邻苯二甲酸酯类总量elisa酶联免疫检测试剂盒及其使用方法
【专利摘要】本发明公开了一种邻苯二甲酸酯类总量ELISA酶联免疫检测试剂盒及其使用方法，属于酶联免疫检测【技术领域】。所述试剂盒包括如下组分：包被有邻苯二甲酸抗原的酶标板、邻苯二甲酸抗体工作液、辣根过氧化物酶标记的二抗、邻苯二甲酸标准溶液、底物液、底物缓冲液、反应终止液、浓缩洗涤液。本发明同时公开了利用所述试剂盒检测样品中邻苯二甲酸酯类总量的方法，样品经过前处理后，利用试剂盒进行检测，对检测结果进行处理，分析出样品中邻苯二甲酸酯类总量。本发明提供的检测邻苯二甲酸的试剂盒采用间接竞争酶联免疫吸附分析技术，灵敏度高、稳定性好，成本低，非常适合大量样品的筛查，具有重要的推广应用价值。
【专利说明】邻苯二甲酸酯类总量ELISA酶联免疫检测试剂盒及其使用方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及ELISA酶联免疫检测【技术领域】。更具体地，涉及一种邻苯二甲酸酯类总量ELISA酶联免疫检测试剂盒及其使用方法。
【背景技术】
[0002]邻苯二甲酸酯(phthalate acid esters,PAEs)类化合物又称为肽酸酯,邻苯二甲酸酯的一般化学结构是由一个刚性平面芳烃和两个可塑的非线性脂肪侧链组成，常温下呈无色油状粘稠液体，难溶于水且不易挥发，凝固点低，易溶于甲醇、乙醇、乙醚等有机溶剂，主要应用于塑料制品，用来提高可塑性和韧性，还用作农药、染料、化妆品、香料和医疗器材的生产原料。PAEs与塑料分子以氢键或范德华力连接，并非以共价键形式牢固结合，因此很容易通过淋洗迁移或蒸发等方式进入室内空气、大气、食品、饮用水及其他物质中，也可以在塑料生产或燃烧过程中通过烟尘沉降释放到环境中。过去一直认为PAEs的毒性很低，因而毫无限制地生产。但后来研究表明，它具有种类多、难以降解、生物富集性强的特点，对人体、生物体及植物均有较大的毒性。研究发现多种PAEs都具有一般毒性和特殊毒性，部分PAEs对动物有致畸和致突变的作用，并显示出较强的内分泌干扰性。邻苯二甲酸酯类污染物对人类的危害主要表现在致癌性、致畸性以及免疫抑制性，尤以造成人体生殖功能异常最为引人注目。PAEs类化合物伴随着烟尘、废弃物、工业和生活垃圾、废水等大量地进入我们生存的环境中，威胁着人类的健康，从而引起越来越多人的关注。
[0003]由于人类社会的大量生产和广泛使用，邻苯二甲酸酯已成为地球上最广泛存在的环境污染物之一，PAEs引起的环境污染已受到全球性关注，邻苯二甲酸酯类化合物被人们称为“第二个全球性PCB污染物”，1977年美国国家环保局(EPA)将DEHP、DOP、BBP, DBP、DEP和DMP这6种PAEs化合物列为优先控制的有毒污染物，我国也将DEP、DMP和DOP这3种PAEs化合物确定为环境优先控制污染物。食品中邻苯二甲酸酯的测定的国家标准GB/T21911-2008中规定含油脂样品中各邻苯二甲酸酯化合物的检出限为1.5mg/kg，不含油脂样品中各邻苯二甲酸酯化合物的检出限为0.05mg/kg。2011年5月，台湾发生全球首例塑化剂污染案，一些食品及饮料制品中检出大量DEHP，经研究发现，食品添加剂生产商将DEHP添加到食品性乳化剂中，以提高食品均匀度。于2012年爆出的白酒塑化剂风波更加重了人们对塑化剂的恐惧。
[0004]目前，PAEs的分析多采用仪器分析法，液相-质谱联用，气相-质谱联用，关皓月(中国新药杂志，2013)等人用气质联用色谱法测定明胶空心胶囊中的邻苯二甲酸酯类化合物，杨荣静(环境化学，2012)等人用高效液相色谱-串联质谱法检测食品接触材料中17种邻苯二甲酸酯类增塑剂。仪器分析方法可以实现多残留检测，其优点是检测精确度高，但因其仪器化程度高、检测时间长、过程繁琐、检测费用昂贵等而阻碍其推广应用，通常是作为实验室的确证方法。
[0005]酶联免疫分析(ELISA)快速检测技术因成本低、操作简单、速度快、一次检测样本量大、仪器化程度低，值得我们推广成为常用的筛选方法。ELISA免疫分析方法的基本原理是:使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本(测定其中的抗体或抗原)和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。
[0006]但是免疫分析方法多为单一酯类的检测，由于邻苯二甲酸酯种类繁多，且多个化合物同时被检测出来的现象十分普遍，但是同时检测所用的方法都为仪器分析法，因此，非常有必要建立可同时检测多个PAEs的多残留检测方法(mult1-residues analysis)。目前国内外未有商品化的邻苯二甲酸酯ELISA检测试剂盒，有关邻苯二甲酸酯免疫分析技术(IA)的报道也极少，目前国内外主要集中在针对单一邻苯二甲酸酯建立特异性免疫检测方法研究，尚无检测邻苯二甲酸酯类总量的全抗原设计与抗体制备的相关研究。
[0007]综上所述，目前国内外现有邻苯二甲酸酯类采用的仪器检测方法复杂、繁琐，很难应用于实际批量检测，且现有其他免疫分析检测方法无法实现多残留检测，严重影响了邻苯二甲酸酯类的检测与监控。因此研制稳定性高、操作简单、设备要求低、廉价且高度灵敏、低检测限的ELISA试剂盒，对于准确快速、高通量检测邻苯二甲酸酯类具有非常重要的经济和社会意义。
【发明内容】
[0008]本发明要解决的技术问题是克服现有邻苯二甲酸酯类多残留检测的技术不足，提供一种高特异性、高灵敏度、价格低廉、操作简单，能大批量快速检测邻苯二甲酸酯类总量的酶联免疫检测试剂盒。
[0009]本发明的目的是提供一种邻苯二甲酸酯类总量ELISA酶联免疫检测试剂盒。
[0010]本发明另一目的是提供所述试剂盒的应用和使用方法。
[0011]本发明上述目的通过以下技术方案实现:
本发明提供了一种邻苯二甲酸酯类总量ELISA酶联免疫检测试剂盒，包括下列各组
分:
(1)包被有邻苯二甲酸抗原的酶标板；
(2)邻苯二甲酸抗体工作液；
(3)辣根过氧化物酶标记的二抗；
(4)邻苯二甲酸标准溶液；
(5)底物液；
(6)底物缓冲液；
(7 )反应终止液；
(8)浓缩洗涤液。
[0012]其中，所述的邻苯二甲酸抗原为半抗原4-氨基邻苯二甲酸与OVA的偶联物，是使用戊二醛法将邻苯二甲酸与卵清蛋白(OVA)共价偶联合成得到的；
包被邻苯二甲酸抗原的包被液优选为将1.69g碳酸钠和2.95g碳酸氢钠溶于IL双蒸水中得到，邻苯二甲酸抗原的包被浓度为0.5mg/L ;封闭液优选为取0.1g牛血清白蛋白(BSA)、5g甘氨酸溶、5g蔗糖于IOOmL磷酸盐缓冲液(PBS溶液)得到。所述PBS溶液的浓度为 0.01mol/L, pH 值为 7.4，配制方法为:准确称取 2.9g 的 NaH2PO4.12H20、8.5g 的 NaCl、
0.2g的KCl、0.2g的KH2PO4，用水定容至1L，灭菌。
[0013]所述酶标板是96或40孔酶标板，材质为聚苯乙烯，包被有能与抗邻苯二甲酸抗体特异性结合的邻苯二甲酸抗原，并封闭微孔表面未吸附邻苯二甲酸抗原的位点。
[0014]另外，可以作为固定邻苯二甲酸二丁酯抗原固相载体的物质较多，例如聚苯乙烯、硝酸纤维素、聚乙烯、聚丙烯、聚丙烯酰胺、交联葡萄糖、硅橡胶、琼脂糖凝胶等。该载体的形式可以为凹孔、纸片、小珠等。
[0015]所述的邻苯二甲酸抗体为邻苯二甲酸单克隆抗体、兔多克隆抗体中的任意一种；所述的邻苯二甲酸抗体为本实验室前期制备:采用戊二醛法将邻苯二甲酸与牛血清白蛋白(BSA)共价偶联合成物免疫SPF级Balb/c鼠所得，使用时优选为T液稀释8000倍；所述T液的配方为:称取1.21g的Tris，用800mL去离子水溶解，用lmol/L盐酸溶液调节溶液到所需pH值，用去离子水定容至1L。
[0016]所述的辣根过氧化物酶标记的二抗为辣根过氧化物酶标记的鼠二抗或兔二抗。
[0017]所述的邻苯二 甲酸标准溶液的浓度为lmg/mL，使用时用PBS溶液将标准溶液稀释成邻苯二甲酸标准品溶液；具体是用0.01mol/L、pH5.4的PBS将标准溶液稀释成浓度为
0.0256Pg/L、0.128Pg/L、0.64gg/L、3.2Pg/L、16Pg/L、8(^g/L 的一系列邻苯二甲酸标准品溶液。
[0018]所述底物液为含有3，3，5，5 一四甲基联苯胺(TMB)或邻苯二胺(OPD)的pH5.0磷酸柠檬酸缓冲溶液。
[0019]所述底物缓冲液为含有过氧化氢或过氧化脲的pH5.0磷酸柠檬酸缓冲溶液。
[0020]所述反应终止液为I~2mol/L硫酸溶液或2mol/L氢氧化钠溶液。
[0021]所述浓缩洗涤液为含有0.5~1.5% (v/v)吐温-20的磷酸盐缓冲液；所述浓缩洗涤液PH值为7.4，浓缩洗涤液浓度为0.lmol/L。所述浓缩洗涤液使用时用去离子水稀释15~25倍。
[0022]本发明所述包被有邻苯二甲酸抗原的酶标板的制备方法为:
用包被液将邻苯二甲酸抗原按需要稀释，向酶标板微孔中加入抗原稀释液，放入37°C环境进行孵育，再放入4°C环境中过夜孵育(得到的酶标板的稳定性好)，倾去包被液，用洗涤液洗涤，然后在每孔中加入封闭液，37°C孵育，倾去孔内液体，干燥后用铝膜真空密封保存。
[0023]本发明还提供了所述邻苯二甲酸酯类总量ELISA酶联免疫检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤:
51.将试剂盒从冷藏环境中取出，置于室温平衡；
52.将标准品或经过前处理的待测样品加入已经包被有邻苯二甲酸抗原的酶标板孔内，然后每孔加入抗体，轻拍混匀，孵育；
53.用洗漆液进行洗漆；54.加入辣根过氧化物酶标记的二抗，轻拍混匀，孵育；
55.用洗漆液进行洗漆；
56.将底物缓冲液与底物液等体积混合得到显色液，在每孔加入显色液，轻拍混匀，避光孵育；
57.每孔加入反应终止液，混合均匀，在波长450nm或492nm下，以空气为空白，测定各孔吸光值；
58.检测结果处理与分析:
抑制率(％)=Β/Β(ιΧ100 (%)，式中，B为不同浓度邻苯二甲酸标准品孔或样品孔的发光值Atl为OPg/L浓度邻苯二甲酸标准溶液发光值；以抑制率为纵坐标，邻苯二甲酸浓度的对数为横坐标绘制标准曲线，从而确定待测样品中邻苯二甲酸的含量。所述检测结果的分析还可以利用计算机专业软件进行计算与分析。
[0024]其中，SI所述的置于室温平衡是指在室温(20~24°C )放置30min以上，使试剂盒的温度恢复至室温。
[0025]S2所述的前处理是指将待测样品中的邻苯二甲酸酯类物质转化为邻苯二甲酸。
[0026]优选地，步骤S2所述待测样品为食用油或酱油；
优选地，食用油或酱油样本的前处理方法如下:
51.称取样品2.0g，放于回流瓶中，加入IOmL甲醇混匀，再加IOmL浓度为2mol/L的KOH溶液，于85°C水浴加热2.5h，将甲醇蒸干，取出冷却至室温；` 52.用体积浓度为50%的盐酸将水解液pH调为I~2，漩涡震荡3min后，超声波震荡20min ；
53.加入3倍体积的正己烷，漩涡震荡3min，静置20min，弃去正己烷层，加入3倍体积的乙酸乙酯，漩涡震荡3min，静置20min，取乙酸乙酯层，剩余液体中再加入3倍体积的乙酸乙酯；
54.重复三次S3操作，将三次萃取液合并，于旋转蒸发器中蒸发至尽干；
55.甲醇复溶，用0.01mol/L、pH5.4的PBS稀释15~20倍后直接用于检测，在计算结果时应将稀释倍数计算在内。
[0027]更具体地，所述邻苯二甲酸酯类总量ELISA酶联免疫检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤:
51.将试剂盒从冷藏环境中取出，置于室温(20~24°C)平衡30min以上，将足够标准品和待测样品使用数量的条板固定于支架，标准品和待测样品做两个平行实验，按顺序编号;
52.在标准品孔中加入50μ?不同浓度的邻苯二甲酸标准品，样品孔加入50μ?经过前处理的待测样品；然后每孔加入50μ?用T液稀释的抗体，盖上盖板膜在微量振荡器上振摇混匀，在室温孵育30min ；
53.倒出孔中的液体，将微孔架倒置在吸水纸上拍打(每轮洗板拍打3次)以保证完全除去孔中的液体；用300μ?洗涤液充入孔中，再次倒掉微孔中的液体，再重复操作5遍；
54.每孔中加入IOOPL用抗体稀释液PBST(配方为NaH2PO4.12H20 2.9g、NaCl 8.5g、KCl 0.2g、KH2P04 0.2g，50(^L Tween-20，定容至1L)稀释的酶标二抗，盖上盖板膜在微量振荡器上振摇混匀，室温孵育30min ；55.重复步骤S3；
56.每孔加入ΙΟΟμ?显色液(底物缓冲液与底物液等体积混合得到)，轻拍混匀，盖上盖板膜，暗处室温孵育IOmin ；
57.加入50μ?反应终止液到微孔中；混合后，在波长450nm(以空气为空白)处测定各孔吸光值，必须在加入终止液后60min内读取吸光值；
58.检测结果计算与分析:
抑制率(％) =B/BqX100 (%)
式中:B为不同浓度标准品孔(或样品孔)的发光值AtlSOPg/!标准溶液的平均吸光度值。以抑制率为纵坐标，邻苯二甲酸标准品溶液浓度的对数为横坐标绘制标准曲线，从而确定待测样品中邻本 甲Ife的含量；
根据待测样品中邻苯二甲酸的含量，计算待测样品中邻苯二甲酸酯类总含量的计算公式如下:
【权利要求】
1.一种邻苯二甲酸酯类总量ELISA酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如下组分: (1)包被有邻苯二甲酸抗原的酶标板； (2)邻苯二甲酸抗体工作液； (3)辣根过氧 化物酶标记的二抗； (4)邻苯二甲酸标准溶液； (5)底物液； (6)底物缓冲液； (7 )反应终止液； (8)浓缩洗涤液。
2.根据权利要求1所述邻苯二甲酸酯类总量ELISA酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，所述的邻苯二甲酸抗原为半抗原4-氨基邻苯二甲酸与卵清蛋白的偶联物； 所述酶标板是96或40孔酶标板，材质为聚苯乙烯，包被有邻苯二甲酸抗原，并封闭微孔表面未吸附邻苯二甲酸抗原的位点。
3.根据权利要求1所述邻苯二甲酸酯类总量ELISA酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，所述的邻苯二甲酸抗体为邻苯二甲酸单克隆抗体或邻苯二甲酸兔多克隆抗体。
4.根据权利要求1所述邻苯二甲酸酯类总量ELISA酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，所述的邻苯二甲酸标准溶液的浓度为lmg/mL，使用时用磷酸盐缓冲液将标准溶液稀释成邻苯二甲酸标准品溶液。
5.根据权利要求1所述邻苯二甲酸酯类总量ELISA酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，所述底物液为含有3，3，5，5 —四甲基联苯胺或邻苯二胺的pH5.0磷酸柠檬酸缓冲溶液。
6.根据权利要求1所述邻苯二甲酸酯类总量ELISA酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，所述底物缓冲液为含有过氧化氢或过氧化脲的PH5.0的磷酸柠檬酸缓冲溶液。
7.根据权利要求1所述邻苯二甲酸酯类总量ELISA酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，所述反应终止液为I~2mol/L硫酸溶液或2mol/L氢氧化钠溶液。
8.根据权利要求1所述邻苯二甲酸酯类总量ELISA酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，所述浓缩洗涤液为含有0.5~1.5% (v/v)吐温-20的磷酸盐缓冲液，浓缩洗涤液的pH值为 7.4、浓度为 0.lmol/L。
9.权利要求1~8任一所述邻苯二甲酸酯类总量ELISA酶联免疫检测试剂盒的使用方法，其特征在于，包括如下步骤: S1.将试剂盒从冷藏环境中取出，置于室温平衡； S2.将标准品或经过前处理的待测样品加入已经包被有邻苯二甲酸抗原的酶标板孔内，然后每孔加入抗体，轻拍混匀，孵育； S3.用洗漆液进行洗漆； S4.加入辣根过氧化物酶标记的二抗，轻拍混匀，孵育； S5.用洗漆液进行洗漆； S6.将底物缓冲液与底物液等体积混合得到显色液，在每孔加入显色液，轻拍混匀，避光孵育； S7.每孔加入反应终止液，混合均匀，在波长450nm或492nm下，以空气为空白，测定各孔吸光值； S8.检测结果处理与分析:确定样品中邻苯二甲酸的含量，根据邻苯二甲酸的含量计算样品中邻苯二甲酸酯类的总含量。
10.根据权利要求9所述邻苯二甲酸酯类总量ELISA酶联免疫检测试剂盒的使用方法，其特征在于，S2所述的前处理是指将待测样品中的邻苯二甲酸酯类物质转化为邻苯二甲 酸。
【文档编号】G01N33/53GK103698504SQ201310752662
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年12月31日 优先权日:2013年12月31日
【发明者】柳春红, 孙远明, 沈玉栋, 杨金易, 羿利华, 雷红涛, 徐振林, 王弘, 肖治理 申请人:华南农业大学