一种基于活性氧自由基水平分析蔬菜重金属污染的方法
【专利摘要】本发明采用激光扫描共聚焦显微镜技术分析蔬菜细胞内活性氧自由基荧光强度，建立了基于活性氧自由基水平的蔬菜重金属污染评价方法。本发明包括以下步骤：1）采用2’,7’-二氯荧光黄双乙酸酯（DCFH-DA）标记蔬菜叶片细胞内活性氧自由基；2）采用激光扫描共聚焦显微镜技术分析蔬菜叶片细胞内活性氧自由基水平；3）将符合国家标准未受污染蔬菜叶片中活性氧自由基荧光强度作为标准荧光强度值，固定仪器采集参数；4）按照上述仪器参数进一步采集需检测蔬菜叶片中荧光强度值，将需要检测的蔬菜荧光强度值和蔬菜标准荧光强度值进行统计分析，确定蔬菜是否受重金属污染。
【专利说明】一种基于活性氧自由基水平分析蔬菜重金属污染的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种基于活性氧自由基水平分析蔬菜重金属污染的方法，属于食品检测【技术领域】。
【背景技术】
[0002]随着工农业的快速发展，工业“三废”的排放和农药、化肥等农用物资的大量使用，使得蔬菜受到不同程度的重金属污染。土壤微生物不能分解重金属，重金属可以在生物体内富集，某些重金属在生物体内将转变成毒性更大的甲基化合物，这些污染物有可能通过食物链以有害浓度在人体内蓄积，严重危害人体健康。因此，有必要对蔬菜中重金属进行分析和评价，对于保证蔬菜质量和保障人们的饮食安全具有重要意义。
[0003]液相色谱、气相色谱和光谱技术是分析蔬菜是否受污染的常规分析方法，但这些方法样品前处理较为复杂，分析程序繁琐。激光扫描共聚焦显微镜是在荧光显微镜成像的基础上加装激光扫描装置，使用紫外光或可见光激发荧光探针，利用计算机进行图像处理。利用激光扫描共聚焦显微镜可以处理活的标本，不会对标本造成物理化学特性的破坏，更接近细胞生活状态参数测定。激光扫描共聚焦显微镜技术可快速分析植物样品、无需繁琐的样品前处理过程。
[0004]荧光显微分析技术和荧光分析仪器在植物细胞学研究中应用广泛，单分子荧光检测在活细胞体系研究中具有重要优势。通过荧光图像分析可测量细胞内游离Ca2+、细胞膜电位、线粒体膜电位、细胞膜磷脂和受体流动性。活性氧自由基是指由氧形成、化学性质活泼、氧化能力很强的几种含氧物质的总称，包括单线态氧、羟自由基、超氧阴离子、过氧化氢等。植物在正常情况下，体内活性氧产生与清除处于平衡状态。而一旦受重金属胁迫，这种平衡就会被破坏，活性氧自由基水平上升。蔬菜中活性氧自由基处于一定水平范围内，而蔬菜一旦受重金属或其他添加剂污染，活性氧自由基水平将发生改变。
[0005]2’，7’ - 二氯荧光黄双乙酸酯(DCFH-DA)本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF，通过检测DCF荧光以判定细胞内活性氧的水平。蔬菜中活性氧自由基荧光强度处于一定水平范围内，而蔬菜一旦受重金属污染，活性氧自由基荧光强度将发生改变。本发明采用DCFH-DA标记蔬菜细胞内活性氧自由基，采用激光扫描共聚焦显微镜技术分析蔬菜细胞内活性氧自由基水平。实际检测过程中，只需采集符合国家标准未受污染蔬菜叶片中活性氧自由基荧光强度(标准荧光强度值)，固定仪器采集参数，将需要检测的蔬菜荧光强度值和蔬菜标准荧光强度值相比较，经统计分析便可以确定蔬菜是否受重金属污染。本发明采用激光扫描共聚焦显微镜技术分析蔬菜细胞内活性氧自由基荧光强度，建立了基于活性氧自由基水平的蔬菜重金属污染评价方法。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种基于活性氧自由基水平评价蔬菜重金属污染的方法。[0007]本发明的目的是提供一种基于活性氧自由基水平评价蔬菜重金属污染的方法，包括如下步骤:1)采用2’，7’ - 二氯荧光黄双乙酸酯(DCFH-DA)标记蔬菜叶片细胞内活性氧自由基；2)采用激光扫描共聚焦显微镜技术分析蔬菜叶片细胞内活性氧自由基水平；3)将符合国家标准未受污染蔬菜叶片中活性氧自由基荧光强度作为标准荧光强度值，固定仪器采集参数；4)按照上述仪器参数进一步采集需检测蔬菜叶片中荧光强度值，将需要检测的蔬菜荧光强度值和蔬菜标准荧光强度值进行统计分析，确定蔬菜是否受重金属污染。
[0008]技术方案
实验原理:2’，7’ - 二氯荧光黄双乙酸酯(DCFH-DA)本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCHL细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF，通过检测DCF荧光以判定细胞内活性氧的水平。蔬菜中活性氧自由基荧光强度处于一定水平范围内，而蔬菜一旦受重金属污染，活性氧自由基荧光强度将发生改变。
[0009]蔬菜叶片处理方法:取新鲜未受污染某种蔬菜叶片(经电感耦合等离子体质谱仪测定测定，该蔬菜重金属含量符合国家标准)，用等渗缓冲液(0.5 mol/L山梨糖醇、4 mol/L2-吗啉乙磺酸、20 mmol/L氯化钾、pH 5.7)冲洗干净，用刀片小心切取细长叶片若干。随后，将叶片转入10 μ mol/L 2’ 7’ - 二氯荧光黄双乙酸酯(DCFH-DA)进行活性氧染色2小时，等渗缓冲液冲洗。随后用镊子夹取冲洗后的蔬菜叶片，放入载玻片。
[0010]活性氧自由基图像采集及仪器参数建立:采用激光共聚焦显微镜获取荧光图像，氩离子激光器激发波长为488纳米，信号接收波长为500-650纳米，采集荧光图像为绿色。采集不同蔬菜叶片活性氧自由基荧光图片时，仪器参数储存，所有叶片均采用相同参数。随后，采用Leica TCS-SP 2软件进行蔬菜叶片中活性氧自由基荧光统计分析。每个浓度的重金属处理统计10个叶片，分析叶片细胞活性氧自由基荧光强度，该荧光强度值作为标准荧光强度值储存。
[0011]市售蔬菜分析:取市 售该蔬菜叶片，处理方法同上所述，采用相同的仪器参数采集蔬菜叶片活性氧自由基荧光图片，随后，采用Leica TCS-SP 2软件进行蔬菜叶片中活性氧自由基荧光统计分析。每个浓度的重金属处理统计10个叶片，分析叶片细胞活性氧自由基荧光强度。
[0012]蔬菜重金属污染判断方法:采用统计软件对数据进行统计分析，统计处理采用t检验法，对需要检测的蔬菜活性氧自由基荧光强度值和标准荧光强度值进行显著性检验。P < 0.05表示需检测蔬菜活性氧自由基荧光强度值和标准荧光强度值存在显著性差异，P< 0.01表不存在极显著性差异，P < 0.05或P < 0.01均表不该蔬菜受重金属污染。
【具体实施方式】
[0013]实施例1
I电感耦合等离子体质谱仪测定重金属含量及标准蔬菜设定:铅离子标准溶液购于上海市计量测试技术研究院化学电离所，取已知浓度为1000 μ g/mL的铅标准溶液,加入适量硝酸，用超纯水稀释配制成梯度的标准溶液，摇匀后得到铅标准溶液系列。
[0014]采用电感稱合等离子体质谱仪(美国Agilent HP4500 Series 300)测定重金属含量，通过对电感耦合等离子体质谱仪工作参数的最佳化，建立蔬菜叶片中铅元素含量的定量分析方法。
[0015]采用电感耦合等离子体质谱仪测定市售菠菜重金属铅含量，三份菠菜中铅离子含量分别为 40.26±1.26,82.35±2.02,160.58±1.04 μ g/Kg，含量为 40.26±1.26 μ g/Kg的低于国家标准，将其作为标准蔬菜以进一步测定其标准荧光强度值。
[0016]2活性氧自由基图片采集及荧光强度分析:取上述三份菠菜蔬菜叶片，用等渗缓冲液(0.5 mol/L山梨糖醇、4 mol/L 2-吗啉乙磺酸、20 mmol/L氯化钾、pH 5.7)冲洗干净，用刀片小心切取细长叶片若干。随后，将叶片转入10 μ mol/L 2’ 7’-二氯荧光黄双乙酸酯(DCFH-DA)进行活性氧染色2小时，等渗缓冲液冲洗。随后用镊子夹取冲洗后的蔬菜叶片，放入载玻片。
[0017]采用激光扫描共聚焦显微镜(德国徕卡公司生产，型号Leica TCS-SP 2)获取荧光图像，氩离子激光器激发波长为488纳米，信号接收波长为500飞50纳米，采集荧光图像为绿色。采集不同蔬菜叶片活性氧自由基荧光图片时，仪器参数储存，所有叶片均采用相同参数。随后，采用Leica TCS-SP 2软件进行蔬菜叶片中活性氧自由基荧光统计分析。每个浓度的重金属处理统计10个叶片，分析叶片细胞活性氧自由基荧光强度。测定标准蔬菜叶片中活性氧自由基标准荧光强度值，并进一步分析其他两份蔬菜活性氧自由基荧光强度值。
[0018]3结果分析:采用激光扫描共聚焦显微镜对三份菠菜叶片进行活性氧自由基分析测定。标准蔬菜铅离子含量为40.26±1.26 μ g/Kg，标准蔬菜叶片活性氧自由基荧光强度值为86.34±12.72 ;其他两份蔬菜铅离子含量分别为82.35±2.02 μ g/Kg、160.58±1.04μ g/Kg，活性氧自由基荧光强度值分别为98.96 ±13.24、110.36±11.23，与三种铅离子浓度相对应的活性氧自由基荧光强度呈上升趋势。结果表明，重金属铅含量升高，两种待测蔬菜活性氧自由基荧光强度值均极显著高于标准荧光强度值(P < 0.01)，据此可判断蔬菜受重金属铅污染。
[0019]实施例2
I电感耦合等离子体质谱仪测定重金属含量及标准蔬菜设定:汞离子标准溶液购于上海市计量测试技术研究院化学电离所，取已知浓度为1000 μ g/mL的汞标准溶液，加入适量硝酸，用超纯水稀释配制成梯度的标准溶液，摇匀后得到汞标准溶液系列。
[0020]采用电感耦合等离子体质谱仪(美国Agilent HP4500 Series 300)测定重金属含量，通过对电感耦合等离子体质谱仪工作参数的最佳化，建立蔬菜叶片中汞元素含量的定量分析方法。
[0021]采用电感耦合等离子体质谱仪测定市售菠菜重金属汞含量，三份菠菜中汞离子含量分别为 2.26±0.31、10.35±0.35,20.58±0.62 μ g/Kg，含量为 2.26±0.31 μ g/Kg 的低于国家标准，将其作为标准蔬菜以进一步测定其标准荧光强度值。
[0022]2活性氧自由基图片采集及荧光强度分析:取上述三份菠菜蔬菜叶片，用等渗缓冲液(0.5 mol/L山梨糖醇、4 mol/L 2-吗啉乙磺酸、20 mmol/L氯化钾、pH 5.7)冲洗干净，用刀片小心切取细长叶片若干。随后，将叶片转入10 μ mol/L 2’ 7’-二氯荧光黄双乙酸酯(DCFH-DA)进行活性氧染色2小时，等渗缓冲液冲洗。随后用镊子夹取冲洗后的蔬菜叶片，放入载玻片。
[0023]采用激光扫描共聚焦显微镜(德国徕卡公司生产，型号Leica TCS-SP 2)获取荧光图像，氩离子激光器激发波长为488纳米，信号接收波长为500飞50纳米，采集荧光图像为绿色。采集不同蔬菜叶片活性氧自由基荧光图片时，仪器参数储存，所有叶片均采用相同参数。随后，采用Leica TCS-SP 2软件进行蔬菜叶片中活性氧自由基荧光统计分析。每个浓度的重金属处理统计10个叶片，分析叶片细胞活性氧自由基荧光强度。测定标准蔬菜叶片中活性氧自由基标准荧光强度值，并进一步分析其他两份蔬菜活性氧自由基荧光强度值。
[0024]3结果分析:采用激光扫描共聚焦显微镜对三份菠菜叶片进行活性氧自由基分析测定。标准蔬菜汞离子含量为2.26±0.31 μ g/Kg，标准蔬菜叶片活性氧自由基荧光强度值为80.82 ±2.19 ;其他两份蔬菜汞离子含量分别为10.35 ±0.35 μ g/Kg、20.58 ±0.62 μ g/Kg，活性氧自由基荧光强度值分别为89.76±2.49,97.38± 1.32，与三种汞离子浓度相对应的活性氧自由基荧光强度呈上升趋势。结果表明，重金属汞含量升高，两种待测蔬菜活性氧自由基荧光强度值均极显著高于标准荧光强度值(P <0.01)，据此可判断蔬菜受重金属污染。
[0025]实施例3
I电感耦合等离子体质谱仪测定重金属含量及标准蔬菜设定:镉离子标准溶液购于上海市计量测试技术研究院化学电离所，取已知浓度为1000 μ g/mL的镉标准溶液，加入适量硝酸，用超纯水稀释配制成梯度的标准溶液，摇匀后得到镉标准溶液系列。
[0026]采用电感稱合等离子体质谱仪(美国Agilent HP4500 Series 300)测定重金属含量，通过对电感耦合等离子体质谱仪工作参数的最佳化，建立蔬菜叶片中镉元素含量的定量分析方法。
[0027]采用电感耦合等离子体质谱仪测定市售菠菜重金属镉含量，三份菠菜中镉离子含量分别为 5.76±0.25、15.32±0.65,25.67±0.43 μ g/Kg，含量为 5.76±0.25 μ g/Kg 的低于国家标准，将其作为标准蔬菜以进一步测定其标准荧光强度值。
[0028]2活性氧自由基图片采集及荧光强度分析:取上述三份菠菜蔬菜叶片，用等渗缓冲液(0.5 mol/L山梨糖醇、4 mol/L 2-吗啉乙磺酸、20 mmol/L氯化钾、pH 5.7)冲洗干净，用刀片小心切取细长叶片若干。随后，将叶片转入10 μ mol/L 2’ 7’-二氯荧光黄双乙酸酯(DCFH-DA)进行活性氧染色2小时，等渗缓冲液冲洗。随后用镊子夹取冲洗后的蔬菜叶片，放入载玻片。
[0029]采用激光扫描共聚焦显微镜(德国徕卡公司生产，型号Leica TCS-SP 2)获取荧光图像，氩离子激光器激发波长为488纳米，信号接收波长为500飞50纳米，采集荧光图像为绿色。采集不同蔬菜叶片活性氧自由基荧光图片时，仪器参数储存，所有叶片均采用相同参数。随后，采用Leica TCS-SP 2软件进行蔬菜叶片中活性氧自由基荧光统计分析。每个浓度的重金属处理统计10个叶片，分析叶片细胞活性氧自由基荧光强度。测定标准蔬菜叶片中活性氧自由基标准荧光强度值，并进一步分析其他两份蔬菜活性氧自由基荧光强度值。
[0030]3结果分析:采用激光扫描共聚焦显微镜对三份菠菜叶片进行活性氧自由基分析测定。标准蔬菜镉离子含量为5.76 ±0.25 μ g/Kg，标准蔬菜叶片活性氧自由基荧光强度值为83.56 + 1.62 ;其他两份蔬菜镉离子含量分别为15.32±0.65 μ g/Kg、25.67±0.43 μ g/Kg,活性氧自由基荧光强度值分别为91.78 ±2.14、103.22 ±5.21，与三种镉离子浓度相对应的活性氧自由基荧光强度呈上升趋势。结果表明，重金属镉含量升高，两种待测蔬菜活性氧自由基荧光强度值均极显著高于标准荧光强度值(P < 0.01)，据此可判断蔬菜受重金属污染。
【权利要求】
1.一种基于活性氧自由基水平分析蔬菜重金属污染的方法，其特征在于采用激光扫描共聚焦显微镜技术分析蔬菜是否受重金属污染和蔬菜安全性。
2.一种基于活性氧自由基水平分析蔬菜重金属污染的方法，其特征在于根据活性氧自由基水平评价蔬菜是否受重金属污染和蔬菜安全性。
3.一种基于活性氧自由基水平分析蔬菜重金属污染的方法，其特征在于采集符合国家标准未受污染蔬菜叶片中活性氧自由基荧光强度，将其作为标准荧光强度值。
4.一种基于活性氧自由基水平分析蔬菜重金属污染的方法，其特征在于将需要检测的蔬菜荧光强度值和蔬菜标准荧光强度值相比较，根据统计分析结果确定蔬菜是否受重金属污染。
【文档编号】G01N21/64GK103472046SQ201310440478
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年9月25日 优先权日:2013年9月25日
【发明者】刘东武, 陈志伟, 项海波 申请人:山东理工大学