一种荧光药物分子复合纳米粒子、其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种荧光药物分子复合纳米粒子、其制备方法和应用。所述复合纳米粒子包括自聚发光分子通过环境响应性化学键与荧光药物分子连接形成的荧光药物分子复合物。本发明的荧光药物分子复合纳米粒子中环境响应性化学键随环境条件的改变而被打开，自聚发光分子与荧光药物分子分离，分别产生发荧光现象，通过荧光现象的变化对药物在空间上的释放过程进行荧光可视化监测。因此，本发明的荧光药物分子复合纳米粒子作为具有荧光自定位功能的药物递送系统，能够示踪药物载体和药物在生物体内的真正位置。
【专利说明】一种荧光药物分子复合纳米粒子、其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及药物剂型【技术领域】，具体涉及一种荧光药物分子复合纳米粒子、其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]纳米材料因其形貌大小可控、易于修饰、多功能化和高载药量等优点被广泛应用于分子诊疗、肿瘤成像和药物递送等前沿领域。尤其在药物递送方面，各种各样的纳米材料被用于载运药物达到靶向性地治疗各种疾病的目的。这些纳米材料包括无机纳米粒子，如金纳米粒、氧化娃纳米粒和碳纳米材料等，以及有机纳米材料，如胶束、脂质体和树状分子等。揭示这些纳米材料在亚细胞结构单元上的行为对于设计新型的纳米药物递送系统有着重要的意义。然而，大多数药物递送系统不具有可示踪性，其进入细胞后，很难确定其在细胞内的真正位置。
[0003]目前，最常用的示踪方法是对这些递送系统进行荧光标记，然而荧光标记的方法有许多不足:(1)当药物递送系统被荧光分子化学标记后，其物理化学性质有可能发生改变；(2)这些被荧光分子标记后的药物递送系统有可能具有与原来递送系统不同的细胞内吞机制；(3)被标记的荧光分子有可能在细胞内的复杂环境中被水解下来而“遗落”在生物体内的其它位置，而不代表药物递送系统存在的真正位置。因此，本领域需要发展一种具有荧光自定位功能的药 物递送系统，示踪其在生物体内的真正位置。
【发明内容】
[0004]本发明提供一种荧光药物分子复合纳米粒子，其作为药物递送系统，通过载体与药物分子之间的荧光变化对药物在空间上的释放过程进行荧光可视化监测，克服了目前荧光标记的药物递送系统的缺陷。
[0005]本发明提供以下技术方案:
[0006]在第一方面，本发明提供一种荧光药物分子复合纳米粒子，包括自聚发光分子通过环境响应性化学键与荧光药物分子连接形成的荧光药物分子复合物。
[0007]优选地，所述荧光药物分子复合纳米粒子是自聚发光分子通过环境响应性化学键与荧光药物分子连接形成的荧光药物分子复合物自组装形成的。
[0008]优选地，所述自聚发光分子带有活性官能团。
[0009]优选地，所述活性官能团选自氨基、羧基、羟基、巯基和叠氮。
[0010]优选地，所述自聚发光分子选自四苯基乙烯和硅杂环戊二烯。
[0011]优选地，所述环境响应性化学键选自酶敏感的脂键，pH敏感的腙键、脲键和希夫碱，氧化还原敏感的二硫键和葡萄糖敏感的硼酸键。
[0012]优选地，所述荧光药物分子选自阿霉素、姜黄素、阿柔比星、佐柔比星和表柔比星。
[0013]本发明中，荧光药物分子复合纳米粒子可以作为药物递送系统，因此本文中二者的含义相同，可以替换。[0014] 自聚发光分子是2001年唐本忠教授等报道的一种在聚集状态下诱导发光的分子，因此自聚发光分子又称为聚集诱导发光(aggregation-1nduced emission, AIE)分子，是指在分离情况下不发光，而在聚集状态下诱导发出荧光现象的分子。本发明的荧光药物分子复合纳米粒子中，自聚发光分子通过环境响应性化学键与荧光药物分子连接形成荧光药物分子复合物，自聚发光分子通过荧光能量共振转移将能量转给荧光药物分子，荧光药物分子通过聚集诱导淬灭机制发生荧光淬灭，因此荧光药物分子复合纳米粒子没有明显的发荧光现象。当荧光药物分子复合纳米粒子的环境条件(比如PH环境、氧化还原环境或酶环境等)改变时，环境响应性化学键被打开，自聚发光分子与荧光药物分子分离，然后自聚发光分子发生聚集诱导发光现象，荧光药物分子的荧光淬灭机制消失，发出荧光。通过上述荧光现象的变化对药物在空间上的释放过程进行荧光可视化监测。
[0015]在第二方面，本发明提供一种制备如第一方面所述的荧光药物分子复合纳米粒子的方法，包括:
[0016](I)使自聚发光分子与荧光药物分子接触，形成环境响应性化学键，得到荧光药物分子复合物；
[0017](2)将所述荧光药物分子复合物溶于可与水互溶的有机溶剂配成悬浮液，然后将所述悬浮液在超声条件下滴加到水中，制得所述荧光药物分子复合纳米粒子。
[0018]目前已经有很多类型的自聚发光分子报道，比如中国发明专利申请公布号 CN102153748A、 CN102279270A、 CN102250015A、 CN102313726A、 CN 102702096A、CN103194213A.CN103194215A和CN102219723A均公开了相应的自聚发光分子，理论上说这些类型的自聚发光分子，只要能够与荧光药物分子形成环境响应性化学键连接，就能应用于本发明。虽然如此，本发明特别优选的自聚发光分子是带有氨基、羧基、羟基、巯基或叠氮等活性官能团的自聚发光分子，以便与荧光药物分子形成环境响应性化学键连接。本发明中，自聚发光分子最优选四苯基乙烯(Tetraphenylethylene,TPE)和娃杂环戍二烯。其中，硅杂环戊二烯即噻咯(silole)。
[0019]本发明中，环境响应性化学键是指其稳定性随环境条件改变的化学键，具体可以是酶敏感的脂键，PH敏感的腙键、脲键和希夫碱，氧化还原敏感的二硫键和葡萄糖敏感的硼酸键。
[0020]本发明中，所述荧光药物分子没有特别限定，任何能够发荧光并能与自聚发光分子通过环境响应性化学键连接并产生荧光能量共振转移的药物分子均可用于本发明，优选阿霉素、姜黄素、阿柔比星、佐柔比星和表柔比星等。
[0021]本发明中，有机溶剂是可与水互溶的有机溶剂，任何这类有机溶剂均可用于本发明，优选二甲基亚讽(Dimethyl sulfoxide, DMS0)、四氢呋喃(Tetrahydrofuran, THF)>N，N- 二甲基甲酸胺(N，N-Dimethylformamide, DMF)和甲醇(Methanol)等。具体实施中，可以仅用一种有机溶剂，也可以使用两种以上上述有机溶剂的混合物。
[0022]作为本发明的一个优选技术方案，所述方法包括:
[0023](I)将自聚发光分子溶于有机溶剂中，配成浓度为0.001-0.05M的溶液，按有机溶剂的10_4至10_3体积加入酸进行催化，然后按自聚发光分子摩尔量的1-3倍加入荧光药物分子，50-70°C搅拌加热反应12-48小时，得到荧光药物分子复合物；
[0024](2)将所述荧光药物分子复合物溶于可与水互溶的有机溶剂中，配成浓度为10-500mM的悬乳液，在超声条件下，按悬乳液与水的体积比为10_4至10_2的比例滴加到水中，制得荧光药物分子复合纳米粒子。
[0025]其中，步骤(1)中的有机溶剂可以是甲醇、二甲基亚砜、四氢呋喃和N，N-二甲基甲酰胺等；酸可以是三氟乙酸、醋酸或盐酸等有机酸或无机酸；加入酸的体积可以是有机溶剂体积的10-4、2\10-4、5\10-4、8父10-4或10-3体积等；荧光药物分子可以是阿霉素、姜黄素、阿柔比星、佐柔比星和表柔比星等可以与自聚发光分子发生荧光能量共振转移的药物分子；自聚发光分子溶液的浓度可以是0.001M、0.002M、0.005M、0.008M、0.01M、0.02M、
0.03M、0.04M、0.045或0.048等；加入的荧光药物分子可以是自聚发光分子摩尔量的1.0倍、1.2 倍、1.4 倍、1.6 倍、1.8 倍、2.0 倍、2.2 倍、2.4 倍、2.5 倍、2.7 倍、2.8 倍或 3.0 倍等；加热反应的温度可以是50°C、52°C、55°C、58°C、60°C、62°C、65°C、68°C或69°C等；加热反应的时间可以是12小时、18小时、24小时、28小时、32小时、36小时、40小时、44小时或46小时等。
[0026]其中，步骤(2)中可与水互溶的有机溶剂可以是甲醇、二甲基亚砜、四氢呋喃和N，N-二甲基甲酰胺等；荧光药物分子复合物悬乳液浓度可以是20禮、501111、1001111、1501111、200mM、300mM,400mM或480mM等；超声条件可以是超声频率为20_40KHz，超声时间为5-10min,比如 20KHz 超声 10min、24KHz 超声 9min、28KHz 超声 8min、32KHz 超声 7min、36KHz超声6min或40KHz超声5min等,优选40KHz超声5min ;悬乳液与水的体积比可以是10'2 X 10' 5 X 10'8 X 10' 10' 2 X 10' 5 X 10'8 X KT3 或 KT2 等。
[0027]在第三方面，本发明提供一种如第二方面所述的方法制备的荧光药物分子复合纳米粒子。
[0028]优选地，所述荧光药物分子复合纳米粒子的平均粒径为80-200nm，例如80nm、90nm、lOOnm、110nm、120nm、130nm、140nm、150nm、160nm、170nm、180nm、190nm 或 200nmo
[0029]在第四方面，本发明提供一种对细胞内药物的空间释放进行荧光监测的方法，包括:
[0030](a)将上述的荧光药物分子复合纳米粒子溶解于待监测细胞的培养基中，得到分散液；
[0031](b)将所述分散液与待监测细胞接触，然后洗去未进入细胞的荧光药物分子复合纳米粒子；
[0032]优选地，采用pH为7.4的磷酸盐缓冲液洗去未进入细胞的荧光药物分子复合纳米粒子；
[0033](c)将步骤(b)得到的细胞在缓冲液中孵育，然后进行激光共聚焦显微镜观察；
[0034]优选地，所述缓冲液为pH为7.4的磷酸盐缓冲液。
[0035]在第五方面，本发明提供一种上述的荧光药物分子复合纳米粒子在对细胞内药物的空间释放进行荧光监测中的应用。
[0036]本发明的有益效果为:本发明的荧光药物分子复合纳米粒子，包括自聚发光分子通过环境响应性化学键与荧光药物分子连接形成的荧光药物分子复合物，所述环境响应性化学键随环境条件的改变而被打开，自聚发光分子与突光药物分子分离，自聚发光分子和荧光药物分子分别产生发荧光现象，通过荧光现象的变化对药物在空间上的释放过程进行荧光可视化监测。因此，本发明的荧光药物分子复合纳米粒子作为具有荧光自定位功能的药物递送系统，能够示踪药物在生物体内的真正位置。
【专利附图】
【附图说明】
[0037]图1是本发明实施例1制备的药物递送系统的透射电镜(TEM)图。
[0038]图2是本发明实施例1制备的药物递送系统的粒径分布图。
[0039]图3是本发明实施例1制备的药物递送系统的表面电位分布图。
[0040]图4是本发明实施例2制备的复合荧光药物分子的质谱图。 [0041]图5是本发明实施例3制备的药物递送系统的透射电镜(TEM)图。
[0042]图6是本发明实施例1制备的药物递送系统在乳腺癌细胞MCF-7中药物空
[0043]间释放的荧光共聚焦显微镜图片。
【具体实施方式】
[0044]下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，以下实施例仅为本发明的优选实施例，以便于更好地理解本发明，因而不应视为限定本发明的范围。对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂厂商购买得到的。
[0045]实施例1:pH敏感的腙键连接四苯基乙烯和药物阿霉素制备的荧光药物分子复合纳米粒子
[0046]本实施例通过如下步骤制备荧光药物分子复合纳米粒子，即药物递送系统。
[0047]在三口烧瓶中，将40.6mg(0.1mmol)自聚发光分子四苯基乙烯的羧基化合物(合成所得，参照文献:Adv.Mater.，do1: 10.1002/adma.201302365)溶解到含有 150mg (0.4mmol)2- (7-偶氮苯并三氮唑)-N, N，N’，N’ -四甲基脲六氟磷酸酯(HATU，购自国药集团化学试剂有限公司，货号:xw020053)的N，N-二甲基甲酰胺(DMF，购自国药集团化学试剂有限公司，货号:C348435000)溶液中，然后再加入34.7iiL (0.2mmol)的N，N-二异丙基乙胺(DIEA，购自Sigma公司，货号:3087649)，使四苯基乙烯上的羧基基团活化，然后再向反应体系中加入50.8mg (0.2mmol)的9-荷基甲基肼基甲酸酯(Fmoc-肼,购自北京博迈杰科技有限公司，货号:20110225)。室温剧烈搅拌反应24小时。反应完成后，向反应体系中加入相当于反应体系20%的哌啶(购自国药集团化学试剂有限公司，货号:80104216)，以脱去Fmoc保护基团，使四苯基乙烯带有一个氨基的活性基团。
[0048]取20.3mg (0.05mmol)的以上制得的带有氨基的四苯基乙烯溶解到IOmL甲醇中，并加入IOiiL三氟乙酸(购自Sigma公司，货号:302031 )，然后再加入58mg (0.1mmol)的盐酸阿霉素(购自大连美仑生物技术有限公司，货号:MB1087)荧光药物分子，于三口烧瓶中60°C剧烈搅拌加热反应24小时，得到腙键连接的四苯基乙烯-阿霉素复合荧光药物分子。
[0049]取9.46mg四苯基乙烯-阿霉素复合荧光药物分子溶解到100 y L的DMS0(购自美国AMRESC0公司，货号:0231)溶液中，得到IOOmM的四苯基乙烯-阿霉素复合荧光药物分子溶液。然后在超声条件下，将I U L的四苯基乙烯-阿霉素复合荧光药物分子DMSO溶液滴加到ImL超纯水中(美国Millipore公司纯水仪制备)，制得四苯基乙烯-阿霉素复合荧光药物递送系统，即荧光药物分子复合纳米粒子。
[0050]实施例2:pH敏感的腙键连接四苯基乙烯和药物阿霉素制备的荧光药物分子复合纳米粒子
[0051]本实施例通过如下步骤制备荧光药物分子复合纳米粒子，即药物递送系统。
[0052]在三口烧瓶中，将40.6mg (0.lmmol)自聚发光分子四苯基乙烯的羧基化合物(合成所得，参照文献:Adv.Mater.，do1:10.1002/adma.201302365)溶解到含有20mL乙醇(购自国药集团化学试剂有限公司，货号:10009218)中，于70°C加热搅拌，得酯化后的四苯基乙烯，然后再加入7.5mg (0.2mmol)的水合肼(购自国药集团化学试剂有限公司，货号:80070418)，于IOmL 二氯甲烷(购自国药集团化学试剂有限公司，货号:80047318)溶剂中搅拌反应24小时，得到带有活性氨基的四苯基乙烯。
[0053]取20.3mg (0.05mmol)的以上制得的带有氨基的四苯基乙烯溶解到IOmL甲醇(购自国药集团化学试剂有限公司，货号:40064260)中，并加入20 ii L三氟乙酸，然后再加入58mg (0.lmmol)的盐酸阿霉素荧光药物分子，于三口烧瓶中60°C剧烈搅拌反应24小时，得到腙键连接的四苯基乙烯-阿霉素复合荧光药物分子。
[0054]取9.46mg四苯基乙烯-阿霉素复合荧光药物分子溶解到100 y L的DMSO溶液中，得到IOOmM的四苯基乙烯-阿霉素复合荧光药物分子溶液。然后在超声条件下，将I U L的四苯基乙烯-阿霉素复合荧光药物分子DMSO溶液滴加到超纯水中，制得四苯基乙烯-阿霉素复合荧光药物递送系统，即荧光药物分子复合纳米粒子。
[0055]实施例3:pH敏感的腙键连接硅杂环戊二烯和药物阿霉素制备的荧光药物分子复合纳米粒子
[0056]本实施例通过如下步骤制备荧光药物分子复合纳米粒子，即药物递送系统。
[0057]在三口烧瓶中，将50.6mg (0.lmmol)自聚发光分子娃杂环戍二烯的羧基化合物(合成所得，参照文献:Chem.Mater.，2003，15，1535-1546.)溶解到含有 150mg (0.4mmol)2- (7-偶氮苯并三氮唑)-N, N，N’，N’ -四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)的N，N- 二甲基甲酰胺(DMF)溶液中，然后再加入34.7 ii L (0.2mmol)的N，N- 二异丙基乙胺(DIEA)，使硅杂环戊二烯上的羧基基团活化，然后再向反应体系中加入50.8mg (0.2mmol)的9-芴基甲基肼基甲酸酯(Fmoc-肼)。室温剧烈搅拌反应24小时。反应完成后，向反应体系中加入相当于反应体系20%的哌啶，以脱去Fmoc保护基团，使硅杂环戊二烯带有一个氨基的活性基团。
[0058]取26mg (0.05mmol)的以上制得的带有氨基的娃杂环戍二烯溶解到IOmL甲醇中，并加入20iiL三氟乙酸，然后再加入58mg (0.lmmol)的盐酸阿霉素荧光药物分子，于三口烧瓶中60°C剧烈搅拌反应24小时，得到腙键连接的硅杂环戊二烯-阿霉素复合荧光药物分子。
[0059]取10.45mg硅杂环戊二烯-阿霉素复合荧光药物分子溶解到100 y L的DMSO溶液中，得到IOOmM的硅杂环戊二烯-阿霉素复合荧光药物分子溶液。然后在超声条件下，将I U L的硅杂环戊二烯-阿霉素复合荧光药物分子DMSO溶液滴加到超纯水中，制得硅杂环戊二烯-阿霉素复合荧光药物递送系统，即荧光药物分子复合纳米粒子。
[0060]实施例4:通过水解酶敏感的脂键连接自聚发光荧光分子硅杂环戊二烯和药物姜黄素制备的荧光药物分子复合纳米粒子
[0061]本实施例通过如下步骤制备荧光药物分子复合纳米粒子，即药物递送系统。[0062]在三口烧瓶中，将50.6mg (0.lmmol)自聚发光荧光分子硅杂环戊二烯的羧基化合物(合成所得，参照文献:Chem.Mater.，2003，15，1535-1546.)溶解到含有24.72mg(0.12mmol)的N，N’ - 二环己基碳二亚胺(DCC,购自国药集团化学试剂有限公司，货号:30056326)的N，N- 二甲基甲酰胺(DMF)溶液中，于冰浴中搅拌0.5h，再加入1.22mg(0.01mmol)的二甲基氨基吡啶(DMAP，购自国药集团化学试剂有限公司，货号:30198415)和73.6mg (0.2mmol)的姜黄素(购自国药集团化学试剂有限公司，货号:71012660)于室温下搅拌24h，得到脂键连接的硅杂环戊二烯-姜黄素复合荧光药物分子。
[0063]取85.6mg的硅杂环戊二烯-姜黄素复合荧光药物分子溶解到100 y L的DMSO溶液中，得到IOOmM的硅杂环戊二烯-姜黄素复合荧光药物分子溶液。然后在超声条件下，将I U L的硅杂环戊二烯-姜黄素复合荧光药物分子DMSO溶液滴加到超纯水中，制得硅杂环戊二烯-姜黄素复合荧光药物递送系统，即荧光药物分子复合纳米粒子。
[0064]实施例5:氧化还原敏感的二硫键连接四苯基乙烯和药物表柔比星制备的荧光药物分子复合纳米粒子
[0065]本实施例通过如下步骤制备荧光药物分子复合纳米粒子，即药物递送系统。
[0066]在三口烧瓶中，将40.6mg (0.lmmol)自聚发光分子四苯基乙烯的羧基化合物溶解到含有24.72mg (0.12mmol)的N，N’- 二环己基碳二亚胺(DCC)的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中，于冰浴中搅拌0.5h，再加入1.22mg (0.01mmol)的二甲基氨基吡啶(DMAP)和15.7mg (0.2mmol)的巯基乙醇(购自国药集团化学试剂有限公司，货号:80076928)于室温下搅拌24h，反应完成后，得到末端带有巯基的自聚发光分子四苯基乙烯。
[0067]取23.3mg (0.05mmol)的以上制得的带有巯基的自聚发光分子四苯基乙烯溶解到IOmLDMF中，并加入0.1mmol的2-吡啶基二硫基乙基胺(购自南京精瑞久安生物技术有限公司，产品编号:JRS_0052)，于三`口烧瓶中室温搅拌反应24小时，得到末端带有氨基的自聚发光分子四苯基乙烯。
[0068]取5.41mg (0.01mmol)以上制得的末端带有氨基的自聚发光分子四苯基乙烯与10.86mg (0.02mmol)的表柔比星与含有乙酸(购自国药集团化学试剂有限公司，货号:10000208)的DMSO中，于70°C搅拌反应2h后加入0.04mmol的氰基硼氢化钠(购自Sigma公司，货号:156159)继续反应2h后，制得四苯基乙烯-表柔比星复合荧光药物分子。
[0069]取10.52mg以上制得的四苯基乙烯-表柔比星复合荧光药物分子溶解到100 y L的DMSO溶液中，得到IOOmM的四苯基乙烯-表柔比星复合荧光药物分子溶液。然后在超声条件下，将I U L的四苯基乙烯-表柔比星复合荧光药物分子DMSO溶液滴加到超纯水中，制得四苯基乙烯-表柔比星复合荧光药物递送系统，即荧光药物分子复合纳米粒子。
[0070]实施例6:葡萄糖敏感硼酸键连接四苯基乙烯和药物佐柔比星制备的荧光药物分子复合纳米粒子
[0071]本实施例通过如下步骤制备荧光药物分子复合纳米粒子，即药物递送系统。
[0072]在三口烧瓶中，将40.6mg (0.lmmol)的自聚发光突光分子四苯基乙烯的羧基化合物溶解到含有150mg (0.4mmol)2- (7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中，然后再加入34.7 y L (0.2mmol)的N，N-二异丙基乙胺(DIEA)，使四苯基乙烯上的羧基基团活化，然后再向反应体系中加入3Img (0.2mmol)的3-氨基苯硼酸(购自Sigma公司，货号:287512)。室温剧烈搅拌反应24小时。反应完成后，得到末端带有苯硼酸基团的自聚发光分子四苯基乙烯。
[0073]将31mg (0.2臟01)的2，3-二羟基苯甲酸(购自Sigma公司，货号:126209)溶解到含有300mg (0.8mmol)2- (7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中，然后再加入69.4iiL (0.4mmol)的N，N-二异丙基乙胺(DIEA)，使2，3- 二羟基苯甲酸上的羧基基团活化，然后再向反应体系中加入258.4mg(0.4mmol)的佐柔比星。室温剧烈搅拌反应24小时。反应完成后，得到末端带有2，3-二羟基苯甲酸的佐柔比星。
[0074]然后，取0.05mmol的末端带有苯硼酸基团的自聚发光分子四苯基乙烯与
0.05mmol的末端带有2，3- 二羟基苯甲酸的佐柔比星于三蒸水中混合，得到葡萄糖敏感硼酸键连接的四苯基乙烯-药物佐柔比星荧光药物分子复合物。
[0075]取12.88mg以上制得的四苯基乙烯-药物佐柔比星荧光药物分子复合物溶解到IOOii L的DMSO溶液中，得到IOOmM的四苯基乙烯-药物佐柔比星荧光药物分子溶液。然后在超声条件下，将I U L的四苯基乙烯-药物佐柔比星荧光药物分子的DMSO溶液滴加到超纯水中，制得四苯基乙烯-药物佐柔比星荧光药物分子复合的荧光药物递送系统，即荧光药物分子复合纳米粒子。
[0076]测试实施例1
[0077]通过Hitachi公司的透射电镜(型号:HT7700)按照其说明书中方法，对实施例1中制得的四苯基乙烯-阿霉素复合荧光药物递送系统进行了纳米形貌的观察。 [0078]将上述10 L (100 M)四苯基乙烯-阿霉素复合荧光药物递送系统滴到铜网上，待其干燥后，进行透射电镜测定。观察得实施例1中所制备的荧光药物递送系统的形貌为圆球状，粒径约为134nm。具有如图1所示的形貌以及大小。图1的结果说明实施例1中制备的纳米药物递送系统具有良好的形貌以及纳米尺度。
[0079]通过Malvern公司的动态光散射仪，并按照其说明书中方法，对实施例1中制备的四苯基乙烯-阿霉素复合荧光药物递送系统进行动态光散射(Zetasizer NanoZS)测定，测得实施例1中制备的纳米药物递送系统具有如图2所示的粒径分布。图2的结果说明所制备的四苯基乙烯-阿霉素复合荧光药物递送系统粒径分布较为均一。
[0080]通过Malvern公司的动态光散射仪，并按照其说明书中方法，对实施例1中制备的四苯基乙烯-阿霉素复合荧光药物递送系统进行了表面电位的测定，测得实施例1中所制备的纳米药物递送系统的表面电位为42.7mV。具有如图3所示的表面电位分布。图3的结果表明纳米药物递送系统表面由于氨基的存在，具有较强的正电荷。
[0081]对实施例2-6制备的药物递送系统进行如上相同测试，得到与实施例1中制备的药物递送系统基本相同的检测结果，在此不再赘述。
[0082]测试实施例2
[0083]通过Bruker公司的质谱仪(型号:Microflex LRF),并按照其说明书中方法,对实施例2中制得的四苯基乙烯-阿霉素复合荧光药物分子进行了分子量测定。
[0084]将上述0.1mg四苯基乙烯-阿霉素复合荧光药物分子溶解到ImL甲醇中，然后吸取I UL样品与IiiL的2，5-二羟基苯甲酸(购自Bruker公司，货号:205931)混合后滴到质谱的载样板上，待其干燥后，进行质谱测定。测定得实施例2中所制备的荧光药物复合分子的分子量为946.1Da，具有如图4所示的分子量分布。图4的结果说明荧光药物分子是由四苯基乙烯和荧光药物分子阿霉素组成。
[0085]对实施例1和3-6制备的药物递送系统进行如上相同测试，得到与实施例2中制备的药物递送系统基本相同的检测结果，在此不再赘述。
[0086]测试实施例3
[0087]通过Hitachi公司的透射电镜(型号:HT7700)按照其说明书中方法，对实施例3中制得的硅杂环戊二烯-阿霉素复合荧光药物递送系统进行了纳米形貌的观察。 [0088]将上述10 L (100 M)硅杂环戊二烯-阿霉素复合荧光纳米药物递送系统滴到铜网上，待其干燥后，进行透射电镜测定。观察得实施例3中所制备的荧光药物递送系统的形貌为圆球状，粒径约为200nm。具有如图5所示的形貌以及大小。图5的结果说明实施例3中制备的纳米药物递送系统具有良好的形貌以及纳米尺度。
[0089]对实施例2和4-6制备的药物递送系统进行如上相同测试，得到与实施例1中制备的药物递送系统基本相同的检测结果，在此不再赘述。
[0090]测试实施例4
[0091]通过OLYMPUS公司的荧光共聚焦显微镜(型号:FV1000)按照其说明书中方法，对实施例1中制得的四苯基乙烯-阿霉素复合荧光药物递送系统在乳腺癌细胞中的药物空间释放进行了荧光可视化分析。
[0092]取IOmM的四苯基乙烯-阿霉素复合荧光药物纳米粒子I U L，用高糖培养基(购自life technology公司，货号:11965-092)稀释至2mL,得到5 y M的四苯基乙烯-阿霉素复合荧光药物纳米粒子的培养基悬液2mL。然后将得到的培养基悬液与乳腺癌细胞MCF-7细胞于37°C共培养2h，然后再向细胞培养液中加入2 u L绿色溶酶体定位荧光染料(购自lifetechnology公司，货号:L_7526,用来示踪溶酶体，以证明本发明涉及的药物递送系统在细胞中的溶酶体低PH条件下的释放)，孵育IOmin后，将含有药物递送系统和溶酶体定位荧光染料的培养基吸走，再用PH7.4的磷酸缓冲液洗去未进入细胞的荧光药物分子复合纳米粒子和溶酶体定位荧光染料；然后向清洗过的细胞中加入2mL pH7.4的磷酸缓冲液，置于激光共聚焦显微镜下进行观察；观察得实施例1中所制备的荧光药物递送系统在细胞内的药物释放位置，以及载体在细胞中的位置和药物的作用位置。图6的结果说明实施例1中制备的纳米药物递送系统可以通过荧光变化揭示药物在细胞中的空间释放。通过PH敏感键连接的药物递送系统在溶酶体的低PH环境中释放药物阿霉素，释放出的药物进入细胞核中发挥作用，自聚发光分子(四苯基乙烯)未进入细胞核，定位在细胞质中。
[0093]对实施例2-6制备的药物递送系统进行如上相同测试，得到与实施例1中制备的药物递送系统基本相同的检测结果，在此不再赘述。
[0094] 申请人:声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细特征以及详细方法，但本发明并不局限于上述详细特征以及详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细特征以及详细方法才能实施。所属【技术领域】的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明选用组分的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
【权利要求】
1.一种荧光药物分子复合纳米粒子，包括自聚发光分子通过环境响应性化学键与荧光药物分子连接形成的荧光药物分子复合物。
2.根据权利要求1所述的荧光药物分子复合纳米粒子，其特征在于，所述复合纳米粒子是自聚发光分子通过环境响应性化学键与荧光药物分子连接形成的荧光药物分子复合物自组装形成的。
3.根据权利要求1或2所述的荧光药物分子复合纳米粒子，其特征在于，所述自聚发光分子带有活性官能团； 优选地，所述活性官能团选自氨基、羧基、羟基、巯基和叠氮； 优选地，所述自聚发光分子选自四苯基乙烯和硅杂环戊二烯； 优选地，所述环境响应性化学键选自酶敏感的脂键，PH敏感的腙键、脲键和希夫碱，氧化还原敏感的二硫键和葡萄糖敏感的硼酸键； 优选地，所述荧光药物分子选自阿霉素、姜黄素、阿柔比星、佐柔比星和表柔比星。
4.一种制备权利要求1-3任一项所述的荧光药物分子复合纳米粒子的方法，包括: (1)使自聚发光分子与荧光药物分子接触，形成环境响应性化学键，得到荧光药物分子复合物； (2)将所述荧光药物分子复合物溶于可与水互溶的有机溶剂配成悬浮液，然后将所述悬浮液在超声条件下滴加到水中，制得所述荧光药物分子复合纳米粒子。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述自聚发光分子带有活性官能团； 优选地，所述活性官能团选自氨基、羧基、羟基、巯基和叠氮； 优选地，所述自聚发光分子选自四苯基乙烯和硅杂环戊二烯； 优选地，所述环境响应性化学键选自酶敏感的脂键，PH敏感的腙键、脲键和希夫碱，氧化还原敏感的二硫键和葡萄糖敏感的硼酸键； 优选地，所述荧光药物分子选自阿霉素、姜黄素、阿柔比星、佐柔比星和表柔比星。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述可与水互溶的有机溶剂选自二甲基亚砜、四氢呋喃、N，N- 二甲基甲酰胺和甲醇。
7.根据权利要求4-6任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括: (1)将自聚发光分子溶于有机溶剂中，配成浓度为0.001-0.05M的溶液，按有机溶剂的10_4至10_3体积加入酸进行催化，然后按自聚发光分子摩尔量的1-3倍加入荧光药物分子，50-70°C搅拌加热反应12-48小时，得到荧光药物分子复合物； (2)将所述荧光药物分子复合物溶于可与水互溶的有机溶剂中，配成浓度为10-500mM的悬乳液，在超声条件下，按悬乳液与水的体积比为10_4至10_2的比例滴加到水中，制得荧光药物分子复合纳米粒子。
8.—种如权利要求4-7任一项所述的方法制备的荧光药物分子复合纳米粒子； 优选地，所述荧光药物分子复合纳米粒子的平均粒径为80-200nm。
9.一种对细胞内药物的空间释放进行荧光监测的方法，包括: Ca)将如权利要求1、2、3或8所述的荧光药物分子复合纳米粒子溶解于待监测细胞的培养基中，得到分散液； (b)将所述分散液与待监测细胞接触，然后洗去未进入细胞的荧光药物分子复合纳米粒子；优选地，采用pH为7.4的磷酸盐缓冲液洗去未进入细胞的荧光药物分子复合纳米粒子; (c)将步骤(b)得到的细 胞在缓冲液中孵育，然后进行激光共聚焦显微镜观察； 优选地，所述缓冲液为pH为7.4的磷酸盐缓冲液。
10.如权利要求1、2、3或8所述的荧光药物分子复合纳米粒子在对细胞内药物的空间释放进行荧光监测中的应用。
【文档编号】G01N21/64GK103611164SQ201310625937
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2013年11月28日 优先权日:2013年11月28日
【发明者】梁兴杰, 薛向东, 邹国漳, 张春秋 申请人:国家纳米科学中心