使用荧光染料fitc与mito鉴定混合精子的方法
【专利摘要】一种使用荧光染料FITC与MITO鉴定混合精子的方法，属精子鉴定方法，将FITC粉末中加入DMSO配置FITC浓储液，将MITO粉末中加入DMSO配置MITO浓储液，HEPES、氯化镁、氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、碳酸氢钠、丙酮酸钠、葡萄糖、乳酸钠、牛血清白蛋白和超纯水配置stainingtalp精子染色缓冲液，精子FITC染色、MITO染色，将用FITC染色后的精子与用MITO染色后的精子等量混合，FITC、MITO染色后和FITC染色与MITO染色后的精子等量混合后3h荧光检测。本发明的有益效果是：在不影响精子活力的条件下，只通过两种荧光染光可将形态相近的精子在一定时间内区分出来。
【专利说明】使用荧光染料FI TC与MITO鉴定混合精子的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于一种精子鉴定方法，特别涉及一种使用荧光染料FITC与MITO鉴定混合精子的方法。
【背景技术】
[0002]不同物种的精子从形态上具有一定差别，可以通过形态进行辨别，但有些物种的精子形态相近、大小、精头部轮廓、尾部的长度仅仅通过显微镜进行辨别具有一定难度，特别是将两种精子混合后很难再区分彼此。目前对于形态相近的精子最好的方法就是通过不同的颜色进行辨别。将不同精子用不同染料染色后混合，可以通过各自的颜色来区分不同的精子，但荧光染料品种很多，由于染料没有特异性，因此混合后的不同精子染色后极易发生串色现象，串色后染成不同颜色的精子就变成同样颜色无法区分；有的对精子活力有影响；有的荧光持续时间短。为此，需要寻找出一种即能不影响精子活力，又可以不串色的将形态相近、无法通过显微镜进行区别的精子进行辨别的方法。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于提供一种使用荧光染料FITC与MITO鉴定混合精子的方法，该技术原理是利用FITC可以与精子膜蛋白结合发出黄绿色荧光，MITO与精子线粒体结合发出红色荧光，FITC与MITO对精子活力均无影响，两种不同精子用两种染料各自染色后混合在荧光下可区分两种精子。
[0004]本发明的目的是通过以下技术方案实现的:一种使用荧光染料FITC与MITO鉴定混合精子的方法，其特征在于:它包括以下步骤:
[0005]一、配制试剂:
[0006]( I)配置FITC浓储液:
[0007]将FITC粉末中加入DMS0，使其终浓度为0.5M，分装后避光在_20°C保存，使用期限为I年；
[0008](2)配置MITO浓储液:
[0009]将MITO粉末中加入DMS0，使其终浓度为0.069mM/L,分装后避光在_20°C保存，使用期限为I年；
[0010](3)配置staining talp精子染色缓冲液:
[0011]
【权利要求】
1.一种使用荧光染料FITC与MITO鉴定混合精子的方法，其特征在于:它包括以下步骤: 一、配制试剂: (1)配置FITC浓储液: 将FITC粉末中加入DMS0，使其终浓度为0.5Μ，分装后避光在_20°C保存，使用期限为I年； (2)配置MITO浓储液: 将MITO粉末中加入DMS0，使其终浓度为0.069mM/L,分装后避光在_20°C保存，使用期限为I年； (3)配置stainingtalp精子染色缓冲液: HEPES40mM/L 氯化镁0.4mM/L 氯化钠95mM/L 氯化钾3mM/L 磷酸氢二钠0.3mM/L 碳酸氢钠10mM/L 丙酮酸钠2mM/L 葡萄糖5mM/L 乳酸钠25mM/L 牛血清白蛋白3g/L 超纯水其余为超纯水； 二、精子染色: (1)精子FITC染色:①取500万精子加入5ml的stainingtalp精子染色缓冲液，使精子终浓度为100万/ml ； ②在步骤①的精子溶液中加入0.75μ1的FITC浓储液，使其终浓度为0.077mM/L,轻轻摇动将染色液摇匀； ③在37°C避光染色40分，将染色的精子轻轻摇晃； ④染色结束后，1500rpm离心10分,弃上清,再加入5mlstaining talp精子染色缓冲液，轻轻摇动；⑤1500rpm离心10分,弃上清,再加入5mlstaining talp精子染色缓冲液,轻轻摇动； ⑥1500rpm离心10分，弃上清，加入250μ1staining talp精子染色缓冲液; (2)精子MITO染色:①取500万精子加入5ml的stainingtalp精子染色缓冲液，使精子终浓度为100万/ml ； ②在步骤①的精子溶液中加入1.8?μ1的MITO浓储液，使其终浓度为3.45Χ 10_5mM/L，轻轻摇动将液体摇匀； ③在37°C避光染色10分；④染色结束后，1500rpm离心10分,弃上清,再加入5mlstaining talp精子染色缓冲液，轻轻摇动；⑤1500rpm离心10分,弃上清,再加入5mlstaining talp精子染色缓冲液,轻轻摇动； ⑥1500rpm离心10分，弃上清，加入250μ1staining talp精子染色缓冲液; (3)精子混合: 将步骤(1)用FITC染色后的精子与步骤(2)用MITO染色后的精子等量混合，放在37°C,3h ； (4)检测: ①对步骤(1)用FITC染色后的精子、步骤(2)用MITO染色后的精子进行荧光检测； ②对步骤(3)FITC染色后的精子与MITO染色后的精子等量混合后3h的混合精子进行荧光检测。`
【文档编号】G01N1/28GK103822816SQ201310685086
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2013年12月16日 优先权日:2013年12月16日
【发明者】苏杰, 李喜和, 赵高平, 胡树香, 孙伟 申请人:内蒙古赛科星繁育生物技术股份有限公司