一种可区分罗非鱼背部肌肉和尾部肌肉的方法
【专利摘要】本发明公布了一种可区分罗非鱼背部肌肉和尾部肌肉的方法，其特征在于：用已检测的罗非鱼BMP4抗体对罗非鱼的这2种肌肉部位的BMP4蛋白进行检测，用GAPDH做目标蛋白的对照，如果仅能检测到55KD的蛋白，则为罗非鱼的背部肌肉。
【专利说明】—种可区分罗非鱼背部肌肉和尾部肌肉的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种可区分罗非鱼背部肌肉和尾部肌肉的方法。
【背景技术】
[0002]目前，消费者一致认为罗非鱼背部肌肉、尾部肌肉中，背部肌肉鲜嫩，得到消费者的青睐。这样，在罗非鱼生产和育种过程中，背部肌肉的选育和形成机理成为必须解决的首要问题。因此，如何从分子水平上区分罗非鱼的背部肌肉显得尤为重要。
[0003]可从罗非鱼背部肌肉、尾部肌肉中开发出鉴别背部肌肉的分子标记，可为背部肌肉区别与其它肌肉提供研究的突破口，同时可根据这个分子标记探寻用于罗非鱼背部肌肉进行选育的路径和方法。但是能够用蛋白检测的方法解决这个问题的研究还未见报道。
[0004]GAPDH (甘油醛_3_磷酸脱氢酶)是参与糖酵解的一种关键酶，由4个30_40kDa的亚基组成，分子量146kDa，检测条带大约在36kDa。GAPDH基因几乎在所有组织中都高水平表达，广泛用作Western blot蛋白质标准化的内参。因为GAPDH作为看家基因在同种细胞或者组织中的蛋白质表达量一般是恒定的，因此在使用GAPDH内参抗体时，将每个样品测得的目的蛋白含量与本样品的GAPDH含量相除，得到每个样品目的蛋白的相对含量，然后才进行样品与样品之间的比较。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于克服现有技术中存在的不足，提供可从罗非鱼背部肌肉、尾部肌肉中鉴别背部肌肉，该处理方法可以从罗非鱼背部肌肉、尾部肌肉中鉴别出背部肌肉。
[0006]本发明为实现上述目的，采用如下技术方案:
[0007]—种可从罗非鱼背部肌肉、尾部肌肉中鉴别背部肌肉的方法，其特征在于:首先获得高质量的罗非鱼BMP4抗体，其次，成功提取罗非鱼背部肌肉、尾部肌肉蛋白；然后用已检测的罗非鱼BMP4抗体对目标罗非鱼的这些肌肉组织中的BMP4蛋白进行检测，用GAPDH做目标蛋白的对照，如果能检测到55KD的蛋白，则为罗非鱼背部肌肉，如果检测不到，则为罗非鱼尾部肌肉。
[0008]具体方法如下:
[0009]1、一种可区分罗非鱼背部肌肉和尾部肌肉的方法，其特征在于按如下步骤实现:
[0010](I)根据罗非鱼Coptodon rendalli BMP4基因氨基酸序列，其Genbank登录号为BAC02605,依据此序列设计多肽，合成多肽，并对多肽进行修饰获得罗非鱼BMP4多肽，其氨基酸序列为QVLLGE SNHASLIPEE GKc，其中c为增加的cys，用于多肽偶联；
[0011](2)用罗非鱼BMP4多肽免疫新西兰大白兔，制备兔抗BMP4血清；
[0012](3)用BMP4多肽对兔血清进行抗原亲和纯化，纯化后获得罗非鱼BMP4多克隆抗体，抗体进行ELISA效价检测，结果显示，ELISA Titer大于1:128000 ；
[0013](4)用罗非鱼BMP4多克隆抗体，以western技术检测罗非鱼背部和尾部肌肉中BMP4基因的表达，结果显示如果仅能检测到55KD的蛋白，则为罗非鱼的背部肌肉，而检测到55KD和72KD2条带为罗非鱼的尾部肌肉。
[0014]有益效果:我们在做BMP4在罗非鱼不同肌肉部位分布时发现罗非鱼背部肌肉能够检测到BMP4蛋白表达，而罗非鱼尾部肌肉则可检测出另外一条72KD的条带，因此，我们认为可以从BMP4蛋白水平上区分罗非鱼的2种不同部位的肌肉，可为背部肌肉与尾部肌肉提供研究的突破口，同时可根据这个分子标记探寻用于罗非鱼背部肌肉进行选育的路径和方法。
[0015]【专利附图】
【附图说明】:图1为通过本方法进行罗非鱼背部肌肉、尾部肌肉中鉴别背部肌肉的结果，其中I为罗非鱼背部肌肉，2为罗非鱼尾部肌肉。
【具体实施方式】
[0016]材料:GAPDH蛋白抗体，鼠二抗，兔二抗购自吉尔生化(上海)有限公司；
[0017]下面结合实施例对本发明作进一步说明。
[0018]实施例1
[0019](I)根据罗非鱼Coptodon rendalli BMP4基因氨基酸序列(Genbank登录号:BAC02605):MIPGNRMLMV ILICQVLLGE SNHASLIPEE GKKKVPGLQG
[0020]RSAAQSHELL RDFEATLLHMFGLKRRPRPS RSATVPRYLL DLYRLQSGEA
[0021]EEAGAHDIAF EYPERSASRA NTVRGFHHEEHMEQLHELDD GGPMPIRFMF
[0022]NVSSIPEDEL LSSAELRLYR HQIDEAIADA ISDDQALHRINVYEVLKAPR
[0023]PGQLITQLLD TRLVRHNASR WESFDVSPAV LRffTHERLPN
[0024]YGLAVEVLHLNQTPRHQGRH VRISRSLHQE PGEDffEQLRP LLVTFGHDGK
[0025]GHPLTRRTKR SPRQRGRKRNRNCRRHALYV DFSDVGffNDff IVAPPGYQAY
[0026]YCHGECPFPL ADHLNSTNHA IVQTLVNSVNNNIPKACCVP TELSAISMLY
[0027]LDEHDKVVLK NYQEMVVEGC GCR，由上述氨基酸序列设计多肽，合成多肽，并对多肽进行修饰获得罗非鱼BMP4多肽，其氨基酸序列为QVLLGESNHASLIPEE GKc(其中c为增加的cys，用于多肽偶联)；
[0028](2)在(I)的基础上，上述的罗非鱼BMP4多肽免疫新西兰大白兔，5次加强免疫，制备兔抗BMP4血清；
[0029](3)在(2)基础上，用BMP4多肽对兔血清进行抗原亲和纯化，纯化后获得罗非鱼BMP4多克隆抗体，抗体进行ELISA效价检测，结果显示，ELISA Titer大于1:128000 ；
[0030](4) 5尾罗非鱼取自中国水产科学研究院无锡淡水渔业研究中心宜兴养殖基地，取背部肌肉和尾部肌肉组织，液氮速冻后放置于-80°C冰箱冻存，以便于总蛋白的提取(美国 Millipore 公司蛋白抽提试剂盒:Millipore Y8_2140Total Protein ExtractionKitlkit)。
[0031]用步骤(3)获得罗非鱼BMP4多克隆抗体，以western技术检测罗非鱼背部肌肉和尾部肌肉组织中BMP4基因的表达，结果显示罗非鱼背部肌肉中有BMP4蛋白的表达，而在尾部肌肉中可检测到除BMP4蛋白的表达外的72KD的一条带。
[0032]其中罗非鱼BMP4多克隆抗体western技术检测方法如下:
[0033]1.总蛋白抽提
[0034]I)每个样分别取约50 mg罗非鱼组织，放入细胞裂解液中(碧云天-western及IP细胞裂解液);
[0035]2)用剪刀剪碎组织，然后用匀浆器匀浆；
[0036]3)匀衆均匀后 12，OOOrpm 离心 IOmin ；
[0037]4)将上清液转移到一新离心管中，加6XLoading Buffer ；
[0038]5) 100°C加热煮沸，冰上放置5min，如此重复3次，然后_20°C储存。
[0039]2.SDS-PAGE 电泳
[0040]I) SDS-PAGE 胶制备:
[0041]根据目的蛋白分子量大小配制不同浓度的胶，具体体系如下:
[0042]
【权利要求】
1.一种可区分罗非鱼背部肌肉和尾部肌肉的方法，其特征在于按如下步骤实现:(I)根据罗非鱼CoptodonrendalliBMP4基因氨基酸序列，其Genbank登录号为BAC02605，依据此序列设计多肽，合成多肽，并对多肽进行修饰获得罗非鱼BMP4多肽，其氨基酸序列为QVLLGE SNHASLIPEE GKc，其中c为增加的cys，用于多肽偶联；(2)用罗非鱼BMP4多肽免疫新西兰大白兔，制备兔抗BMP4血清；(3)用BMP4多肽对兔血清进行抗原亲和纯化，纯化后获得罗非鱼BMP4多克隆抗体，抗体进行ELISA效价检测，结果显示，ELISA Titer大于1:128000 ; (4)用罗非鱼BMP4多克隆抗体，以western技术检测罗非鱼背部和尾部肌肉中BMP4基因的表达，结果显示如果仅能检测到55KD的蛋白，则为罗非鱼的背部肌肉，而检测到55KD和72KD 2条带为罗非鱼的尾部肌肉。
【文档编号】G01N33/68GK103630694SQ201310507056
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2013年10月24日 优先权日:2013年10月24日
【发明者】苏胜彦, 张成锋, 董在杰, 袁新华 申请人:中国水产科学研究院淡水渔业研究中心