一种用于检测液体中微量蛋白的试剂盒及其操作方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于检测液体中微量蛋白的试剂盒及其操作方法，包括A液和B液，A液和B液均是包含0.1M氯化钠的0.1M?PBS缓冲液，A液中包含羧基化磁珠，B液中包含羧基化微球，它们均通过碳化二亚胺法偶联上根据蛋白不同抗原决定簇制备的两个单克隆抗体。与传统光波导生物传感器比较，本案所涉及的试剂盒能够实现重复利用；本发明采用的方法，能够在溶液中快速检测出微量的目标蛋白分子，过程更简单，效率更高，并且能够高通量的检测样品；通过连接微球，能够显著改变光波导免疫传感器中谐振腔的折射率，提高检测灵敏度。
【专利说明】一种用于检测液体中微量蛋白的试剂盒及其操作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及医学体外检测领域，特别涉及一种用于检测液体中微量蛋白的试剂盒及其操作方法。
【背景技术】
[0002]在后基因组时代，关于蛋白质的研究已越来越多地受到国内外科研工作者的关注。其中，微量蛋白更成为目前临床和实验室检测的主要目标之一，因其往往具有十分重要的生理学意义。例如临床上往往需要评价尿液中微量蛋白质的含量(<200mg/L)，来监测肾病的发生。凝血实验中需对丝氨酸蛋白酶的含量(<200mg/L)进行监测，从而确定病人的血栓形成情况和心血管疾病的状况。为此，灵敏检测液体中微量蛋白的方法急需发展。
[0003]目前众多的微量蛋白检测方法中，传统的浊度测定法较为方便易行，但特异性较差；近年来发展起来的邻苯三酚红与金属络合物染料结合法、酶联免疫方法、基于磁珠分离的酶连适配体法等方法灵敏度相对较高，但这些方法往往具有操作复杂，成本较高的缺点，不易于大规模使用。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种用于检测液体中微量蛋白的试剂盒及其操作方法，这种试剂盒与配套的光波导免疫传感器(CN101846674B)配合使用，能够高速、高灵敏度的检测出液体中的微量蛋白分子。同时，该试剂盒还能够回收重复利用，大大降低了检测成本。
[0005]本发明提供一种用于检测液体中微量蛋白的试剂盒，包括A液和B液，其中:
[0006]所述A液是包含0.1M氯化钠的0.1M PBS缓冲液，所述A液中还包含直径为90?150nm的羧基化的磁珠；所述羧基化的磁珠通过碳化二亚胺法将末端氨基修饰的目标蛋白单克隆抗体链接在磁珠上；
[0007]所述B液是包含0.1M氯化钠的0.1M PBS缓冲液，所述B液中还包含直径为90?150nm的羧基化的微球；所述羧基化的微球通过碳化二亚胺法将末端氨基修饰的另一抗原决定簇对应的单克隆抗体链接在微球上。
[0008]优选地，所述的用于检测液体中微量蛋白的试剂盒，所述A液和B液中，PBS缓冲液的pH均为7.3。
[0009]本发明涉及的一种用于检测液体中微量蛋白的试剂盒的操作方法，包括以下步骤:
[0010]I)将光波导免疫传感器开启，先通入A液，所述A液是包含0.1M氯化钠的0.1MPBS缓冲液，所述A液中还包含直径为90?150nm的羧基化的磁珠；所述羧基化的磁珠通过碳化二亚胺法将末端氨基修饰的目标蛋白单克隆抗体链接在磁珠上；在光波导免疫传感器的电磁场作用下，所述羧基化的磁珠被吸附在光波导免疫传感器的谐振腔外，产生基底光波导信号值；
[0011]2)随后将待测样品与B液等体积混合得到混合液，所述B液是包含0.1M氯化钠的0.1M PBS缓冲液，所述B液中还包含直径为90?150nm的羧基化的微球；所述羧基化的微球通过碳化二亚胺法将末端氨基修饰的另一抗原决定簇对应的单克隆抗体链接在微球上；将所述混合液通入光学通道，此时步骤I)中吸附在谐振腔外的磁珠与混合液中的微球通过待测样品中的目标蛋白结合在一起，以此改变谐振腔的折射率，使谐振腔内的光波导信号值发生变化；
[0012]3)配制至少四个含不同浓度的目标蛋白标准液，每个标准液按步骤I)和2)的操作方法得到两个光波导信号值，以目标蛋白浓度为横坐标，两次光波导信号值差值为纵坐标，绘制标准曲线；
[0013]4)将步骤I)和2)所得待测样品的两次光波导信号值差值与所述标准曲线比对，定量检测出待测样品中目标蛋白的存在及其浓度。
[0014]优选地，所述的用于检测液体中微量蛋白的试剂盒的操作方法，所述A液和B液中，PBS缓冲液的pH均为7.3。
[0015]本发明的有益效果是:与传统光波导生物传感器比较，本发明采用的方法能够实现试剂盒的重复利用；与传统微量蛋白检测方法相比，本发明采用的方法，能够在溶液中快速检测出微量乃至于痕量蛋白，过程更简单，效率更高，能够高通量的检测样品；通过连接微球，能够显著改变光波导免疫传感器中谐振腔的折射率，提高检测灵敏度；在检测结束后撤去电磁场，流动液可带出通道内的磁珠与微球，通过吸附、离心等技术手段，能够实现试剂盒主要成分的回收再利用。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1为本发明所述用于检测液体中微量蛋白的试剂盒的工作原理示意图。
【具体实施方式】
[0017]下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
[0018]作为本发明的一个较优实施方案，其所涉及的用于检测液体中微量蛋白的试剂盒，包括A液和B液，其中:
[0019]A液是包含0.1M氯化钠的0.1M PBS缓冲液，该A液中还包含直径为90?150nm的羧基化的磁珠；羧基化的磁珠通过碳化二亚胺法将末端氨基修饰的目标蛋白单克隆抗体链接在磁珠上；PBS缓冲液的pH为7.3。
[0020]B液是包含0.1M氯化钠的0.1M PBS缓冲液，该B液中还包含直径为90?150nm的羧基化的微球，该微球不带磁性；羧基化的微球通过碳化二亚胺法将末端氨基修饰的另一抗原决定簇对应的单克隆抗体链接在微球上；PBS缓冲液的pH为7.3。
[0021]A液和B液中氯化钠的作用是稳定双螺旋结构，增强核酸的热稳定性。
[0022]本发明所涉及的用于检测液体中微量蛋白的试剂盒的操作方法，包括以下步骤:
[0023]I)将与该试剂盒相配套的光波导免疫传感器(CN101846674B)开启，先通入A液，该A液是包含0.1M氯化钠的0.1M PBS缓冲液，A液中还包含直径为90?150nm的羧基化的磁珠；羧基化的磁珠通过碳化二亚胺法将末端氨基修饰的目标蛋白单克隆抗体链接在磁珠上；PBS缓冲液的pH为7.3 ;在光波导免疫传感器的电磁场作用下，羧基化的磁珠被吸附在光波导免疫传感器的谐振腔外，产生基底光波导信号；
[0024]2)随后将待测样品与B液等体积混合得到混合液，B液是包含0.1M氯化钠的0.1MPBS缓冲液，该B液中还包含直径为90?150nm的羧基化的微球；羧基化的微球通过碳化二亚胺法将末端氨基修饰的另一抗原决定簇对应的单克隆抗体链接在微球上；PBS缓冲液的pH为7.3 ;将混合液通入光学通道，此时步骤I)中吸附在谐振腔外的磁珠与混合液中的微球通过待测样品中的目标蛋白结合在一起，以此改变谐振腔的折射率，使谐振腔内的光波导信号发生变化；
[0025]3)配制至少四个含不同浓度的目标蛋白标准液，每个标准液按步骤I)和2)的操作方法得到两个光波导信号值，以目标蛋白浓度为横坐标，两次光波导信号值差值为纵坐标，绘制标准曲线；
[0026]4)将步骤I)和2)所得待测样品的两次光波导信号值差值与所述标准曲线比对，定量检测出待测样品中目标蛋白的存在及其浓度。
[0027]实施例1
[0028](I)试剂盒A液及B液配制
[0029]分别制备直径为90nm的羧基化磁珠和90nm的羧基化微球(不含磁性)，并分别在其上偶联根据钙激活蛋白不同抗原决定簇制备的两个单克隆抗体。
[0030]具体的，上述单克隆抗体均进行末端氨基修饰，抗体与磁珠(或微球)的偶联通过EDC-NHS法，即碳化二亚胺法。A液包含直径为90nm的羧基化磁珠及其偶联的兔抗人Cap43PcAbl ；B液包含直径90nm的羧基化微球及其偶联的兔抗人Cap43PcAb2，上述磁珠和微球均分别悬浮在A液和B液中，A液和B液均为0.1M的PBS缓冲液，pH为7.3，同时含有
0.1M 的 NaCl。
[0031](2)试剂盒应用
[0032]光波导免疫传感器开启后，先使用A液通入，电磁场作用下，磁珠被吸附在谐振腔夕卜，产生基底光波导信号。之后将检测样品与B液等体积混合，并通过光学通道。此时由于A液与B液中的磁珠与微球各自对目标蛋白不同位点的结合，从而使微球连上吸附在谐振腔外的磁珠，以此改变谐振腔的折射率，从而使谐振腔内的光波导信号产生变化。
[0033]配制六个含不同浓度的该蛋白标准液，每个标准液按上述的操作方法得到两个光波导信号值，以该蛋白浓度为横坐标，两次光波导信号值差值为纵坐标，绘制标准曲线；将待测样品的两次光波导信号值差值与标准曲线比对，能够快速、高灵敏度地定量检测出待测样品中该蛋白的存在及浓度。
[0034]实施例2
[0035](I)试剂盒A液及B液配制
[0036]分别制备直径为150nm的羧基化磁珠和150nm的羧基化微球,并分别在其上偶联根据钙激活蛋白不同抗原决定簇制备的两个单克隆抗体。
[0037]具体的，上述单克隆抗体均进行末端氨基修饰，抗体与微球的偶联通过EDC-NHS法。A液包含直径为150nm的羧基化磁珠及其偶联的兔抗人PARsPcAbl ;B液包含直径150nm的羧基化微球及其偶联的兔抗人PARs PcAb2，上述磁珠和微球均分别悬浮在A液和B液中，A液和B液均为0.1M的PBS缓冲液，pH为7.3，同时含有0.1M的NaCl。
[0038](2)试剂盒应用[0039]光波导免疫传感器开启后，先使用A液通入，电磁场作用下，磁珠被吸附在谐振腔夕卜，产生基底光波导信号。之后将检测样品与B液等体积混合，并通过光学通道。此时由于A液与B液中的磁珠与微球各自对目标蛋白不同位点的结合，从而使微球连上吸附在谐振腔外的磁珠，以此改变谐振腔的折射率，从而使谐振腔内的光波导信号产生变化。
[0040]配制四个含不同浓度的该蛋白标准液，每个标准液按上述的操作方法得到两个光波导信号值，以该蛋白浓度为横坐标，两次光波导信号值差值为纵坐标，绘制标准曲线；将待测样品的两次光波导信号值差值与标准曲线比对，能够快速、高灵敏度地定量检测出待测样品中该蛋白的存在及浓度。
[0041]尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。
【权利要求】
1.一种用于检测液体中微量蛋白的试剂盒，其特征在于，包括A液和B液，其中: 所述A液是包含0.1M氯化钠的0.1M PBS缓冲液，所述A液中还包含直径为90?150nm的羧基化的磁珠；所述羧基化的磁珠通过碳化二亚胺法将末端氨基修饰的目标蛋白单克隆抗体链接在磁珠上； 所述B液是包含0.1M氯化钠的0.1M PBS缓冲液，所述B液中还包含直径为90?150nm的羧基化的微球；所述羧基化的微球通过碳化二亚胺法将末端氨基修饰的另一抗原决定簇对应的单克隆抗体链接在微球上。
2.根据权利要求1所述的用于检测液体中微量蛋白的试剂盒，其特征在于，所述A液和B液中，PBS缓冲液的pH均为7.3。
3.一种用于检测液体中微量蛋白的试剂盒的操作方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)将光波导免疫传感器开启，先通入A液，所述A液是包含0.1M氯化钠的0.1M PBS缓冲液，所述A液中还包含直径为90?150nm的羧基化的磁珠；所述羧基化的磁珠通过碳化二亚胺法将末端氨基修饰的目标蛋白单克隆抗体链接在磁珠上；在光波导免疫传感器的电磁场作用下，所述羧基化的磁珠被吸附在光波导免疫传感器的谐振腔外，产生基底光波导信号值； 2)随后将待测样品与B液等体积混合得到混合液，所述B液是包含0.1M氯化钠的0.1MPBS缓冲液，所述B液中还包含直径为90?150nm的羧基化的微球；所述羧基化的微球通过碳化二亚胺法将末端氨基修饰的另一抗原决定簇对应的单克隆抗体链接在微球上；将所述混合液通入光学通道，此时步骤I)中吸附在谐振腔外的磁珠与混合液中的微球通过待测样品中的目标蛋白结合在一起，以此改变谐振腔的折射率，使谐振腔内的光波导信号值发生变化； 3)配制至少四个含不同浓度的目标蛋白标准液，每个标准液按步骤I)和2)的操作方法得到两个光波导信号值，以目标蛋白浓度为横坐标，两次光波导信号值差值为纵坐标，绘制标准曲线； 4)将步骤I)和2)所得待测样品的两次光波导信号值差值与所述标准曲线比对，定量检测出待测样品中目标蛋白的存在及其浓度。
4.根据权利要求3所述的用于检测液体中微量蛋白的试剂盒的操作方法，其特征在于，所述A液和B液中，PBS缓冲液的pH均为7.3。
【文档编号】G01N21/41GK103713124SQ201310731014
【公开日】2014年4月9日 申请日期:2013年12月27日 优先权日:2013年12月27日
【发明者】王帆, 陈名利, 白鹏利, 殷建 申请人:中国科学院苏州生物医学工程技术研究所