一种检测四环素残留的电流型适配体传感器的制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种检测四环素残留的电流型适配体传感器的制备方法，其特征在于制备了一种新型的壳聚糖、戊二醛与铁氰化钾的复合物，作为修饰电极的第一层物质不仅可以作为分子导线加速电子在电子表面的传递，壳聚糖具有很好的吸附性、稳定性和良好的生物相容性，其丰富的氨基、多孔性结构有利于提高传感器的性能，而且壳聚糖上大量的氨基还可以为第二层修饰物质纳米金胶提供可以共价结合的位点。经上述步骤制备的适配体传感器，检测时间较短，灵敏度高，特异性、稳定性好，回收率符合要求。
【专利说明】一种检测四环素残留的电流型适配体传感器的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明提供一种检测四环素残留的电流型适配体传感器的制备方法，属于生物传感器【技术领域】。
【背景技术】
[0002]近年来，随着我国畜牧养殖业的迅速发展，奶产量大幅度提高，新鲜牛奶和奶制品已经成为人民(尤其是老人和儿童)生活食品中的重要组成部分。然而，抗生素在现代畜牧业中的广泛应用，不可避免地造成牛奶中抗生素残留。若长期饮用含有抗生素的牛奶，无疑是等于长期服用小剂量的抗生素，对抗生素过敏体质的人服用残留抗生素的牛奶后可引发过敏反应。正常饮用者，会导致体内的某些条件性致病菌易产生耐药性，一旦患病再用同种抗生素治疗很难奏效。抗生素残留不仅危害人类健康，同时也影响牛奶的品质，造成经济损失。由于奶牛乳腺炎发病率较高，用四环素来治疗乳腺炎等产科疾病仍较普遍，这容易导致在牛奶中四环素的残留。过量使用四环素类抗生素不可避免会使母体代谢产物等相关抗生素残留于动物的肌肉、蛋、奶、脏器组织中，进而通过食物链影响人体健康。可见，加强对牛奶中四环素残留的检测，尤其是保障人类健康有着十分深远的意义。
[0003]传统的抗生素残留检测方法主要有:气相色谱(GC)、高效液相色谱法(HPLC)、色谱/质谱联用技术(GC/LC-MS)、毛细管电泳法(CE)、荧光分析、酶联免疫法(ELISA)。这些方法虽然选择性好、灵敏度高、准确度高、检出限低，可同时检测多种元素或化合物，但其需要昂贵的仪器设备，样品前处理过程繁琐、费时，并且对分析人员的技术水平要求很高，不适于现场快速检测。核酸适配体是人工合成的核酸序列，经多次筛选获得的核酸适配体与靶标分子有很高的特异性和亲和力。与传统抗体相比，适配体具有以下几种优势:(I)制备适配体无需进行动物的免疫等程序，可以在体外进行筛选并进行大量的、快速的制备；(2)对于靶分子的亲和性高于传统抗体，并且可以和核酸的一级、二级和三级结构相结合，用于较大范围靶物质的筛选，在临床上有一定有优势；(3)比传统抗体更稳定，保存时间长，可以在室温下进行运输。将基于适配体的生物传感技术用于畜产品中抗生素残留的快速检测，有助于提高抗生素残留快速检测的稳定性、重现性和准确性，有望成为抗生素残留快速检测的新手段。
[0004]发明的目的在于提供一种能克服上述缺陷以及操作简单、灵敏度高、选择性好的检测四环素残留的电流型适配体传感器的制备方法。
[0005]其技术方案为:一种检测四环素残留的电流型适配体传感器的制备方法，其特征在于:电流型适配体传感器的敏感界面组成包括由壳聚糖、戊二醛与铁氰化钾三种物质制备的复合物和纳米金胶(AuNPs)，进而固定四环素对应的适配体。
[0006]所述的一种检测四环素残留的电流型适配体传感器的制备方法，其特征在于:玻碳电极(d=3mm)的清洗，适配体传感器敏感界面的构建及过程表征，适配体传感器工作曲线的建立，适配体传感器性能的检测，适配体传感器对实际样品的检测。
[0007]所述的一种检测四环素残留的电流型适配体传感器的制备方法，其特征在于:实验条件的优化，主要包括壳聚糖、戊二醛与铁氰化钾的复合物中壳聚糖的量、适配体浓度以及孵育时间；所制备的电流型免疫传感器的工作曲线为:ΛΙ (μ A) = 5.738 + 0.386LogC (M) (R2=0.994，I X 10-9 M-1 X 10-5 Μ)，ΔI (μ Α) = 14.464 + 2.094 LogC (M)(R2=0.992，I X IO-5M-1 X 10_2 Μ);适配体传感器性能检测包括特异性稳定性、重现性以及适配体传感器对牛奶样品回收率的测定。
[0008]其制备原理为:适配体生物传感器以适配体作为识别元件，通过固定化技术将适配体结合到感受器表面，适配体与目标物结合后，形成的复合物与产生的物理或化学信号相关联，由换能器将其转化为与待测物质浓度(或活度)有关的可定量或者可处理的物理化学信号，再通过二次仪表放大并且输出信号，从而实现对待测物质的检测。本发明采用以壳聚糖、戊二醛与铁氰化钾的复合物和纳米金胶对玻碳电极进行修饰。壳聚糖、戊二醛与铁氰化钾的复合物作为修饰电极的第一层物质不仅可以作为分子导线加速电子在电子表面的传递，而且壳聚糖上大量的氨基还可以为第二层修饰物质纳米金胶提供可以共价结合的位点。壳聚糖属于多糖类，它具有优异的成膜性、吸附性、透气性和渗透性，成膜后具有很好的吸附性、稳定性和良好的生物相容性，其丰富的氨基、多孔性结构使它被广泛用于生物分子的固定和修饰电极的制备。壳聚糖的氨基端通过金氨键连接纳米金胶，为适配体在电极表面的固定提供了一个良好的生物界面，保持了适配体的生物活性以用来和四环素进行有效的结合。此外，纳米金胶较高的比表面积、稳定性和导电性可以增大电极表面电子的传导能力和生物相容性，进而增大适配体传感器的响应电流。采用本发明制成的电流型适配体传感器可以在牛奶上市前，进行四环素残留的快速测定，直接对四环素残留量是否超标进行检测，避免因食用含有四环素的牛奶而引起四环素在人体内的蓄积造成严重的后果，为畜牧产品安全生产与消费提供残留检测的技术支撑。
[0009]为达到以上目的，采取以下技术方案实现:一种检测四环素残留的电流型适配体传感器的制备方法，其特征在于:(I)电流型适配体传感器制备前裸玻碳电极的清洗、活化和性能测试，如果测试循环伏安曲线中的峰电位差在120 mV以下，氧化峰和还原峰对称，则所述玻碳电极可使用，否则要重新返回清洗步骤中，直到符合要求。(2)清洗好的裸玻碳电极表面滴涂分散均匀的壳聚糖-戊二醛-铁氰化钾复合物，继而修饰纳米金胶，然后固定适配体，最后用巯基乙醇封闭非特异`性结合位点。电流型适配体传感器制备结束后，放入冰箱里4°C保存备用。
[0010]为达到以上目的，采取以下技术方案实现:一种检测四环素残留的电流型适配体传感器的制备方法，其特征在于:(I)将上述制备好的电流型适配体传感器在工作底液中以不同的扫速做循环伏安方法扫描，可以得到峰值和扫速的关系，得到是受扩散控制的。
(2)配置一系列的四环素标准液，进行差分脉冲伏安扫描，得到电流的前后变化，进一步得出上述制备的电流型适配体传感器的工作曲线、检测范围和检测限；(3)配置一系列经常混合使用的抗生素溶液，以检测所制备电流型适配体传感器的特异性；(4)通过检测储存7-21天的适配体传感器的差分脉冲伏安的变化验证上述传感器的稳定性，通过对比相同方法修饰的5根不同的电极检测其重现性能；(5)对实际牛奶样品进行分析得出该适配体传感器的回收率。
[0011]本发明采用铁氰化钾内置于壳聚糖与戊二醛的复合物中来作为修饰电极的第一层物质，具有良好的生物相容性和成膜性的壳聚糖作为分散剂所制备成的壳聚糖、戊二醛与铁氰化钾的复合物膜能够促进电化学反应中电子的传递，提高电极上的响应电流，改善电极表面的微环境，因而可以作为载体材料，用以制备响应信号强和灵敏度高的适配体传感器；具有大量氨基的纳米复合膜与纳米金胶形成的金氨体系具有较高的稳定性和高度有序性，增大了适配体传感器的电流响应并提高了传感器表面适配体的有效固定，从而增大了检测精度。
[0012]所述电流型适配体传感器的制备工艺如下:(I)取5μ L制备好的壳聚糖、戊二醛与铁氰化钾的复合物滴涂在预处理好的玻碳电极表面，常温干燥，用ΡΗ=7.5的PBS缓冲液冲洗电极表面；(2)电极表面晾干后，取5 μ L纳米金胶滴涂在电极表面，常温下静置至干燥，然后用超纯水冲洗表面物理吸附的纳米金，氮气吹干；(3)然后将5 yL5mM的适配体滴在上述经纳米材料修饰好的电极上，用橡胶帽盖住防止水分的蒸发，4h后用超纯水冲洗表面，晾干待用；(4)最后上述制备好的电极浸于用IM的巯基乙醇封闭lh，以封闭非特异性结合位点，适配体传感器制作完成，保存在4° C条件下备用。
【具体实施方式】
[0013]实施例:(1)壳聚糖、戊二醛与铁氰化钾复合物的制备:首先配置1% (I ml/100ml water)的醋酸溶液并用配好的醋酸溶液作为溶剂制备50 ml 1% (I g/100 ml)的壳聚糖溶液。把500 μ I的5禮的K3[Fe (CN)6]与I mL的壳聚糖溶液(400 μ I 1%壳聚糖+ 600 μ I水)混匀超声震荡5分钟得到清澈的黄色溶液。向上诉溶液中加入100 μ I 5%的戊二醛在超声10分钟后静置24h，壳聚糖、戊二醛与铁氰化钾复合物制备完成。(2)纳米金胶的制备米用朽1檬酸三钠热还原氯金酸(HAuCl4)的方法。所有的玻璃器皿均用王水浸泡，洗涤干净备用。配置100 mL 0.01%的氯金酸溶液，在剧烈搅拌下加热至沸腾，然后迅速加入2.5 mL 1%柠檬酸三钠溶液，继续搅拌20min (此间溶液由淡黄色转为无色，然后变灰黑色，最后成酒红色)，除去热源后继续搅拌至室温下慢慢冷却。将冷却后的金胶溶液置于干净的棕色玻璃瓶中于4° C冰箱中避光保存备用，数月有效。(3)玻碳电极的清洗:玻碳电极修饰前，首先浸入热的“piranha”溶液(H2SO4:30% H2O2 = 3:1)中浸泡15min，用水清洗干净，接下来用0.3 μ m、30nm的Al2O3浆在麂皮上抛光至镜面，抛光后用去离子水洗去除表面污物，再移入超声水浴中清洗，每次5min,重复二次,然后依次用6mol/L的HNO3、无水乙醇和去离子水超声清洗，氮气环境下干燥。(4)玻碳电极的活化:彻底清洗后，电极在
0.5mol/L H2SO4溶液中用循环伏安法活化，扫描范围1.0V?-1.0V，反复扫描直至达到稳定的循环伏安图为止。(5)预处理好的玻碳电极的测试:在含有1X10_3 mol/L K3[Fe (CN)6]的0.20 mol/L KNO3溶液中跑循环伏安曲线，以测试所述玻碳电极的性能，扫描速度50mV/S，扫描范围为-0.1V?0.6V;当所述循环伏安曲线中的峰电位差在SOmV以下，并尽可能接近64mV，所述玻碳电极可使用，否则要重新返回步骤(3)中，处理所述玻碳电极，直到符合要求。(6)取5μ L制备好的壳聚糖、戊二醛与铁氰化钾的复合物滴涂在预处理好的玻碳电极表面，常温干燥，用ΡΗ=7.5的PBS缓冲液冲洗电极表面。(7)电极表面晾干后，取5μ L纳米金胶滴涂在电极表面，常温下静置至干燥，然后用超纯水冲洗表面物理吸附的纳米金，氮气吹干。(8)然后将5 μ L 5mM的适配体滴在上述经纳米材料修饰好的电极上，用橡胶帽盖住防止水分的蒸发，4h后用超纯水冲洗表面，晾干待用。(9)最后上述制备好的电极浸于用IM的巯基乙醇封闭lh，以封闭非特异性结合位点，适配体传感器制作完成，保存在4° C条件下备用。(10)从壳聚糖、戊二醛与铁氰化钾的复合物中壳聚糖的量、适配体浓度以及孵育时间三方面对所制备的免疫传感器的实验条件进行优化，壳聚糖、戊二醛与铁氰化钾的复合物中壳聚糖的量为0.2-0.9 (例:0.2的配比为200 μ I 1%壳聚糖+ 800 μ?水)，适配体浓度范围为2-6 μΜ，孵育时间的范围为15-90min。(11)配置I X 10_9 M-1 X10_2 M的四环素标准溶液，将上述制备好的适配体传感器分别检测不同浓度的四环素标准溶液，在常温下孵育60 min，检测反应前后电流变化得到其工作曲线。(12)将适配体传感器在氧四环素、卡那霉素、硫酸庆大霉素干扰物存在的情况下对10_5 M的四环素进行测试，以检测其特异性；选5根于相同条件下制备好的适配体传感器检测其重现性；连续7-21天依次检测相同浓度的四环素溶液以检测其稳定性。(13)利用加标回收的方法检测四环素在牛奶样品中的回收率为92-106 %。
[0014]此种电流型适配体传感器检测四环素残留的检测方法操作工艺简单，检测时间较短，检测四环素浓度范围广，灵敏度高，稳定性好，再生能力高以及对实际样品分析有较好的回收率和重现性，符合我国四环素残留快速检`测技术发展和国际化要求。
【权利要求】
1.一种检测四环素残留的电流型适配体传感器的制备方法，其特征在于:制备了一种新型的壳聚糖、戊二醛与铁氰化钾的复合物，作为修饰电极的第一层物质不仅可以作为分子导线加速电子在电子表面的传递，而且壳聚糖上大量的氨基还可以为第二层修饰物质纳米金胶提供可以共价结合的位点，壳聚糖、戊二醛与铁氰化钾的复合物的制备步骤为: 首先配置1% (I ml/100 ml water)的醋酸溶液并用配好的醋酸溶液作为溶剂制备50ml 1% (I g/100 ml)的壳聚糖溶液,把500 μ I的5 mM的K3 [Fe (CN)6]与I mL的壳聚糖溶液(400 μ I 1%壳聚糖+ 600 μ I水)混匀超声震荡5分钟得到清澈的黄色溶液，向上诉溶液中加入100 μ I 5%的戊二醛在超声10分钟后静置24 h，壳聚糖、戊二醛与铁氰化钾复合物制备完成。
2.如权利要求1所述的一种检测四环素残留的电流型适配体传感器的制备方法，其特征在于:壳聚糖的氨基端通过金氨键连接纳米金胶，利用壳聚糖、戊二醛与铁氰化钾复合物和纳米金胶两种材料的协同作用共同修饰电极，显著的增强了电流响应，且形成的金氨体系具有较高的稳定性和高度有序性，为适配体在电极表面的固定提供了一个良好的生物界面，扩大了电极的有效固定面积，提高了传感器表面适配体的有效固定量，且保持了适配体的生物活性，进而增大了检测精度和灵敏度，检测四环素残留的电流型适配体生物传感器的制备步骤为: 取5 yL制备好的壳聚糖、戊二醛与铁氰化钾的复合物滴涂在预处理好的玻碳电极表面，常温干燥，用PH=7.5的PBS缓冲液冲洗电极表面；电极表面晾干后，取5 μ L纳米金胶滴涂在电极表面，常温下静置至干燥，然后用超纯水冲洗表面物理吸附的纳米金，氮气吹干；然后将5 UL 5 mM的适配体滴在上述经纳米材料修饰好的电极上，用橡胶帽盖住防止水分的蒸发，4 h后用超纯水冲洗表面，晾干待用；最后上述制备好的电极浸于用IM的巯基乙醇封闭I h，以封闭非特异性结合位点，适配体传感器制作完成，保存在4° C条件下备用。
【文档编号】G01N27/38GK103499620SQ201310494699
【公开日】2014年1月8日 申请日期:2013年10月18日 优先权日:2013年10月18日
【发明者】郭业民, 孙霞, 王相友, 刘君峰, 沈广辉 申请人:山东理工大学