骨髓细胞培养基的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种医学检验领域中用于染色体核型分析的骨髓细胞培养基配方，其在基础培养基中添加了青霉素/链霉素、胎牛血清和人类淋巴瘤细胞培养物。利用本发明的培养基制备出的骨髓细胞制作出的染色体G带，背景更加清晰，分裂相更多，形态及分散度更加良好，便于分析。此种配方用于骨髓染色体核型分析时，具有省时、省力的优势，且准确性更高，在医学检验领域具有更广泛的应用前景。
【专利说明】骨髓细胞培养基
【技术领域】
[0001]本发明属生物【技术领域】，特别涉及医学检验领域中用于染色体核型分析的骨髓细胞培养基配方。
【背景技术】
[0002]G显带因为染色体主要是被Giemsa染料染色后而显带，故称之为G显带技术，其所显示的带纹分布在整个染色体上。人们将用各种不同的方法，以及用不同的染料处理染色体标本后，使每条染色体上出现明暗相间，或深浅不同带纹的技术称为显带技术(bandingtechnique)。本世纪70年代以来，显带技术得到了很大发展，且在众多的显带技术中(Q带、G带、C带、R带、T带)，G带是目前被广泛应用的一种带型。
[0003]研究发现，人染色体标本经胰蛋白酶、NaOH、柠檬酸盐或尿素等试剂处理后，再用Giemsa染色,可使每条染色体上显示出深浅交替的横纹,这就是染色体的G带。每条染色体都有其较为恒定的带纹特征，所以G显带后，可以较为准确的识别每条染色体，并可发现染色体上较细微的结构畸变。
[0004]近年来，随着分子生物学与细胞遗传学的发展，骨髓染色体核型分析在血液系统疾病的诊断、治疗和预后中发挥了越来越重要的作用。骨髓染色体的制备因骨髓中有大量脂肪颗粒的干扰，骨髓中各种细胞系的细胞周期不固定，不统一，难以区别对待而使得骨髓染色体分裂指数低，染色体短粗，分散度差，且成本较高。
[0005]因此，建立一种具有背景更加清晰、分裂相多、形态及分散度良好等特征的骨髓培养基配方尤为重要。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是克服现有技术的缺陷，提供一种骨髓细胞培养基，其在基础培养基中添加了青霉素/链霉素、胎牛血清和人类淋巴瘤细胞培养物；
基础培养基:RPMI1640培养基 所述各添加成分的用量如下:
青霉素/链霉素5-15ul/ml
胎牛血清60-140 ul/ml
人类淋巴瘤细胞培养物60-140 ul/ml
进一步地，青霉素选自10000U/ml，链霉素选自1000Oii g/ml。
[0007]进一步地，人类淋巴瘤细胞培养物由以下方法制取:细胞复苏和传代，当传代细胞培养基颜色变为黄色时，收集细胞并离心，离心后，收集上清并过滤得细胞培养物。
[0008]进一步地，所述各添加成分用量如下:
青霉素/链霉素8ul/ml
胎牛血清96ul/ml
人类淋巴瘤细胞培养物96ul/ml本发明还提供了骨髓细胞培养基在骨髓染色体制片中的应用，将骨髓细胞以I~3 X IO6个/ml的密度接种到所述的骨髓培养基中，放入37°C，5.0%C02培养箱培养24小时。
[0009]本发明的有益效果是:本实验室在长期研究的基础上，于传统基础培养基中加入了人类淋巴瘤细胞培养物。该培养物可以为骨髓细胞提供更多的营养物(包括生长因子等)，因而培养出的细胞经秋水仙胺终止培养后，制取出的G带背景更加清晰、分裂相更多、形态及分散度更加良好。
【专利附图】
【附图说明】
[0010]图1是利用培养基I所得的镜检结果图2是利用培养基2所得的镜检结果
图3是利用培养基3所得的镜检结果图4是利用培养基4所得的镜检结果
【具体实施方式】
[0011]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
[0012]实施例1配制骨髓细胞培养基
在基础培养基中添加了青霉素/链霉素、胎牛血清和人类淋巴瘤细胞培养物。其中基础培养基为RPMI1640培养基 ，所述各添加成分的用量如下:
青霉素/链霉素5-15ul/ml
胎牛血清60-140 ul/ml
人类淋巴瘤细胞培养物60-140 ul/ml
其中，青霉素可选自10000U/ml，链霉素可选自1000Oμ g/ml。在其它实施方式中，可选自其它浓度青霉素和链霉素用于配制培养基。
[0013]其中，人类淋巴瘤细胞培养物按以下方法制取:细胞经复苏和传代，当传代细胞培养基颜色变为黄色时，收集细胞并离心，离心后，收集上清并过滤得细胞培养物。
[0014]更具体的制取人类淋巴瘤细胞培养物的方法包括以下步骤: a.将超净台用新洁尔灭擦拭干净，紫外线照射30分钟。
[0015]b.从液氮罐中取出冻存管，立即放入37°C水浴摇动促其内容物2分钟内迅速融化。
[0016]c.将细胞悬液转入IOml含9.6%胎牛血清RPM1-1640培养基中，37°C，5%C02培养。
[0017]d.当细胞达到约50%的融合率时，加入4ml的胰蛋白酶(含EDTA)，确保细胞培养
瓶底部覆盖一薄层胰蛋白酶。
[0018]e.将培养瓶放入培养箱孵育5min，镜检，如果所有细胞都已脱落，加入IOml的培养基，并用移液管将细胞冲散。
[0019]f.然后再加入30ml新鲜培养基，将细胞悬液一传四，转入含有IOml培养基的细胞培养瓶中，温和地混匀细胞。
[0020]g.将培养瓶放入培养箱中(拧松瓶盖)，当细胞密度达到大约50%融合率时，更换培养基，至终浓度40ml左右。
[0021]h.当培养基颜色变为黄色时准备收集。用血清移液管将培养好的细胞转入50ml圆底聚丙乙烯离心管中(贴上相应标签)，2000 rpm离心lOmin。
[0022]1.收集上清液，并经0.22 无菌滤器过滤(收集时切勿碰到细胞沉淀)，即为人类淋巴瘤细胞培养物。如果不使用可将过滤后的培养物分装储存于_20°C。
[0023]实施例2骨髓细胞培养及染色体制片
本实施例按如下方法培养骨髓细胞，收获后用于染色体G带制片。在其它实施方式中，也可采用其它方法培养骨髓细胞和染色体制片。本实施例所述方法为:
(1)配制骨髓培养基:按实施例1的方法配制；
(2)接种:将骨髓细胞接种到步骤I所述的培养基中；
(3)终止培养:细胞经秋水仙胺终止培养； (4)收取骨髓细胞培养物；
(5)染色体标本制片:利用染料染色后获得具有G显带的染色体标本。
[0024]其中将骨髓细胞以I~3X IO6个/ml的密度接种到骨髓培养基中，放入37°C，
5.0%C02培养箱培养24小时。所得骨髓培养物可用于骨髓染色体制片。
[0025]其中，收取骨髓细胞培养物可按如下方法收集，也可按本领域常用的其它方法收集。
[0026](I)温和的摇晃培养瓶,并将培养物转入相应的15ml离心管中。抒紧培养瓶盖，并确保样品没有相混。1，OOO rpm离心lOmin。吸去上清液，留下约0.5到1.0 ml涡旋混匀。
[0027](2)低渗:加入IOml 37°C温箱预热的0.075M KCl溶液。涡旋或反复颠倒几次使其与样品混匀，37°C水浴孵育20-30min，期间将离心管左右摇晃三次以使细胞低渗均匀。
[0028](3)预固定:低渗结束后加入Iml的固定液(甲醇:冰醋酸=3:1)，拧紧盖子并反复颠倒三次。I, OOO rpm离心lOmin。吸去上清液，留下约0.5到1.0 ml。
[0029](4)将沉淀物涡旋混匀后，逐滴加入8ml新鲜固定液。
[0030](5)润旋混匀后1，OOO rpm离心lOmin。吸去上清液，留下约0.5到1.0 ml。
[0031](6)混匀细胞沉淀后加入8ml新鲜固定液。
[0032](7)同 5 和 6。
[0033](8)润旋混匀后1，OOO rpm离心lOmin。吸去上清液，留适量固定液,并加入数滴冰醋酸以制成浓度合适的细胞悬液，静置15min后制片。
[0034]其中本实施例中的染色体标本制片方法如下:
a.玻片的准备:提前将玻片用1% HCl浸泡过夜，用大量的清水进行冲洗后浸于95%乙醇中备用。使用前将浸泡的玻片取出，用大量清水清洗后放置于2-8°C冰箱中待用。
[0035]b.滴片:吸取细胞悬液后，将滴管置于15~20cm的高度，滴4-5滴细胞悬液于玻片上，使细胞向玻片标记端远侧流动。适当过火，帮助染色体分散。一般一个病人滴片1-2张。
[0036]c.烤片老化:置于60°C烤箱中烘烤过夜或80°C烘烤I小时。
[0037]d.配制胰酶:新鲜配制50ml 0.3%胰蛋白酶(用HANKS缓冲液稀释)溶液置于染片缸中，37°C水浴箱中预热半小时以上。胰蛋白酶和HANKS缓冲液均购自Invitrogen公司。
[0038]e.配制Giemsa染液:临用时将Gimesa原液与pH6.8的磷酸缓冲液按照1:20混
入
口 o[0039]f.用胰酶消化染色后用于染色体核型分析。
[0040]实施例3对比实验I
按照实施例1的方法配制三组培养基，分别是培养基1、培养基2、培养基3，并设立对照组进行骨髓培养，所述对照组的培养基(培养基4)中不含有人类淋巴瘤细胞培养物。取同一样本的骨髓细胞，按实施例2的方法分别在培养基I至培养基4中进行细胞培养，并按实施例2的方法制作染色体G带，并于显微镜下观察制片结果。使用的显微镜型号为=LeicaDM2500。
[0041]其中:
培养基I的配方为: 基础培养基:RPMI1640培养基
青霉素/链霉素5ul/ml
胎牛血清60ul/ml
人类淋巴瘤细胞培养物60 ul/ml
培养基2的配方为:
基础培养基:RPMI1640培养基
青霉素/链霉素15ul/ml
胎牛血清140 ul/ml
人类淋巴瘤细胞培养物140 ul/ml
培养基3的配方为:
基础培养基:RPMI1640培养基
青霉素/链霉素8ul/ml
胎牛血清96 ul/ml
人类淋巴瘤细胞培养物96 ul/ml
培养基4的配方为:
基础培养基:RPMI1640培养基
青霉素/链霉素lOul/ml
胎牛血清100 ul/ml
如图1至4所示镜检结果:图1是骨髓细胞在培养基I中培养后的实验结果，图2是骨髓细胞在培养基2中培养后的实验结果，图3是骨髓细胞在培养基3中培养后的实验结果，图4是骨髓细胞在培养基4中培养的实验结果。从图1至3的镜检照片中很清晰地看到，使用本发明方法进行G带显色，背景更加清晰、分裂相更多、形态及分散度更加良好。因而诊断时，更加省时省力，诊断结果更加准确。而图4常规方法培养的镜检照片中，形态不完整，杂质较多，分裂相少且团，费时费力外，极易造成误诊，其中图中箭头所示为骨髓分裂相。
【权利要求】
1.一种骨髓细胞培养基，其在基础培养基中添加了青霉素/链霉素、胎牛血清和人类淋巴瘤细胞培养物； 基础培养基:RPMI1640培养基 所述各添加成分的用量如下: 青霉素/链霉素5-15ul/ml 胎牛血清60-140 u I/ml 人类淋巴瘤细胞培养物60-140 ul/ml。
2.根据权利要求1所述的骨髓细胞培养基，其特征在于，青霉素选自10000U/ml，链霉素选自 1000Oii g/ml。
3.根据权利要求1所述的骨髓细胞培养基，其特征在于，人类淋巴瘤细胞培养物由以下方法制取:细胞复苏和传代，当传代细胞培养基颜色变为黄色时，收集细胞并离心，离心后,收集上清并过滤得细胞培养物。
4.根据权利要求1所述的骨髓细胞培养基，其特征在于，所述各添加成分用量如下: 青霉素/链霉素8ul/ml 胎牛血清96ul/ml 人类淋巴瘤细胞培养物96ul/ml。
5.根据权利要求1至4之一的骨髓细胞培养基在骨髓染色体制片中的应用，其特征在于，将骨髓细胞以I~3 X IO6个/ml的密度接种到所述的骨髓培养基中，放入37°C，5.0%C02培养箱培养24小时。
【文档编号】G01N1/28GK103667183SQ201310591742
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年11月22日 优先权日:2013年11月22日
【发明者】程建兵, 夏成青, 陈红梅, 郭福晓, 生帅 申请人:南昌艾迪康临床检验所有限公司