赋予针对raf抑制剂的抗性的c-raf突变体的制作方法

赋予针对raf抑制剂的抗性的c-raf突变体的制作方法
【专利摘要】本发明提供了具有突变体C-RAF序列的核酸和蛋白质、鉴定有可能从联合治疗中获益的患有癌症的患者的方法、以及治疗方法。
【专利说明】赋予针对RAF抑制剂的抗性的C-RAF突变体
[0001]相关申请
[0002]本申请要求于2012年3月28日递交的美国临时申请号61/616，999和于2012年10月I日递交的61/708，372的利益，其在此以全文引用的方式并入本文。
[0003]联邦政府资助的研究或开发
[0004]本发明受到政府资助，其由美国国立卫生研究院授予，联邦资助号DP2 0D002750。政府享有本发明的一定的权利。

【背景技术】
[0005]在50-70%的恶性黑素瘤中发现丝氨酸/苏氨酸激酶B-RAF (也称为BRAF)中的癌基因突变。(Davies, H.et al., Nature 417，949 - 954 (2002).)黑素瘤被认为是皮肤癌的最致命的形式并且美国国家癌症研究所已经估计2012年预计有72，250新病例，其可导致美国大约9，180人死亡。临床前研究已经证实B-RAF(V600E)突变预测黑素瘤中促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号传导级联的依赖性(Hoeflich，K.P.et al.，Cancer Res.69，3042 -3051(2009) ；McDermott, U.et al., Proc.Natl Acad.Sc1.USA 104, 19936 - 19941(2007)；Solit, D.B.et al.BRAF mutat1n predicts sensitivity to MEK inhibit1n.Nature439, 358 - 362(2006) ；ffan, P.T.et al., Cell 116, 855 - 867(2004) ；ffellbrock, C.etal.，Cancer Res.64，2338 - 2342(2004))——观察到已经在临床试验中成功验证RAF或MEK 抑制剂(Flaherty, K.T.et al., N.Engl.J.Med.363, 809 - 819 (2010) ； Infante, J.R.et al., J.Clin.0ncol.28 (suppl.), 2503 (2010) ；Schwartz, G.K.et al., J.Clin.0ncol.27(suppl.), 3513(2009).)
[0006]最近，美国食品药品管理局(FDA)批准了 Raf抑制剂威罗菲尼(Vemurafenib)(PLX4032)ο(Dummer et al., 2008 ；Infante et al., 2010 ；Joseph et al., 2010 ；Flahertyet al.，2010)然而，针对靶向癌症治疗剂的临床反应经常受到新生抗性或获得抗性混淆。(Engelman, J.A.et al., Science 316, 1039 - 1043(2007) ；Gorre, M.E.et al., Science293，876 - 880 (2001) ；Heinrich, Μ.C.et al.，J.Clin.0ncol.24，4764 - 4774 (2006)；Daub, H., Specht, K.&Ullrich, A.Nature Rev.Drug Discov.3, 1001 - 1010 (2004).)在临床和体外背景下，最近该现象已被证明由以下方式所支配:或是由一个平行信号模块(CRAF，C0T)的过表达(Montagut et al., Cancer Res 68:4853-4861 (2008) ；Johannessen etal., Nature 468:968-972 (2010)，平行信号通路(PDGFRb，IGF-1R)的激活(Nazarian etal., Nature 468:973-977 (2010) ；Villanueva et al., Cancer Cell 18:683-695 (2010),上游靶标(BRAF)的扩增(Shi et al.，Nat Commun 3:724 (2012)，靶标(p61BRAF)的删除(Poulikakos et al., Nature 480:387-390 (2011)或是通过激活下游祀标或祀蛋白本身(Mek)的突变(Emery et al., Proc Natl Acad Sci U S A 106:20411-20416(2009) ；ffagleet al., JCO 29:3085-3096(2011)。因此，仍然需要以下方法:用于以阐明用长效治疗策略的“可药用(druggable) ”靶标的方式鉴定抗性机理的新方法，用于鉴定有可能从治疗策略中获益的患者的新方法，以及以长效治疗策略治疗患者的方法。


【发明内容】

[0007]本发明涉及对癌症治疗的治疗剂的抗性的开发和赋予对癌症治疗的抗性的靶标的鉴定。本发明还涉及用于促进长效治疗策略和鉴定可以从该治疗获益的患者的平行药物靶标的鉴定。
[0008]在一个方面，本发明提供编码具有C-RAF活性的突变体C-RAF多肽的核酸分子。所述突变体C-RAF多肽包括与含有SEQ.1D.N0.2的野生型C-RAF多肽相比至少一个氨基酸的取代，所述至少一个氨基酸的取代赋予对表达所述突变体RAF多肽的细胞上一种或多种RAF抑制剂的抗性。
[0009]在另一个方面，本发明提供一种表达载体。所述表达载体包括编码具有C-RAF活性的突变体C-RAF多肽的核酸分子，其中所述突变体C-RAF多肽包括与含有SEQ.1D.N0.2的野生型C-RAF多肽相比至少一个氨基酸的取代并且所述至少一个氨基酸的取代赋予对表达所述突变体C-RAF多肽的细胞上一种或多种RAF抑制剂的抗性。
[0010]在另一个方面，本发明提供一种宿主细胞。所述宿主细胞包括所述表达载体。
[0011]在另一个方面，本发明提供一种分离的具有C-RAF活性的突变体C-RAF多肽。所述突变体C-RAF多肽包括与含有SEQ.1D.N0.2的野生型C-RAF多肽相比至少一个氨基酸的取代并且所述至少一个氨基酸的取代赋予对表达所述突变体RAF多肽的细胞上一种或多种RAF抑制剂的抗性。
[0012]在另一个方面，本发明提供一种抗体制剂。所述抗体制剂特异性结合本发明的分离的突变体C-RAF多肽。
[0013]在又一个方面，本发明提供一种治疗患有癌症的受试者的方法。所述方法包括从患者的癌症细胞提取核酸，并测定编码C-RAF多肽的至少一部分核酸分子的编码C-RAF多肽的核酸分子中一个或多个突变的存在，所述突变在以下一个或多个位置与野生型C-RAF多肽相比改变所编码的C-RAF多肽的一个或多个氨基酸处氨基酸残基的身份(identity):104E、257S、261P、356G、361G、427S、447D、469M、478E 和 554R。所述方法还包括当所述核酸分子包括与野生型C-RAF多肽相比在所述编码C-RAF多肽的一个或多个氨基酸改变所述氨基酸残基的核苷酸时给予所述受试者有效量的RAF抑制剂和有效量的第二抑制剂。
[0014]在另一个方面，本发明提供一种鉴定有可能从用RAF抑制剂和第二抑制剂联合治疗中获益的患有癌症的受试者的方法。所述方法包括从患者的癌症细胞提取核酸，并测定编码C-RAF多肽的至少一部分核酸分子。与野生型C-RAF多肽相比，编码C-RAF多肽的核酸分子内存在一个或多个突变，其在所编码的C-RAF多肽的一个或多个氨基酸处改变氨基酸残基的身份，突变位于选自以下组的一个或多个位置:104E、257S、261P、356G、361G、427S、447D、469M、478E和554R，意味着需要用RAF抑制剂和第二抑制剂治疗所述受试者。

【专利附图】

【附图说明】
[0015]图1显示A375细胞中C-RAF突变体等位基因(BRAFV600E)对RAF抑制剂PLX4720的抗性。
[0016](A)显示从PLX4720突变筛选得到C-RAF编码序列的候选突变的平均变体得分。示出了高得分突变(>2% )的相应氨基酸取代。(B)左图:显示C-RAF激酶结构域(残基340-618 ;灰色)(PDB编号:30MV)的晶体结构，包括代表性的C-RAF抗性突变体(棒)以及结合的PLX4720的空间填充模型。还示出了 DFG基序和P-环。右图:C-RAF结构旋转90°以暴露二聚体界面残基R401(结构由PyMOL渲染)。(C) C-RAF结构域代表(CR，保守区；RBD, Ras结合结构域以及CRD，富含半胱氨酸的结构域)描绘C-RAF抗性突变体(星号)和对C-RAF调控重要的三个丝氨酸残基(圆形)的位置。
[0017]图2显示C-RAF抗性突变体的功能特征。
[0018](A)表达C-RAF(WT)和C-RAF(鉴定的等位基因)的A375细胞以剂量依赖的方式(0.08μΜ、0.4μΜ、2μΜ、5μΜ^Ρ 10 μ Μ)用 RAF 抑制剂 PLX4720 处理 90min。免疫印迹显示pErkl/2、pMekl/2、C-RAF。α -微管蛋白用作上样对照。(B)高表达抗性C-RAF突变体的Α375 细胞用 2μΜ 的 PLX4720 处理 16h。显示 pMekl/2、pErkl/2、Mek、S259C-RAF、S338C_RAF、S62IC-RAF和肌动蛋白的水平。(C) A375和C-RAF抗性等位基因应答于PLX4720和(D)威罗菲尼的生长抑制曲线。(E)高表达抗性C-RAF突变体的A375细胞用I μ M的Mek抑制剂AZD6244 处理 16h。显示 pMekl/2、pErkl/2、Mek、S259C-RAF、S338C-RAF、S62IC-RAF 和肌动蛋白的水平。(F)A375和C-RAF抗性等位基因应答于AZD6244和(G)Mek-GSK 1120212的生长抑制曲线。
[0019]图3显示C-RAF抗性突变体表现出与B-RAF增强的结合。
[0020](A)表达C-RAF抗性等位基因的293/T细胞和⑶表达C-RAF抗性等位基因的A375细胞用总C-RAF免疫沉淀。结合蛋白(B-RAF和14_3_3)的水平由免疫印迹进行评估。输入(Input)裂解物(下图)显示 14-3-3、B-RAF、C-RAF、pMekl/2、pErkl/2、Mek、肌动蛋白和S259C-RAF、S338C-RAF和S621C-RAF(右上图)。结果代表两个以上独立的实验。
[0021 ] 图4采用(S)-甲基1- (4- (3- (5-氯_2_氟_3_ (甲基磺酰氨基)苯基)_1_异丙基-1H-吡唑-4-基)嘧啶-2-基氨基)丙-2-基氨基甲酸酯显示C-RAF抗性等位基因的生化特性。
[0022](A)免疫印迹代表表达C-RAF抗性等位基因的A375细胞用ΙμΜ的PLX4720、
(S)-甲基1-(4-(3-(5-氯-2-氟-3-(甲基磺酰氨基)苯基)-1-异丙基-1H-吡唑-4-基)嘧啶-2-基氨基)丙-2-基氨基甲酸酯和AZD6244处理16h的pMekl/2、pErkl/2、Mek、Erk和C-RAF水平。肌动蛋白用作上样对照。(B)A375和C-RAF抗性等位基因应答于PLX4720、(C)
(S)-甲基1-(4-(3-(5-氯-2-氟-3-(甲基磺酰氨基)苯基)-1-异丙基-1H-吡唑-4-基)嘧啶-2-基氨基)丙-2-基氨基甲酸酯和(D)AZD6244的生长抑制曲线。
[0023]图5显示赋予对威罗菲尼(PLX4032)抗性的C-RAF抗性突变体。
[0024](A)A375和C-RAF抗性等位基因应答于威罗菲尼(PLX4032)的生长抑制曲线。(B)在存在和不存在威罗菲尼16h的情况下，来自表达WT，S257P, P261T和G361A的A375细胞的提取物中C-RAF激酶活性。免疫印迹代表pMekl/2、pErkl/2、Mek、Erk和肌动蛋白。结果代表三个独立的实验。(C)A375和C-RAF抗性等位基因应答于PLX4720、(D)AZD6244和(E)PLX4720和AZD6244的生长抑制曲线。
[0025]图6显示C-RAF抗性突变体的同源二聚化和激酶活性。
[0026](A)共表达His/V5标签和Flag标签的C-RAF抗性突变体48h的293T细胞与镍(参见方法部分)免疫沉淀以拉下His标签的C-RAF，并且Flag标签的C-RAF用免疫印迹进行评估。输入裂解物也采用检测Flag-C-RAF、V5-C-RAF、总C-RAF、p-MEK、p_ERK和总ERK的抗体进行评估。(B)共表达His/V5标签和Flag标签的C-RAF抗性突变体的293T细胞用或者载体(DMSO)或者2 μ M的威罗菲尼处理lh，并且His/V5标签的C-RAF如上述(A)所述的进行免疫沉淀。输入裂解物采用识别C-RAF (S338)、p-MEK、p-ERK和肌动蛋白(上样对照)的抗体免疫印迹。(C)体外C-Raf激酶活性在源自如下293T细胞的细胞提取物中测量:瞬时表达Flag标签空载体(“C”)、野生型C-RAF ( “WT”)和携带抗性突变体S257P、P261T、G361A和E478K的C-RAF。分析在存在或不存在2 μ M威罗菲尼的情况下进行(参见方法部分)。输入裂解物也采用检测p-MEKl/2、p-ERKl/2、总ΜΕΚ、总ERK和肌动蛋白的抗体进行免疫印迹。(D)在存在和不存在2μ M威罗菲尼的情况下，在源自如下细胞的细胞提取物中测量体外C-Raf激酶活性:Α375细胞(B-RAFvkicie) ( “C”)和稳定表达野生型C-RAF ( “WT”)和携带抗性突变体S257P、Ρ261Τ和G361A的Α375。对输入裂解物采用识别p-MEKl/2、p-ERKl/2、总MEK、总ERK和肌动蛋白的抗体进行免疫印迹研究。所有结果代表三个独立的实验。
[0027]图7显示C-RAF抗性突变体的异源二聚化和14_3_3结合性质。
[0028]⑷在不存在(_)或存在(+) 2 μ M威罗菲尼Ih情况下的瞬时表达所示C-RAF抗性突变体的293/Τ细胞与C-RAF免疫沉淀并且结合蛋白(B-RAF和14_3_3 ζ )(上图)的水平由免疫印迹评估。输入裂解物(下图)显示14-3-3 ζ、B-RAF、C-RAF、pMekl/2、pErkl/2、Mek、S338C-RAF和肌动蛋白。结果代表两个以上独立的实验。(B)在不存在和存在2 μ M威罗菲尼16h情况下的稳定表达所示C-RAF抗性突变体的A375细胞与C-RAF免疫沉淀并且结合蛋白(B-RAF和14-3-3 ζ )(上图)的水平由免疫印迹评估。输入裂解物与图7Α相同的方法进行印迹。结果代表两个以上独立的实验。
[0029]图8显示C-RAF抗性突变体要求MEK/ERK信号的二聚化。
[0030](A)表达或者Flag标签、野生型C-RAF或所示C-RAF抗性突变体的构建体在不存在(左)或存在(右)二聚化缺陷突变体R401H(粉)的情况下表达于293T细胞。裂解物采用识别p-MEK、p-ERK、总MEK或总C-RAF进行印迹。(B)共表达His标签C-RAF抗性突变体的293/T细胞其自身和在二聚化缺陷(粉)相关情境中在不存在或存在威罗菲尼(2μΜ，lhr)的情况下培养。采用镍珠进行免疫沉淀并且Flag标签的C-RAF的水平由免疫印迹进行评估。还显示了输入裂解物与识别Flag-C-RAF、V5-C-RAF、总C-RAF、p_MEK、p_ERK、S338-C-RAF和肌动蛋白的抗体的印迹。
[0031]图9显示C-RAF抗性等位基因的生化特性
[0032](A)采用表达包含各种从随机诱变筛选中出现的抗性等位基因的C-RAF的A375细胞比较表达于A375细胞中的pMek/pErk水平。微管蛋白作为阳性对照。(B)表达或者野生型C-RAF或者C-RAF抗性等位基因的A375细胞用Raf抑制剂PLX4720以所示剂量处理90分钟。用抗P-ERK、p-MEK和总C-RAF的抗体进行免疫印迹研究。微管蛋白作为上样对照。
[0033]图10显示同源二聚化和激酶活性。
[0034](A)共表达His/V5标签的C-RAF抗性突变体48h的293/T细胞与His免疫沉淀并且Flag标签的C-RAF相互作用用免疫印迹进行评估。输入裂解物代表Flag-C-RAF、V5-C-RAF、C-RAF、pMek、pErk 和 Erk。(B) 293/T 细胞用二聚化缺陷 C-RAF 突变体 R401H 和看门突变T421N转染并且在存在威罗菲尼(211|1)111的情况下检测此1^/^4敏感性。T421N用作阴性对照并且G361A用作阳性对照。
[0035]发明详述
[0036]本发明涉及癌症治疗的治疗剂的抗性的开发和赋予癌症治疗抗性的靶标的鉴定。本发明还涉及用于促进长效治疗策略和鉴定可以从该治疗获益的患者的平行药物靶标的鉴定。
[0037]本发明的实践将采用，除非另有说明，常规的分子生物学、免疫学、微生物学、细胞生物学和重组DNA技术，这些都在本领域的技术范围内。参见例如Sambrook, Fritsch和Maniatis, MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,(当前版本)；CURRENT PROTOCOLSIN MOLECULAR B1LOGY(F.M.Ausubel et al.编著，(当前版本))；the series METHODSIN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.) ；PCR 2:A PRACTICAL APPROACH (当前版本)；ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL和 ANIMAL CELL CULTURE (R.1.Freshney,编著(1987)).DNA Cloning:A Practical Approach, vol.1&II(D.Glover, ed.) ；01igonucleotideSynthesis (N.Gait,编著，当前版本)；Nucleic Acid Hybridizat1n(B.Hames&S.Higgins,编著，当前版本)！Transcript1n and Translat1n (B.Hames&S.Higgins, eds.,当前版本)!Fundamental Virology,第 2 版，vol.1&II (B.N.Fields 和 D.M.Knipe 编著)
[0038]促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)级联是一个关键的细胞内信号转导通路，其调节信号转导响应于多种细胞外刺激物，包括生长因子、细胞因子和原癌基因。激活该途径导致转录因子活化和基因表达的改变，这最终导致细胞功能的改变，包括细胞增殖、细胞周期调控、细胞存活、血管生成和细胞迁移。经典的MAPK信号传导是通过在细胞表面的受体酪氨酸激酶开始的，但许多其他细胞表面分子能够激活MAPK级联，包括整合素、异三聚体G蛋白以及细胞因子受体。
[0039]结合细胞表面受体的配体，例如，受体酪氨酸激酶，通常会导致受体的磷酸化。接头蛋白Grb2与激活的受体的磷酸化的细胞内结构域结合，并且该结合募集鸟嘌呤核苷酸交换因子包括SOS-1和⑶C25至细胞膜。这些鸟嘌呤核苷酸交换因子与GTP酶Ras相互作用并激活GTP酶Ras。常见的Ras亚型包括K-Ras、N-Ras、H-Ras及其它亚型。Ras激活之后，丝氨酸/苏氨酸激酶Raf (例如，A-Raf、B-Raf、C-Raf或Raf-1)通过与Ras相互作用被募集至细胞膜或以不依赖Ras的方式在细胞质中，其中它经历构象变化并结合例如14-3-3的支架蛋白(King et al., Nature 396 ; 180-183 (1998) ； Chaudhary et al., Curr B1l10:551-554(2000) ；Avruch et al., Endo Rev 56:127-156 (2001), Wellbrock et al., NatRev Mol Cell B1l 5:875-885(2004))。14-3-3结合并稳定/激活CRAF是由例如负电荷调控区(N-区)中的S338、Y341以及C端、激酶结构域之外的S621激活残基的磷酸化，和负电荷调控残基例如CR2结构域中的S259(图1C)的去磷酸化以及进一步反应其复杂调控的许多其它遍布整个蛋白的磷酸化位点所支配(Avruch et al., Id.(2001) ；ffellbrock etal., Id.(2004) ；Garnett et al.,Mol.Cel 120:963-969 (2005)) ? CRAF 的激活也被人工同源二聚体的形成所诱导(Avruch et al., Id.(2001) ；ffellbrock et al., Id., (2004).)
[0040]然后Raf被磷酸化。Raf通过磷酸化217和221位的两个丝氨酸残基直接激活MEKl和MEK2。激活后，MEKl和MEK2磷酸化丝氨酸/苏氨酸激酶Erkl和Erk2的酪氨酸(Tyr-185)和苏氨酸(Thr-183)残基，导致Erk激活。激活的Erk调节细胞质中的许多靶标并且还移位入核，在那里它磷酸化大量调节基因表达的转录因子。Erk激酶有大量靶标，包括 EIk-1、c-Etsl、c-Ets2、p90RSKl、MNKl、MNK2、MSKl、MSK2 和 Τ0Β。虽然前面的通路是MAPK信号的经典代表，MAPK通路与其它信号级联之间有相当多的交叉对话。
[0041]MAPK信号传导通路中的偏差对癌症生物学具有显著作用。Ras表达的改变常见于多种癌症，并Ras中激活的突变也已确定。这些突变见于所有癌症的高达30%，并且是在胰腺癌(90% )和结肠癌(50% )尤其常见。此外，已经确定在黑素瘤和卵巢癌中激活的B-Raf突变。最常见的突变，BRAFv6cicie，导致下游MAP激酶通路的组成型激活并且是黑素瘤的细胞增殖、软琼脂生长和肿瘤异种移植物的形成所必需的。CRAF扩增已经涉及前列腺癌和膀胱癌(Edwards et al., 2003 ；Simon et al.，2001),此外,在胃癌和毛细胞型星形细胞瘤中的染色体易位(Shimizu et al., 1986 ；Jones et al.，2009)。然而，CRAF突变在人类癌症的发生率是1% (COSMIC)，这是由于其与BRAF相比低的基础激酶活性(Maraiset al., Science 280:109-112(1997) ；Emuss et al., Cancer Res 65:9719-9726(2005)；Garnett et al.,Mol.Cell 20:963-969 (2005))。基于对MAPK的定义的在人类癌症中过度激活的角色，用特异性抑制剂靶向MAPK通路的成分是一种有前途的癌症治疗方法。但是，患者可能有对这些有前途的治疗方法的先天抗性或获得抗性。赋予靶激酶突变抗性的鉴定、诊断和/或预后标记物和对这些有先天或获得抗性的患者进行治疗的疗法在下文进行描述。
[0042]C-RAF 突变
[0043]虽然用例如PLX4032的RAF抑制剂的癌症治疗是一种有前途的治疗方法，接受这种治疗的患者经常复发或无法响应，其结果是患者的疾病发展。如本发明所述，本发明涉及发现赋予对RAF抑制剂抗性的C-RAF中的突变，其中一些是目前处于临床开发中的。在癌症细胞中获得这样的突变使得患者的细胞对某些RAF抑制剂的治疗具有抗性。在示例的实施方案中，本发明涉及对RAF抑制剂抗性的开发，其可以包括但不限于 RAF265、索拉非尼、SB590885、PLX 4720、PLX4032、GDC-0879、ZM 336372 和(S)-甲基1-(4-(3-(5-氯-2-氟-3-(甲基磺酰氨基)苯基)-1-异丙基-1H-吡唑-4-基)嘧啶_2_基氨基)丙-2-基氨基甲酸酯。通过非限制性的例子，示例性的RAF抑制剂示于表I中。所述RAF抑制剂(S)-甲基1-(4-(3-(5-氯-2-氟_3_(甲基磺酰氨基)苯基)-1-异丙基-1H-批唑-4-基)嘧啶-2-基氨基)丙-2-基氨基甲酸酯被一般性及具体涉及到(本临时申请的第50页的表I的化合物9 ；PCT公开文本W02011/025927的第72页上的化合物9。
[0044]赋予对本发明所述的RAF抑制剂抗性的C-RAF突变的临床上的出现表明，RAF/MEK相关的依赖关系的生物相关性被维持，即使在恶性肿瘤的后期阶段。因此，RAF抑制剂的失效引发许多恶性肿瘤中持续的肿瘤反应，包括黑素瘤，可能表明在临床上不理想的药物效力或药效学研究。基于本发明所述的发现，涉及RAF-或MEK-驱动的肿瘤靶向药物治疗方式可能会受益于更有效的药物、现有药物的改变的给药或组合RAF和MEK抑制作用。示例性RAF抑制剂包括，但不限于表I中列出的抑制剂。MEK抑制剂的非限制性的例子包括:AZD6244 ；C1-1040 ；PD184352 ;PD318088、PD98059、PD334581、RDEA119、6_ 甲氧基-7-(3-吗啉-4-基-丙氧基)-4- (4-苯氧基-苯氨基)-喹啉-3-腈和4- [3-氯-4- (1-甲基-1H-咪唑-2-基磺酰基)-苯氨基]-6-甲氧基-7- (3-吗啉-4-基-丙氧基)-喹啉-3-腈。示例性MEK抑制剂显示于表2。这些治疗创新，与分层患者的强大的肿瘤基因组谱一起，应当与“可药用”原癌基因突变一起加快癌症的个性化癌症治疗的出现。
[0045]表1:示例性的RAF抑制剂
[0046]

【权利要求】
1.一种编码具有C-RAF活性的突变体C-RAF多肽的分离的核酸分子，其中所述突变体C-RAF多肽与包含SEQ.1D.N0.2的野生型C-RAF多肽相比包含至少一个氨基酸取代，所述至少一个氨基酸取代赋予表达所述突变体C-RAF多肽的细胞针对一种或多种RAF抑制剂的抗性。
2.根据权利要求1所述的分离的核酸分子，其中所述至少一个氨基酸取代发生于一个或多个氨基酸位置，所述位置选自:104E、257S、261P、356G、361G、427S、447D、469M、478E 和554R。
3.根据权利要求1所述的分离的核酸分子，其中所述至少一个取代选自:104E>K、257S>P、261P>T、356G>E、361G>A、427S>T、447D>N、469M>1、478E>K 和 554R>K。
4.根据权利要求1所述的分离的核酸分子，其中所述至少一个取代选自:257S、261P和361G。
5.根据权利要求1-4任一项所述的分离的核酸分子，其中所述RAF抑制剂选自:RAF265、索拉非尼、SB590885、PLX 4720、PLX4032、GDC-0879、ZM 336372 和(S) -甲基1-(4-(3-(5-氯-2-氟-3-(甲基磺酰氨基)苯基)-1-异丙基-1H-吡唑-4-基)嘧啶_2_基氨基)丙-2-基氨基甲酸酯。
6.根据权利要求1-4任一项所述的分离的核酸分子，其中所述RAF抑制剂是PLX4032。
7.包含权利要求1所述的核酸的表达载体。
8.包含权利要求7所述的表达载体的宿主细胞。
9.一种具有C-RAF活性的分离的突变体C-RAF多肽，其中所述突变体C-RAF多肽与包含SEQ.1D.N0.2的野生型C-RAF多肽相比包含至少一个氨基酸取代，所述至少一个氨基酸取代赋予表达所述突变体C-RAF多肽的细胞针对一种或多种RAF抑制剂的抗性。
10.根据权利要求9所述的突变体C-RAF多肽，其中所述至少一个氨基酸取代发生于一个或多个氨基酸位置，所述位置选自:104E、257S、261P、356G、361G、427S、447D、469M、478E和 554R。
11.根据权利要求9所述的突变体C-RAF多肽，其中所述至少一个取代选自:104E>K、257S>P、261P>T、356G>E、361G>A、427S>T、447D>N、469M>1、478E>K 和 554R>K。
12.根据权利要求9所述的突变体C-RAF多肽，其中所述至少一个取代选自:257S、261P 和 361G。
13.根据权利要求9-12任一项所述的突变体C-RAF多肽，其中所述RAF抑制剂选自以下组:RAF265、索拉非尼、SB590885、PLX4720、PLX4032、⑶C-0879、ZM 336372 和(S)-甲基1-(4-(3-(5-氯-2-氟-3-(甲基磺酰氨基)苯基)-1-异丙基-1H-吡唑-4-基)嘧啶_2_基氨基)丙-2-基氨基甲酸酯。
14.根据权利要求9-12任一项所述的突变体C-RAF多肽，其中所述RAF抑制剂是PLX4032。
15.一种特异性结合权利要求9的多肽的抗体制剂。
16.一种治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括: (a)从患者的癌症细胞提取核酸； (b)测定编码C-RAF多肽的至少一部分核酸分子的编码C-RAF多肽的核酸分子中一个或多个突变的存在，所述突变在以下一个或多个位置与野生型C-RAF多肽相比改变所编码的C-RAF多肽的一个或多个氨基酸处氨基酸残基的身份，所述位置选自:104E、257S、261P、356G、361G、427S、447D、469M、478E 和 554R ；以及 (c)当所述核酸分子包含与野生型C-RAF多肽相比在所述编码的C-RAF多肽的一个或多个氨基酸处改变所述氨基酸残基的核苷酸时，给予所述受试者有效量的RAF抑制剂和有效量的第二抑制剂。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述第二抑制剂是MEK抑制剂。
18.根据权利要求16或17所述的方法，其中所述RAF抑制剂选自:RAF265、索拉非尼、SB590885、PLX 4720、PLX4032、⑶C-0879、ZM 336372 和(S)-甲基1-(4-(3-(5-氯-2-氟-3-(甲基磺酰氨基)苯基)-1-异丙基-1H-吡唑-4-基)嘧啶_2_基氨基)丙-2-基氨基甲酸酯。
19.根据权利要求16-18任一项所述的方法，其中所述MEK抑制剂选自:CI_1040/PD184352、AZD6244、PD318088、PD98059、PD334581、RDEAl 19、6-甲氧基-7-(3-吗啉-4-基-丙氧基)-4- (4-苯氧基-苯氨基)-喹啉-3-腈和4- [3-氯-4- (1-甲基-1H-咪唑-2-基磺酰基)-苯氨基]-6-甲氧基-7- (3-吗啉-4-基-丙氧基)-喹啉-3-腈。
20.根据权利要求16-19任一项所述的方法，其中所述癌症选自以下组:黑素瘤、乳腺癌、结肠直肠癌、神经胶质瘤、肺癌、卵巢癌、肉瘤和甲状腺癌。
21.根据权利要求16-20任一项所述的方法，其中所述癌症是RAF依赖的癌症。
22.根据权利要求16-21任一项所述的方法，其中所述癌症是黑素瘤。
23.一种鉴定有可能从用RAF抑制剂和第二抑制剂联合治疗中获益的患有癌症的受试者的方法，所述方法包括: (a)从患者的癌症细胞提取核酸；以及 (b)测定编码C-RAF多肽的至少一部分核酸分子； 其中一个或多个核苷酸的存在表明需要用RAF抑制剂和第二抑制剂治疗所述受试者，所述一个或多个核苷酸使得编码的突变体C-RAF多肽的一个或多个氨基酸处的氨基酸残基的身份相对于野生型C-RAF多肽的一个或多个位置处的氨基酸发生改变，所述一个或多个氨基酸位置选自:104E、257S、261P、356G、361G、427S、447D、469M、478E 和 554R。
24.根据权利要求23所述的方法，进一步包括给予所述患者RAF抑制剂和第二抑制剂。
25.根据权利要求23或24所述的方法，其中改变编码的突变体C-RAF多肽的一个或多个氨基酸处的氨基酸残基的身份的一个或多个核苷酸的存在发生在一个或多个氨基酸位置，所述位置选自:104E>K、257S>P、261P>T、356G>E、361G>A、427S>T、447D>N、469M>1、478E>K 和 554R>K。
26.根据权利要求23-25任一项所述的方法，其中改变编码的突变体C-RAF多肽的一个或多个氨基酸处的氨基酸残基的身份的一个或多个核苷酸的存在发生在一个或多个氨基酸位置，所述位置选自:257S、261P和361G。
27.根据权利要求23-26任一项所述的方法，其中所述第二抑制剂是MEK抑制剂。
28.根据权利要求23-26任一项所述的方法，其中所述MEK抑制剂选自:CI_1040/PD184352、AZD6244、PD318088、PD98059、PD334581、RDEA119、6_ 甲氧基-7-(3-吗啉-4-基-丙氧基)-4- (4-苯氧基-苯氨基)-喹啉-3-腈和4- [3-氯-4- (1-甲基-1H-咪唑-2-基磺酰基)-苯氨基]-6-甲氧基-7- (3-吗啉-4-基-丙氧基)-喹啉-3-腈。
29.根据权利要求23-28任一项所述的方法，其中所述RAF抑制剂选自:RAF265、索拉非尼、SB590885、PLX 4720、PLX4032、⑶C-0879、ZM 336372 和(S)-甲基1-(4-(3-(5-氯-2-氟-3-(甲基磺酰氨基)苯基)-1-异丙基-1H-吡唑-4-基)嘧啶_2_基氨基)丙-2-基氨基甲酸酯。
30.根据权利要求23-29任一项所述的方法，其中所述癌症选自:黑素瘤、乳腺癌、结肠直肠癌、神经胶质瘤、肺癌、卵巢癌、肉瘤和甲状腺癌。
31.根据权利要求23-30任一项所述的方法，其中所述癌症是RAF依赖的癌症。
32.根据权利要求23-31任一项所述的方法，其中所述癌症是黑素瘤。
33.根据权利要求23-32任一项所述的方法，其中所述受试者具有包含在B-RAF中突变的癌症细胞。
34.根据权利要求23-33任一项所述的方法，其中所述患者具有包含B-RAFV6°°e突变的癌症细胞。
35.根据权利要求23-34任一项所述的方法，其中测定所述核酸包括对所述核酸测序。
【文档编号】G01N33/574GK104204806SQ201380014747
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2013年3月7日 优先权日:2012年3月28日
【发明者】C·埃默里, R·安东尼, L·A·加拉韦 申请人:达娜-法勃肿瘤研究所公司