd-Au/C溶液和Ab2溶液，将Pd-Au/C溶液和Ab2溶液按1:1的体积比进行混合，在10°C的光照培养箱内孵化震荡12 h，制得的Pd-Au/C-Ab2，用pH = 7.4磷酸盐缓冲溶液清洗，保存在4 V的冰箱内备用。
[0024]实施例9 Pd-Au/C-鳞状上皮细胞癌抗原二抗(Ab2)的制备
分别配制Pd-Au/C溶液和Ab2溶液，将Pd-Au/C溶液和Ab2溶液按1: 2的体积比进行混合，在10°C的光照培养箱内孵化震荡24 h，制得的Pd-Au/C-Ab2，用pH = 7.4磷酸盐缓冲溶液清洗，保存在4 V的冰箱内备用。
[0025]实施例10 Pd-Au/C-鳞状上皮细胞癌抗原二抗(Ab2)的制备
分别配制Pd-Au/C溶液和Ab2溶液，将Pd-Au/C溶液和Ab2溶液按1:1.5的体积比进行混合，在10°C的光照培养箱内孵化震荡18 h，制得的Pd-Au/C-Ab2，用pH = 7.4磷酸盐缓冲溶液清洗，保存在4 V的冰箱内备用。
[0026]实施例11电化学免疫传感器的制备
(1)将直径4mm的玻碳电极依次用1.0、0.3和0.05 mm的三氧化二铝抛光粉抛光处理，乙醇超声清洗，再用超纯水冲洗干净，然后将电极置于5~10 mmol.L-1铁氰化钾溶液中，在一0.2~0.6 V电位下扫描，使峰电位差小于80 mV ；
(2)将6PL、0.4 mg .mL-1的N-GS溶液滴涂于电极表面，红外灯下干燥后，滴加3μ?、2.5%的戊二醛溶液于电极表面，室温干燥；
(3)将6PL、5Pg-mL的鳞状上皮细胞癌抗原一抗(Ab1)滴涂到步骤(2) N-GS修饰的电极表面，置于4°C湿润条件下晾干，洗涤；
(4)将浓度为3μ?、100μg -mL牛血清白蛋白滴涂到步骤UMb1修饰的电极表面，4° °C下湿润条件下晾干；
(5)将6PL的鳞状上皮细胞癌抗原(SCCA)分别滴涂在步骤(4)牛血清白蛋白修饰的电极表面，4°C下湿润条件下晾干，洗涤；
(6)将6μ?的Pd-Au/C-Ab2滴涂在步骤(5)SCCA修饰的电极表面，4°C下湿润条件下晾干，电化学免疫传感器制备完成。
[0027]实施例12电化学免疫传感器的制备
(1)将直径4mm的玻碳电极依次用1.0、0.3和0.05 mm的三氧化二铝抛光粉抛光处理，乙醇超声清洗，再用超纯水冲洗干净，然后将电极置于5~10 mmol.mL铁氰化钾溶液中，在一0.2~0.6 V电位下扫描，使峰电位差小于80mV ；
(2)将6μ?、2.0 mg -mL的N-GS溶液滴涂于电极表面，红外灯下干燥后，滴加3μ?、2.5%的戊二醛溶液于电极表面，室温干燥；
(3)将6μ?、15μg -mL的鳞状上皮细胞癌抗原一抗(Ab1)滴涂到步骤(2) N-GS修饰的电极表面，置于4°C湿润条件下晾干，洗涤；
(4)将浓度为3μ?、100μg -mL牛血清白蛋白滴涂到步骤(S)Ab1修饰的电极表面，4°C下湿润条件下晾干；
(5)将6PL的鳞状上皮细胞癌抗原(SCCA)分别滴涂在步骤(4)牛血清白蛋白修饰的电极表面，4°C下湿润条件下晾干，洗涤；
(6 )将6μ?的Pd-Au/C-Ab2滴涂在步骤(5 ) SCCA修饰的电极表面，4°C下湿润条件下晾干，电化学免疫传感器制备完成。[0028]实施例13 SCCA的检测
(1)采用0.066 mo I.L_S pH = 7.4的磷酸盐缓冲溶液,配制在5pg.mL-1-2ng.mL—1范围内不同浓度的SCCA溶液，将6 μ?不同浓度的SCCA溶液分别滴涂至实施例12中步骤
(4)牛血清白蛋白修饰的电极表面，晾干后，按照步骤(6)修饰电极，连接至电化学工作站中，分别将电极置于10 mL含有3-6 mmol.mL—1 H2O2的pH=6.8的PBS缓冲溶液中测定其电流变化；
(2)根据所得电流差值与SCCA浓度呈线性关系，绘制工作曲线；
(3)依据工作曲线的绘制方 法进行样品检测，检测结果从工作曲线中查得。
【权利要求】
1.一种鳞状上皮细胞癌抗原生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)氧化石墨烯的合成 在0.1~0.6 g石墨和0.6~4.0g KMnO4中加入40 mL、H2SO4-H3PO4混合溶液，H2SO4和H3PO4体积比9:1，加热至40~60 °C，持续12 h，停止反应冷却到室温，在冰水浴中加入0.1~0.5 mL、体积分数为30%的H2O2，磁力搅拌30~60 min，将混合物离心，分别用0.2mol.L-1 HCl,乙醇，乙醚进行洗涤，洗涤2次； (2)氮掺杂石墨烯(N-GS)的合成 将氧化石墨烯分散于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，配成0.5~2.0 mg/mL溶液，超声30~60 min，将混合液在120~160 °C条件下，搅拌回流I~2 h，冷却到室温，在9000 r/min的转速下离心,50~60 °C真空干燥； (3)钯-金/碳(Pd-Au/C)的合成
30 ~100 mg 活性碳，1.0 ~5.0 mL、0.50 mo 1.171 的 PdCl2 溶液，0.5 ~1.0 mL、质量分数为1%的HAuCl4溶液，依次加入5mL水和5mL四氢呋喃，超声0.5h混匀，磁力搅拌 12 h，缓慢加入 10 ~30 mL 含有 0.1 mo 1.L-1NaBH4 和 0.05 mo 1.L-1Na2CO3 的混合溶液，磁力搅拌I h，得到的固体依次用水和乙醇进行洗涤，洗涤完成后50~60 °C下真空干燥，制得钮-金/碳纳米材料(Pd-Au/C)； (4)Pd-Au/C-鳞状上皮细胞癌抗原二抗(Ab2)的制备； (5)电化学免疫传感器的制备。
2.如权利要求1所述的一种鳞状上皮细胞癌抗原生物传感器的制备方法，其特征在于，所述的Pd-Au/C-Ab2的制备，步骤如下: 分别配制Pd-Au/C溶液和Ab2溶液，将Pd-Au/C溶液和Ab2溶液按1:1~2的体积比进行混合，在10°C的光照培养箱内孵化震荡12~24 h，制得的Pd-Au/C-Ab2，用pH = 7.4磷酸盐缓冲溶液清洗，保存在4 V的冰箱内备用。
3.如权利要求2所述的一种鳞状上皮细胞癌抗原生物传感器的制备方法，其特征在于，所述的Pd-Au/C溶液的浓度为5~15 mg.πι?Λ所述的Ab2溶液的浓度为5~15 Pg
4.如权利要求1所述的一种鳞状上皮细胞癌抗原生物传感器的制备方法，其特征在于，所述的电化学免疫传感器的制备，步骤如下: (1)将直径4mm的玻碳电极依次用1.0、0.3和0.05 mm的三氧化二铝抛光粉抛光处理，乙醇超声清洗，再用超纯水冲洗干净，然后将电极置于5~10 mmol.l-1铁氰化钾溶液中，在一0.2~0.6 V电位下扫描，使峰电位差小于80mV ； (2)将6μ?、0.4~2.0 mg.mL—1的N-GS溶液滴涂于电极表面，红外灯下干燥后，滴加3μ?、2.5%的戍二醒溶液于电极表面,室温干燥； (3)将6μl、5~15μg.mL—1的鳞状上皮细胞癌抗原一抗(Ab1)滴涂到步骤(2) N-GS修饰的电极表面，置于4°C湿润条件下晾干，洗涤； (4)将浓度为3μl、100μg.ml-1牛血清白蛋白滴涂到步骤(S)Ab1修饰的电极表面，4°C下湿润条件下晾干，洗涤； (5)将6PL的鳞状上皮细胞癌抗原(SCCA)分别滴涂在步骤(4)牛血清白蛋白修饰的电极表面，4°C下湿润条件下晾干，洗涤； (6)将6μ?的Pd-Au/C-Ab2滴涂在步骤(5)SCCA修饰的电极表面，4°C下湿润条件下晾干，电化学免疫传感器制备完成。
5.如权利要求1所述的一种鳞状上皮细胞癌抗原生物传感器的制备方法，其特征在于，所述制备的电化学免疫传感器用于SCCA的检测，步骤如下: (1)采用0.066 mo I.L_S pH = 7.4的磷酸盐缓冲溶液,配制在5pg.mL—1-2ng.mL—1范围内不同浓度的SCCA溶液，将6 PL不同浓度的SCCA溶液分别滴涂至权利要求4中步骤(4)牛血清白蛋白修饰的电极表面，晾干后，按照权利要求4中步骤(6)修饰电极，连接至电化学工作站中，分别将电极置于10 mL含有3-6 mmol.mL—1 H2O2的pH=6.8的PBS缓冲溶液中测定其电流变化； (2)根据所得电流差值与SCCA浓度呈线性关系，绘制工作曲线； (3)依据工作曲线的绘制方法进`行样品检测，检测结果从工作曲线中查得。
【文档编号】G01N33/531GK103454417SQ201310396759
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2013年9月4日 优先权日:2013年9月4日
【发明者】魏琴, 吴丹, 张勇, 高健, 李贺, 杜斌, 马洪敏, 李燕 申请人:济南大学