一种检测猪尿中盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇的免疫胶体金联合试剂板的制作方法
【专利摘要】本实用新型涉及一种能同时快速检测猪尿中盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇的免疫胶体金联合试剂板。本试剂板由上下两块塑料模板和盐酸克伦特罗快速检测试纸条、莱克多巴胺快速检测试纸条、沙丁胺醇快速检测试纸条组成，每根试纸条均由底板以及底板上依次黏着的样品垫、金标结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫所组成。每根试纸条的硝酸纤维素膜从样品垫到吸水垫方向上依次喷有检测线和质控线。该试剂板可进行半定量直观检测，整个操作过程仅需5分钟左右，且无需任何昂贵实验设备辅助，利于大规模样本筛选，适合屠宰企业及政府检测机构。
【专利说明】—种检测猪尿中盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇的免疫胶体金联合试剂板
【技术领域】
[0001]本实用新型涉及一种能同时快速检测猪尿中盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇的免疫胶体金联合试剂板。
【背景技术】
[0002]盐酸克伦特罗(Clenbuterol,CLEN)、沙丁胺醇(Salbutamol, SAL)、莱克多巴胺(Ract0pamine，RAC)，属于β -兴奋剂类药物，通常被称为“瘦肉精”。在临床上盐酸克伦特罗可用于防治哮喘、肺气肿等肺部疾病，沙丁胺醇可用于治疗支气管哮喘，莱克多巴胺可用于治疗充血性心力衰竭症等疾病。研究发现长期或大量使用β_兴奋剂会使动物肌肉合成增加，脂肪沉积减少，明显促进动物生长，因此，它常被用做饲料添加剂。由于β_兴奋剂在动物体内的代谢慢，长时间使用会造成积累，当人类食用了含有β_兴奋剂残留的食用性动物后，会出现不同程度的中毒症状，常见有恶心、头晕、四肢无力、手颤等，心脏病、高血压患者危害尤其严重。
[0003]为此，欧盟明确禁止在食用性动物中使用包括盐酸克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺等在内的所有β_兴奋剂类药物。为保障畜牧业的持续健康发展和人民的身体健康，我国农业部也在176号公告《禁止在饲料和动物饮用水中使用的药物品种目录》中将盐酸克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺等列入了禁用清单。尽管我国明令禁止使用，然而，受经济利益驱动以及缺乏有效的监测手段，目前仍有不少养殖户违令使用兴奋剂，因此，建立科学、规范的药物残留监控方法十分必要。
[0004]现阶段，对于β -兴奋剂类药物的检测方法主要有理化分析法和免疫分析法。理化分析法，如高效液相色谱法(HPLC)和液相色谱质谱联用法(LC-MS)，这些方法具有特异性好、准确率高的特点，是各大检测机构对检测样本进行确证的首选方法，但对设备、环境、操作技能等要求较高，不利于大规模样本筛选，因而不适合广大基层部门。免疫分析法常用的有酶联免疫吸附法(ELISA)和胶体金免疫层析法(GICA)。
[0005]酶联免疫吸附法是应用抗原抗体特异性反应和酶的高效催化作用来测定β -兴奋剂类药物含量的免疫分析方法，具有特异性强、灵敏度高、快速、简便等优点。但是ELISA法中酶的活性易受反应条件影响，造成测定结果重复性较差；且需要用到昂贵特殊的仪器设备，故存在一定的局限性。
[0006]胶体金免疫层析法是在免疫渗滤技术的基础上建立的一种简易快速的免疫学检测技术。该方法将反应所需要的全部或大部分原料整合到试剂中，可在3?5min内完成对样品的测定，具有简单、快速、灵敏度高等特点，既可用于实验室检测，也可用于养殖场等实地测定。
实用新型内容
[0007]本实用新型针对实际检测需求，研制开发出一种能同时快速检测猪尿中盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇的免疫胶体金联合试剂板。本实用新型试剂板操作简便快捷，灵敏度高，特异性好，实验结果肉眼可直观判断，无需配备仪器设备，3?5min内即可完成对猪尿中上述三种药物残留的测定。
[0008]本实用新型试剂板由上下两块塑料模板和盐酸克伦特罗快速检测试纸条、莱克多巴胺快速检测试纸条、沙丁胺醇快速检测试纸条组成。每根试纸条均由底板以及底板上依次黏着的样品垫、金标结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫所组成，相邻部分有I?2_的重叠区域。样品垫经过盐离子缓冲液及活性剂的浸泡干燥后，上面附着有盐离子及活性剂等物质。金标结合垫上分别包被有盐酸克伦特罗单抗-胶体金标记物、莱克多巴胺单抗-胶体金标记物和沙丁胺醇单抗-胶体金标记物。硝酸纤维素膜从样品垫到吸水垫方向依次喷有检测线和质控线，三种试纸条的检测线上分别包被有盐酸克伦特罗-载体蛋白偶联物、莱克多巴胺-载体蛋白偶联物、沙丁胺醇-载体蛋白偶联物，质控线上均包被有羊抗鼠IgG抗体。偶联盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇的载体蛋白可为卵清蛋白(OVA)，牛血清白蛋白(BSA)，血蓝蛋白(KLH)等。
[0009]本实用新型试剂板中所含的盐酸克伦特罗快速检测试纸条、莱克多巴胺快速检测试纸条、沙丁胺醇快速检测试纸条的反应原理相同。例如盐酸克伦特罗快速检测试纸条运用了胶体金标记技术、层析技术、竞争免疫技术，通过抗原和单抗-胶体金标记物反应显色，特异性检测猪尿中的盐酸克伦特罗药物残留水平。如果样品溶液中含有盐酸克伦特罗残留，则盐酸克伦特罗先和胶体金颗粒上的盐酸克伦特罗单抗反应，当胶体金颗粒随样品溶液扩散至检测线时，胶体金颗粒上盐酸克伦特罗单抗的活性位点因被样品溶液中的盐酸克伦特罗药物占据而无法与检测线上盐酸克伦特罗-载体蛋白偶联物结合；当样品中的盐酸克伦特罗含量超过试剂板检出限时，试剂板上的检测线无显色，判定为阳性。反之，当样品中盐酸克伦特罗含量在试剂板检出限以下或无残留时，试剂板上的检测线显色，判定为阴性。
[0010]本实用新型试剂板的各部分成分和功能如下:
[0011]塑料模板，起固定底板和标示各功能区(加样孔、检测区、质控区)的作用。
[0012]底板，由一面涂有不干胶的聚氯乙烯(PVC)材料制成，起固定支撑试剂板其他组成部分的作用。
[0013]样品垫，由玻璃纤维制成，起吸收样品溶液和缓冲样品溶液pH值的作用。
[0014]金标结合垫，由玻璃纤维制成，为样品溶液中有效成分和单抗-胶体金标记物反应提供场所。
[0015]硝酸纤维素膜，从样品垫到吸水垫方向上依次喷有检测线和质控线，将反应结果以肉眼可见的颜色表征出来。
[0016]吸水垫，由滤纸制成，吸收反应过程中多余的溶液。
[0017]本实用新型试剂板具有如下有益效果:
[0018](I)特异性好。本实用新型试剂板中，盐酸克伦特罗快速检测试纸条对盐酸克伦特罗的交叉反应率为100%，对如沙丁胺醇、莱克多巴胺等其他β-兴奋剂类药物的交叉反应率均低于1% ;莱克多巴胺快速检测试纸条对莱克多巴胺的交叉反应率为100%，对如沙丁胺醇、盐酸克伦特罗等其他β -兴奋剂类药物的交叉反应率均低于1%;沙丁胺醇快速检测试纸条对沙丁胺醇的交叉反应率为100%，对如盐酸克伦特罗、莱克多巴胺等其他β-兴奋剂类药物的交叉反应率均低于I %。可见，本实用新型试剂板对三种残留的检测各具有高度专一I"生。
[0019](2)灵敏度高。本实用新型试剂板针对猪尿样品中盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇的检出限均为3.0ppb，适用于各类企业及检测机构。
[0020](3)操作简单快捷。本实用新型试剂板将反应所需的大部分原料整合到试纸条上，滴样后反应在固相膜上快速进行，3?5min内即可读取结果，可同时检测三种药物残留，大大缩短了检样时间。本试剂板的使用不需任何专业培训，普通人员均可操作。
[0021](4)不依赖于实验设备。本实用新型试剂板在直接滴样跑板后，通过肉眼判断硝酸纤维素膜上的检测线和质控线的颜色深浅来判读结果，整个检测过程不依赖任何实验设备，尤其适合于野外及现场操作，易于推广。
[0022](5)成本低，易推广。本实用新型试剂板生产工艺简单，可实现单个样本检测，生产成本低，大大降低了检测费用。
【专利附图】
【附图说明】
[0023]图1为本实用新型试剂板中试纸条的侧面结构示意图。其中I为样品垫，2为金标结合垫，3为硝酸纤维素膜(NC膜)，4为检测线(T线)，5为质控线(C线)，6为吸水垫，7为不干胶，8为聚氯乙烯板(PVC板)。
[0024]图2为本实用新型试剂板操作示意图，其中S为加样孔，C为质控区，T为检测区，I表示盐酸克伦特罗，2表示莱克多巴胺，3表示沙丁胺醇。
[0025]图3为本实用新型试剂板结果判定示意图，其中C为质控区，T为检测区。
具体实施方法
[0026]本实用新型试剂板的制备包括半抗原-载体蛋白偶联物的制备，单抗的制备，胶体金溶液的制备，单抗-胶体金标记物的制备，试剂板的组装，检测实施方法。
[0027]1.半抗原-载体蛋白偶联物的制备
[0028]1.1盐酸克伦特罗-载体蛋白偶联物的制备
[0029]称取20mg盐酸克伦特罗，用2mL0.5mol/L的硫酸溶液溶解，混匀后加入300μ L10mg/mL的亚硝酸钠，持续反应2h。在搅拌下，将溶液逐滴加入到BSA溶液中(IOOmgBSA溶于IOmL0.1mol/LpHl0.0的碳酸钠缓冲溶液)。混匀后，置于4°C下避光反应5h (期间可颠倒混匀)，之后用0.01mol/LpH7.4的PBS缓冲液透析4天，期间每间隔8h换液一次。再将溶液离心，收集上清液，-20°C下冻存备用。
[0030]用卵清蛋白(OVA)替代BSA，采用同样方法制备盐酸克伦特罗-卵清蛋白偶联物。
[0031]1.2莱克多巴胺-载体蛋白偶联物的制备
[0032]称取34mg盐酸莱克多巴胺,溶于2mL卩比唳中，加入12mg戍二酸酐，室温下搅拌过夜，氮气吹干；将产物溶解到4mL N’ N-二甲基甲酰胺(DMF)和1，4_ 二氧六环混合溶液中(两者体积比为1: 1)，加入26.2yL三正丁胺，冰浴搅拌lOmin，加入氯甲酸异丁酯14.3 μ L，室温搅拌反应Ih ;将上述混合物逐滴加入到预冷的BSA溶液中(IOOmg BSA溶于
0.lmol/LpH8.5的硼酸钠溶液)，室温搅拌过夜；用0.01moL/L ρΗ7.4的PBS缓冲液透析3天，每天换液3次。[0033]用卵清蛋白(OVA)替代BSA，采用同样方法制备莱克多巴胺-卵清蛋白偶联物。
[0034]1.3沙丁胺醇-载体蛋白偶联物的制备
[0035]制备沙丁胺醇碱:称2.4g硫酸沙丁胺醇，用30mL无水甲醇溶解，过阴离子交换树月旨，收集洗脱液，重结晶，得白色晶体(熔点154-155? )。
[0036]合成沙丁胺醇半琥珀酸:称240mg沙丁胺醇碱，用20mL甲醇溶解；旋转蒸发为黄色油状物，再用无水乙醇溶解，逐滴加入乙醇溶解的120mg 丁二酸酐；氮气保护条件下，室温搅拌4h ;将反应液离心，弃上清液，用无水乙醇洗涤沉淀物3次，挥干溶剂所得白色固体即半抗原。
[0037]混合酸酐法偶联沙丁胺醇和载体蛋白:称40mg半琥珀酰沙丁胺醇，溶于1，4_ 二氧六环-水-三乙胺的混合物中，搅拌下逐滴加入30 μ L氯甲酸异丁酯(30min内)；将上述反应液逐滴加入到25mL含80mg BSA的蒸馏水中；4°C反应过夜，0.01moL/L pH7.4的PBS缓冲液透析3天，每天换液3次。
[0038]用卵清蛋白(OVA)替代BSA，采用同样方法制备沙丁胺醇-卵清蛋白偶联物。
[0039]2.单抗的制备
[0040]2.1盐酸克伦特罗单抗的制备
[0041]取6~8周龄雌性Balb/C小鼠，将作为免疫原的盐酸克伦特罗-牛血清白蛋白偶联物(CLEN-BSA)与等体积的弗氏完全佐剂乳化，按100 μ g/只剂量皮下注射，之后每隔3周加强免疫I次，用不完全佐剂代替完全佐剂与抗原混匀进行腹腔注射。融合前3天强化免疫I次，不用佐剂，剂量加倍。细胞融合按常规方法进行:将Sp2/0多发性骨髓瘤细胞与免疫脾细胞按1: 10的比例混`合，在50% PEG作用下融合，HAT培养基悬浮，分种于96孔培养板中，37 °C、5 % CO2培养箱中培养。
[0042]融合后，待细胞生长到培养孔面积的1/4时，采用分步筛选法筛选杂交瘤细胞。初筛选择10mg/L盐酸克伦特罗-卵清蛋白偶联物(CLEN-OVA)包被酶联板，被测孔加培养上清，孵育、清洗后，加入羊抗鼠IgG-HRP(l: 1000)，OPD显色。筛选出的阳性孔再用CLEN-OVA包被的酶联板进行阻断间接ELISA。将细胞培养上清与2X 10_3mol/L盐酸克伦特罗溶液等量混合，37°C感作lh，加入已包被的酶标板中。另外用PBS (0.01mol/L、pH7.4)替代盐酸克伦特罗溶液作对照，其余步骤同上。若盐酸克伦特罗阻断后的OD值降至对照孔的50%以下，则判为阳性孔。经2~3次检测都呈阳性的孔，立即用有限稀释法进行克隆化。
[0043]体外培养:将克隆化的细胞株扩大培养，细胞浓度达5 X 105/mL时停止换液，细胞全部死亡后收集培养液。
[0044]体内诱生腹水:给腹腔注射液体石蜡10天后的小鼠腹腔注射克隆化细胞株IO7个细胞，7天后抽取腹水。
[0045]2.2莱克多巴胺、沙丁胺醇单抗的制备
[0046]采用同种方法(步骤2.1)制备莱克多巴胺单抗、沙丁胺醇单抗。
[0047]3.胶体金溶液的制备
[0048]胶体金颗粒的平均大小为30nm，其制备方法为在IOOmL去离子水中加入ImLl %柠檬酸三钠，煮沸后迅速加入ImLl%氯金酸，继续煮沸lOmin，冷却后，4°C下保存备用。
[0049]4.单抗-胶体金标记物的制备
[0050]4.1盐酸克伦特罗单抗-胶体金标记物的制备[0051]标记前将单抗溶液以15000r/min4°C离心30min,取上清液；取已制备好的胶体金溶液IOOmL,用0.lmol/L K2CO3和0.lmol/L HCl将胶体金溶液的pH值调至单抗等电点略偏碱(pH = pI+0.5);边搅拌边加入0.66mg盐酸克伦特罗单抗；在搅拌下逐滴加入2mL25mol/L 聚乙二醇 20000(PEG20000)，搅拌 15min ;20000r/min 离心 15min，弃上清液；力口入 IOmL0.01mol/LpH7.4 的 PBS 缓冲液(含 0.4mol/L PEG20000)，20000r/min 离心 15min,弃上清液，如此洗涤2?4次，以彻底除去未结合的蛋白质；将沉淀用IOmL含2% BSA的PBS缓冲液(pH7.4,0.0 lmol/L)溶解；用0.22 μ m无菌过滤器过滤后，得到盐酸克伦特罗单抗-胶体金标记物，4°C保存备用。
[0052]4.2莱克多巴胺单抗-胶体金标记物的制备
[0053]以2mg莱克多巴胺单抗替代0.66mg盐酸克伦特罗单抗，同法(步骤4.1)制备莱克多巴胺单抗-胶体金标记物。
[0054]4.3沙丁胺醇单抗-胶体金标记物的制备
[0055]以1.5mg沙丁胺醇单抗替代0.66mg盐酸克伦特罗单抗，同法(步骤4.1)制备沙丁胺醇单抗-胶体金标记物。
[0056]5.试剂板的组装
[0057]参照图1，用点膜机把适当浓度的盐酸克伦特罗-载体蛋白偶联物及羊抗鼠IgG抗体喷在硝酸纤维素膜上，分别作为检测线和质控线，37°C烘箱干燥8h;将制备好的盐酸克伦特罗单抗-胶体金标记物包被在金标结合垫上；将样品垫、金标结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次粘于PVC底板上；用切割机将贴好的大卡切割成3_宽的试纸条，完成盐酸克伦特罗快速检测试纸条的制备。
[0058]同法制备莱克多巴胺快速检测试纸条、沙丁胺醇快速检测试纸条。
[0059]将上述三种试纸条装入塑料模板中制成试剂板后，再放入带干燥剂的铝箔袋中密闭储存。
[0060]6.检测实施方法
[0061]6.1样品制备
[0062]用干燥、洁净的离心管或适当容器采集5mL左右猪尿液，直接作为检测样品，如果尿样出现沉淀或浑浊物，离心后取上清液作为检测样品。
[0063]6.2检测步骤
[0064]从包装袋中取出试剂板，吸取待检样品溶液分别滴加到三个加样孔中，每孔100 μ L，加样后开始计时；结果应在3?5min读取，其他时间判读无效。
[0065]6.3结果判读
[0066]读取结果时，将试剂板水平置于观察者正面，如图2右侧所示。
[0067]盐酸克伦特罗残留的判读:
[0068]阴性(-):盐酸克伦特罗试快速检测纸条上的检测线(T线)显色，表示样品中盐酸克伦特罗含量低于3.0ppb或不含盐酸克伦特罗。如图3.a所示。
[0069]阳性(+):盐酸克伦特罗快速检测试纸条上的检测线(T线)无显色，表示样品中盐酸克伦特罗含量高于或等于3.0ppb。如图3.b所示。
[0070]无效:未出现质控线(C线)，可能是操作不当或试剂板已失效。应再次阅读说明书，并用新的试剂板重新测试。如图3.c所示。 [0071] 同法判读莱克多巴胺、沙丁胺醇残留。
【权利要求】
1.一种能同时快速检测猪尿中盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇的免疫胶体金联合试剂板，其特征在于试剂板由上下两块塑料模板和盐酸克伦特罗快速检测试纸条、莱克多巴胺快速检测试纸条、沙丁胺醇快速检测试纸条组成，每根试纸条均由底板以及底板上依次黏着的样品垫、金标结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫所组成，相邻部分有I?2_的重置区域。
2.如权利要求1所述的试剂板，其特征在于盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇快速检测试纸条的硝酸纤维素膜从样品垫到吸水垫方向依次喷有检测线和质控线，检测线上分别包被有盐酸克伦特罗-载体蛋白偶联物、莱克多巴胺-载体蛋白偶联物、沙丁胺醇-载体蛋白偶联物，质控线上均包被有羊抗鼠IgG抗体。
3.如权利要求1所述的试剂板，其特征在于盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇快速检测试纸条的金标结合垫分别包被有盐酸克伦特罗单抗-胶体金标记物、莱克多巴胺单抗-胶体金标记物、沙丁胺醇单抗-胶体金标记物。
4.如权利要求1所述的试剂板，其特征在于胶体金颗粒的平均大小为30nm。
5.如权利要求1所述的试剂板，其特征在于偶联莱克多巴胺、盐酸克伦特罗和沙丁胺醇的载体蛋白可为牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)、血蓝蛋白(KLH)。
6.如权利要求1所述的试剂板，其特征在于底板由一面涂有不干胶的聚氯乙烯材料制成，样品垫由玻璃纤维制成，金标结合垫由玻璃纤维制成，吸水垫为滤纸。
【文档编号】G01N33/577GK203455348SQ201320566244
【公开日】2014年2月26日 申请日期:2013年9月9日 优先权日:2013年9月9日
【发明者】王明元, 张伯杰, 董钰, 王少峰, 邵伟, 王永滨, 张玉生, 齐东红, 李淑英, 潘建波, 周略, 张菊, 赵霞 申请人:杭州南开日新生物技术有限公司