禾谷类作物籽粒中β-葡聚糖含量的测定方法
【专利摘要】本发明提供一种禾谷类作物籽粒中β-葡聚糖含量的测定方法，其中采用的酶测定方法具有与标准方法一致的准确度和专一性，种子用量少，且使用廉价易得的酶，适用于珍稀种质资源小批量多批次长期、连续测定的工业生产的需要。
【专利说明】禾谷类作物好粒中β-葡聚糖含量的测定方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及化学分析领域，具体地说，涉及禾谷类作物籽粒中β -葡聚糖含量的测定方法。
【背景技术】
[0002]β -葡聚糖是禾草与禾谷类作物籽粒中特有的一种多糖，在大麦和燕麦中含量较高。其中80%的β_葡聚糖是可溶的。大量研究表明，β_葡聚糖具有降低血糖、降低胆固醇、减少心血管疾病、预防糖尿病等生理功能。燕麦β-葡聚糖还可通过促进肠道蠕动、抑制肠道内酶的水解能力等功能减少机体的糖吸收总量，从而缓解高血糖症状，且该作用与燕麦β-葡聚糖的浓度和分子量呈正相关。因此，燕麦β-葡聚糖的开发和利用日益受到重视。开发一种准确可靠经济的β-葡聚糖含量测定方法对于β_葡聚糖的利用至关重要。
[0003]现有的β -葡聚糖测定方法包括苯酚-硫酸法、刚果红法、酶测定法、荧光法和高效液相色谱法等。其中，酶测定法因其反应专一，准确性和可靠性高，是目前国际上较通用的测定方法。但其检测试剂盒价格昂贵，大量使用成本高。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种禾谷类作物籽粒中β -葡聚糖含量的测定方法。
[0005]为了实现本发明目的，本发明的一种禾谷类作物籽粒中β -葡聚糖含量的测定方法，包括以下步骤:
[0006]I)从纤维酶中纯化葡聚糖酶；
[0007]2)样品溶液的配制:籽粒晒干粉碎，将粉末样品用酒精润湿，加入NaOH溶液混匀后放置14-16h，然后调pH值呈中性，离心后取上清，即得样品溶液；
[0008]3)葡萄糖标准液的配制；
[0009]4)葡萄糖转化:向上述样品溶液中加入琥珀酸钠缓冲液和步骤I)中纯化的葡聚糖酶，于35-40°C水浴中保温2-3h ；
[0010]5)显色测定及标准曲线的绘制:向步骤3)的葡萄糖标准液中依次加入醋酸钠缓冲液、琥珀酸钠缓冲液和GOPOD显色液，于35-40°C水浴中保温35_45min，然后置于暗处10-15min，在510nm测吸光度值，绘制标准曲线；
[0011]6)样品显色测定及β-葡聚糖含量的计算:采用与步骤5)相同的方法，对步骤4)中所得溶液进行显色测定，根据测定的吸光度值对应于标准曲线上葡萄糖的含量，代入以下计算公式，即得β -葡聚糖的含量:
[0012]β_ 葡聚糖含量(%) =CX50X2.5X100X0.9/(WX 1000) =CX 11.25/W
[0013]其中，C为样品对应的葡萄糖的含量，W为样品重量(以mg计)，0.9为葡萄糖转化成葡萄糖苷的转换因子。
[0014]步骤I)具体为:向0.6g纤维酶中加入IOmL醋酸钠缓冲液，混匀，4000r/min离心5min，然后于70°C水浴中加热50min，随后冰浴Imin ;将溶液转移至渗透膜中，4°C置于3L醋酸钠缓冲液中渗透14h，最后4000r/min离心5min，收集的上清液中含有纯化的葡聚糖酶。
[0015]步骤2)具体为:籽粒晒干粉碎过60目筛，称取100粉末样品用0.2mL50%酒精润湿，加入5.0mLImoI/L NaOH溶液，混匀，于20°C放置14h ;然后调pH值呈中性，将溶液转移至25mL容量瓶中，定容，5000r/min离心取上清，即得样品溶液。
[0016]步骤3)具体为:配制2.5mg/mL的葡萄糖标准液原液，稀释原液至浓度分别为100 μ g/mL、200 μ g/mL、300 μ g/mL 和 400 μ g/mL 的葡萄糖标准液。
[0017]步骤4)具体为:向2个IOmL具塞试管中分别加入0.2mL样品溶液，向一个作为样品分析的试管中加入0.1mL步骤2)中得到的含葡聚糖酶的上清液，向另一个用于空白测定的试管中加入0.1mL醋酸钠缓冲液；向用于酶空白测定的试管中加入0.2mL水和0.1mL步骤2)的上清液；向所有试管中加入0.2mL琥珀酸钠缓冲液，加盖摇匀后于40°C水浴保温2h。
[0018]其中，琥珀酸钠缓冲液的配制方法为:向0.68g琥珀酸钠中加入40mL水溶解，用盐酸调pH值5.5，加入IOmg叠氮钠，溶解后转移至50mL容量瓶中定容，即得。
[0019]步骤5)具体为:取5个试管，向一个试管中加入0.2mL水以作为空白对照，向其它四个试管中分别加入0.2mL各浓度的葡萄糖标准液，然后向5个试管中依次加入0.1mL醋酸钠缓冲液、0.2mL琥珀酸钠缓冲液和3mL GOPOD显色液，于40°C水浴中保温45min，取出试管置于暗处15min，在510nm测吸光度值。
[0020]本发明中所述禾谷类作物包括但不限于大麦和燕麦。
[0021]本发明值涉及的反应方程式为:
[0022]
【权利要求】
1.禾谷类作物籽粒中β-葡聚糖含量的测定方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)从纤维酶中纯化葡聚糖酶； 2)样品溶液的配制:籽粒晒干粉碎，将粉末样品用酒精润湿，加入NaOH溶液混匀后放置14-16h，然后调pH值呈中性，离心后取上清，即得样品溶液； 3)葡萄糖标准液的配制； 4)葡萄糖转化:向上述样品溶液中加入琥珀酸钠缓冲液和步骤I)中纯化的葡聚糖酶，于35-40°C水浴中保温2-3h ； 5)显色测定及标准曲线的绘制:向步骤3)的葡萄糖标准液中依次加入醋酸钠缓冲液、琥珀酸钠缓冲液和GOPOD显色液，于35-40 V水浴中保温35_45min，然后置于暗处10-15min，在510nm测吸光度值，绘制标准曲线； 6)样品显色测定及β-葡聚糖含量的计算:采用与步骤5)相同的方法，对步骤4)中所得溶液进行显色测定，根据测定的吸光度值对应于标准曲线上葡萄糖的含量，代入以下计算公式，即得β -葡聚糖的含量: β -葡聚糖含量(%) =CX50X2.5X100X0.9/(WX 1000) =CX 11.25/W 其中，C为样品对应的葡萄糖的含量，W为粉末样品重量，0.9为葡萄糖转化成葡萄糖苷的转换因子。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤I)具体为:向0.6g纤维酶中加入IOmL醋酸钠缓冲液，混匀，4000r/min离心5min，然后于70°C水浴中加热50min，随后冰浴Imin ;将溶液转移至渗透膜中，4°C置于3L醋酸钠缓冲液中渗透14h，最后4000r/min离心5min,收集的上清液中含有纯化的葡聚糖酶。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)具体为:籽粒晒干粉碎过60目筛，称取100粉末样品用0.2mL50%酒精润湿，加入5.0mLImoI/L NaOH溶液，混匀，于20°C放置14h ;然后调pH值呈中性，将溶液转移至25mL容量瓶中，定容，5000r/min离心取上清，即得样品溶液。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)具体为:配制2.5mg/mL的葡萄糖标准液原液，稀释原液至浓度分别为100 μ g/mL>200 μ g/mL>300 μ g/mL和400 μ g/mL的葡萄糖标准液。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤4)具体为:向2个IOmL具塞试管中分别加入0.2mL样品溶液，向一个作为样品分析的试管中加入0.1mL步骤2)中得到的含葡聚糖酶的上清液，向另一个用于空白测定的试管中加入0.1mL醋酸钠缓冲液；向用于酶空白测定的试管中加入0.2mL水和0.1mL步骤2)的上清液；向所有试管中加入0.2mL琥珀酸钠缓冲液，加盖摇匀后于40°C水浴保温2h ； 其中，琥珀酸钠缓冲液的配制方法为:向0.68g琥珀酸钠中加入40mL水溶解，用盐酸调pH值5.5，加入IOmg叠氮钠，溶解后转移至50mL容量瓶中定容，即得。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤5)具体为:取5个试管，向一个试管中加入0.2mL水以作为空白对照，向其它四个试管中分别加入0.2mL各浓度的葡萄糖标准液，然后向5个试管中依次加入0.1mL醋酸钠缓冲液、0.2mL琥珀酸钠缓冲液和3mL GOPOD显色液，于40°C水浴中保温45min，取出试管置于暗处15min，在510nm测吸光度值。
7.棚权利要求任一项《的方法，期寺征在于，所述禾谷类作物包括但不限于大麦減麦。
【文档编号】G01N21/78GK103743734SQ201310727703
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2013年12月25日 优先权日:2013年12月25日
【发明者】彭远英, 唐雪琴, 颜红海, 周萍萍, 赵军, 王智英, 魏育明 申请人:四川农业大学