应用maldi-toff质谱分析法的侵染性真菌感染的体外诊断方法

应用maldi-toff质谱分析法的侵染性真菌感染的体外诊断方法
【专利摘要】本发明涉及通过MALDI-TOF质谱分析法用于侵染性真菌感染的体外诊断的方法。本发明包括：提供来自哺乳动物的生物液体样品，所述的生物样品，具体而言，包含蛋白质和/或脂质和/或盐，和/或能与所述的蛋白质和/或脂质和/或盐形成复合物的多糖和/或寡糖和/或单糖；处理具有生物液体的样品，以便提取所述的多糖和/或寡糖和/或单糖；利用MALDI-TOF质谱分析法确定所提取的多糖,寡糖和/或单糖中是否存在来源于所述真菌微生物、且选自所述多糖,寡糖和单糖的、至少一种所关注的化合物；推断，如果所关注的化合物存在于所述样品中，则所述的哺乳动物正遭受侵染性真菌感染。
【专利说明】应用MALDI-TOFF质谱分析法的侵染性真菌感染的体外诊 断方法
[0001] 本发明涉及应用MALDI-T0FF质谱分析法的侵染性真菌感染的体外诊断方法。本 发明的方法还可以对包含于样品中的所关注的化合物进行定量，用作侵染性真菌感染检测 的标记。
[0002] 酵母，例如白色念珠菌（C. albicans)常存在于健康人的黏膜中，而通常不引起特 异性的疾病或症状。当身体虚弱时，所述的酵母增殖并进入血液系统，在这样的情况下会产 生侵染性或全身感染（systemic infection)。就白色念珠菌而言，40%的念珠菌血症（念 珠菌血症，一种由白色念珠菌引起的真菌血症）对人类是致命的。侵染性真菌疾病（IFD) 或侵染性真菌感染是常见的严重性入院疾病。尽管可以有效地进行治疗，但治疗成本的攀 升使得医院不堪重负，IFD的发病率也没有下降趋势。传统的真菌学方法（分离/鉴定）存 在缺陷，这是由于常常没有办法无风险地接触患者感染部位取样。对于近乎一半的IFD病 例，血液培养为阴性。所谓的分子生物学方法（PCR)未能解决上述的问题。此外，已证实， 早期引入基于诊断的抗真菌治疗影响患者的存活率。在传统真菌学的之外的或替代性的方 法中，应用检测患者血清中的循环聚糖（即，含于感染患者血清中的聚糖）的方法已被临床 医生所接受。可利用商业性的免疫试验检测这些来自微生物细胞（microcetes)的细胞壁 的聚糖或其前体。Plat61ia? Candida Antigen试验可检测分别来自念珠菌属（Candida) 和曲霉属（Aspergillus)的甘露聚糖和半乳甘露聚糖（galactamannans)。这些，例如 Fuilgitell?牌的市售生化试剂盒可检测常见于念珠菌属和曲霉属（Aspergillus)的葡聚 糖。
[0003] 上述两种类型的试剂盒均包含多种不同的试剂和内标。由于需要对每个批次构建 校准曲线导致试剂消耗增加，尤其是对于需检测血清的情况。对校准（calibration)的需 要有时可能导致因财务原因（由于试剂不足）使研究无法进行。例如，很难用Fungiiellf 确定九孔校准的应用，并且需占用技术人员半天的时间试验一个血清。这些试验还需要特 定程序化的自动分析仪并具备信息系统，这些都使得应当对所提出的请求作出及时应答 时，基于单个患者的紧急实际应用复杂化。
[0004] 因此，所有这些试验都对时间和试剂有特别的要求。此外，它们还产生一定数量干 扰诊断的假阳性结果。尤其是在葡聚糖生化测定中，其受到存在的血红蛋白（收集时产生 的溶血（haemolysed)血清），或有患IFD风险的患者中常见的代谢异常（如，高甘油三酯血 症，存在胆红素或低蛋白血症）的干扰。
[0005] 结果，有若干次报道了假阳性致使患者以真菌以外生物的多重感染而入院重症监 护。检测P-D-葡聚糖中假阳性反应的机制类型未知，因为还没有从分子水平将在这些患者 血清中循环的物质表征出来。由于存在假阳性结果，一些无需任何治疗的患者接受了抗真 菌抗生素的治疗，使其在院时间延长。对于同样也存在的假阴性结果，被解释成细菌感染而 非真菌感染，因此对患者施用抗细菌抗生素，导致患者受到伤害甚至致命。
[0006] 此外，FungiteH?试剂盒应用来自鲎的血液，鲎日益稀有，且目前无法对其进行 饲养。因此，所用的鲎都是从自然界捕获的。从鲎获取血样然后将其释放，但是被释放的鲎 中有20%不能存活。
[0007] 本发明的一个目的在于提供一种新的体外诊断侵染性真菌感染的方法。
[0008] 另一目的在于提供上述的体外方法，其更加可靠，并特别是一种有助于避免上述 的假阴性和假阳性的方法。
[0009] 本发明涉及用于由病源性真菌微生物引起的侵染性真菌感染的体外方法，其特征 在于：
[0010]-提取由哺乳动物获得的生物液体样品中所含的多糖和/或寡糖和/或单糖，具体 而言，所述的生物液体样品包含蛋白质和/或脂质和/或盐，和/或易于与所述的蛋白质和 /或脂质和/或盐形成复合物的所述多糖和/或寡糖和/或单糖；
[0011]-利用MLDI-TOF质谱分析法确定所提取的多糖，寡糖和/或单糖中是否存在来 源于所述真菌微生物、且选自所述多糖、寡糖和单糖的至少一种所关注的化合物。
[0012] -推断如果所述样品中存在所关注的化合物，则所述的哺乳动物正遭受侵染性真 菌感染。
[0013] 本发明人的贡献之一是表明可以通过MALDI-T0F质谱分析法检测复杂的生物液 体中，存在选自糖类，特别是多糖、寡糖和单糖的化合物，所述化合物来源于病源性微生物、 而非来自宿主哺乳动物。
[0014] 本发明人的另一贡献在于，表明这一所关注的化合物是侵染性真菌感染诊断标 记。通过MALDI-T0F质谱分析法获得的谱上的可见峰表示所关注化合物（标记）的存在。 通过MALDI-T0F质谱分析法在生物液体中检测上述来源于病源性真菌微生物的化合物不 是显而易见的。更不必说以所关注的化合物指示侵染性真菌感染。人们会以为所关注的化 合物的量太少难于被检测出来，代表所述所关注化合物的信号隐藏于生物液体（特别是血 清）中可见的数以千计的信号之中。而且糖类（多糖，寡糖和单糖）与生物液体中的脂质、 蛋白质和盐形成复合物，因而难于被检测出来。利用来自给定的病源性真菌微生物感染的 哺乳动物的生物液体样品，通过例如重复本申请中所描述的实验方案，首次鉴定出代表所 关注化合物之一的显著的峰，所述的化合物用于诊断由给定的微生物引起的侵染性真菌感 染。本发明的方法可以检测以上列出的所关注的化合物，而无需标记它们。
[0015] 根据本发明的方法，可以利用MALDI-T0F质谱分析法检测同时存在的几种所关注 的化合物，其中的一种属于多糖，寡糖或单糖。根据本发明，也可能所关注的全部化合物都 是上述的糖类。
[0016] 有益地，为了提取上述的所关注化合物，
[0017] -通过沉淀/凝聚大多数所述蛋白质或所述脂质，解离包含于所述生物液体样品 中的所述复合物；
[0018] -离心所述的样品，使上清与固体组分分离；
[0019] -回收上清；
[0020] -通过，尤其是反向色谱法，将包含于上清液中的所关注化合物与其他的残余蛋白 质和残余脂质分离，通过，尤其是吸收色谱法（absorption chromatography),使所关注化 合物与所述的盐分离。
[0021] 根据本发明，可以首先使得所关注的化合物与所述的盐分离，而后将其与残余的 蛋白质和/或残余的脂质分离，或是以颠倒的次序进行上述操作。
[0022] 有益地，为了解离所述的复合物，向所述样品中添加络合剂（complexing agent)， 尤其是碱，具体而言如EDTA，将所述的混合物加热至沸腾，具体而言加热到KKTC或以上且 140°C或以下，特别是接近120°C。本领域技术人员可根据样品的大小、加热技术和盛样品的 容器（recipient)调整加热时间。务必使样品整体达到沸腾。调整加热时间，勿使样品尤其 是其中所包含的糖类降解。例如，加热时间在3分钟到7分钟之间。本发明的方法极为实 用，所用试剂价格低廉。就分析兼容性（analytical compatibility)而言，耗时（technical time)不长于应用任何现有的试剂盒所需时间。络合剂（如EDTA)与加热相结合可使生物 液体中的复合物解离。具体而言，所述的络合剂能从依赖二价阳离子的凝集素释放糖类。
[0023] 根据所使用的具体方法，先应用反向色谱法，之后使用吸收色谱法。
[0024] 有益地，反向色谱法中使用含疏水相的柱，吸收色谱法中使用含活性碳的柱。
[0025] 所述的疏水柱可以是填充任意固相支持物的柱，其上连接，例如十八烷基（C18)。 所述的支持物可以是聚合物（polymer)或多孔硅。这些柱的大小和体积根据待处理的血清 体积而不同。含活性碳的柱可包含等重的活性碳和C6lite(娃藻土（diatomised earth))， 其使得单糖和二糖从洗脱液中被回收，其他糖类留在柱中。
[0026] 根据本发明，所述的所关注化合物的大小和分子量没有限制。所述的所关注化合 物可以例如具有1000以下的m/z比。所述的所关注化合物可以是二糖，具体而言，m/z信 号=365的己糖二聚体。作为侵染性真菌感染标记的所关注化合物可以是，例如海藻糖。
[0027] 有益地，所述的络合剂添加后，加入至少一种能降解所述多糖和/或寡糖的酶，进 行化学处理以切断所述多糖和/或寡糖链，结果潜在地增加所述所关注化合物的量。使用 内切甘露糖苷酶（endomanosidase)可使得寡甘露糖苷（oligomanosides)游离出来，以便 增强它们的质谱分析法（MALDI-T0F)信号的强度。对于此种情况也可以考虑诸如乙酸水解 之类的化学处理。也可以对半乳甘露聚糖，葡聚糖甚至几丁质（真菌细胞壁的三种主要化 合物）进行类似的处理，以从这些聚合物中释放短链。
[0028] 由此，在甘露糖苷酶使循环中的甘露聚糖贡献信号后，来自三糖的信号强度增加。
[0029] 这一分析过程可能通过外切糖苷酶的作用得以补充，其结果相反以信号消失为基 础。由此，可以根据生物液体样品中存在的寡糖类型确定所涉及的病原体。
[0030] 有益地，所述所关注化合物选自下述的单糖和寡糖。[N-乙酰-氨基葡萄糖 β-(1，4)N-乙酰-氨基葡萄糖]n，其中，η是1以上10以下的数或等于10,包含2-10个 单糖的寡糖，尤其是己糖寡聚体，具体而言己糖二聚体，葡聚糖，特别是[β_(1，3)葡萄 糖，葡萄糖] η，[β-(1，6)葡萄糖，葡萄糖]η型的葡聚糖，其中，η是1以上10以下的数 或等于10,甘露聚糖，特别是[α-(1，2)甘露糖，甘露糖] η，[α-(1，3)甘露糖，甘露糖] η，[α-(1，6)甘露糖，甘露糖]η，[β_(1，2)甘露糖，甘露糖]η型的甘露聚糖，其中，η是1 以上10以下的数或等于10,半乳甘露聚糖，半乳聚糖，阿拉伯半乳聚糖和葡糖醛酸木甘露 聚糖（glucuronoxylomannans) 〇
[0031] 根据使用本发明的具体方法，所关注化合物是由病源性真菌微生物产生的化合 物，更特别地是海藻糖。
[0032] 用作标记的所述的所关注化合物可以是己糖二聚体，尤其是海藻糖（m/z = 365)。 已发现，此种类型的所关注化合物是病原体感染，尤其是白色念珠菌（Candida albicans) 感染的良好标记。
[0033] 所述的病源性真菌微生物可选自能够应答所述哺乳动物免疫系统作用产生海 藻糖的病源性真菌微生物，念珠菌属的种（Candida spp.)，尤其是白色念珠菌，曲霉属 的种，镰孢属的种（Fusarium spp·)，丝孢酵母属的种（Trichosporon spp·)，酿酒酵 母（Saccharomyces cerevisiae),支顶饱菌属的种（Acremonium spp·)，粗球抱子菌 (Coccidioides immitis),荚膜组织胞楽菌（Histoplasma capsulatum),申克氏抱子丝菌 属（Sporothrix schenckii)和卡氏月市囊虫属(Pneumocystis jirovecii)。
[0034] 有益地，所述病源性真菌微生物选自能够应答所述哺乳动物免疫系统作用产生海 藻糖的、上述列出的病源性真菌微生物。
[0035] 有益地，向所述样品中加入已知量的至少一种标准化合物，以便于将由所述给定 的所关注化合物获得的信号与由所述标准化合物获得的信号相比较，由此确定所述样品中 包含的所关注化合物的量。所述的化合物可以在处理前加入所述样品中，根据本发明，可以 将具有接近于被分析的寡糖的m/z值的化合物用作标准化合物。据认为当m/z值属于某种 间隔（所述所关注的化合物的m/z-5 ;所述所关注的化合物的m/z+5)或在这一间隔的限度 内，为类似于所述所关注化合物的m/z值。
[0036] 有益地，所述标准化合物在柱上的色谱表现与待检测的化合物的表现一致。其可 以在加热阶段之后、流经两个柱子之前添加。所述的标准柱（standard column)不能是存 在于生物液体中的化合物，无论是健康的还是病源性的。所述的标准柱不能是易于被鉴定 为细菌污染引起的。为了这些目的，有益地，利用可经放射性同位素标记的二糖或三糖。例 如，用氘化的海藻糖（MW 2H海藻糖=356+Na = 379)作为标准化合物。
[0037] 根据另一种操作方法，确定来自给定的所关注化合物的信号的信号强度与遍在的 内源信号的强度的比率，所述内源信号之前确定并可能特异于获取所述样品的生物液体的 类型，由上述的结果可定量所述样品中包含的所关注化合物。
[0038] 本发明人的另一贡献在于鉴定出了存在于全部血清样品中的恒定信号（被称为 遍在信号），其可用于定量生物学液体类型中所述的所关注化合物。本领域技术人员可以通 过实施MLDI-TOF分析若干给定的生物学液体类型的（优选地不受感染的或不被怀疑受到 感染的）样品。所述的遍在信号是存在于所述液体类型全部样品中的恒定信号，并且上述 的信号强度显示为由MALDI-T0F分析获得的光谱上的峰的高度。
[0039] 因此，根据本发明，所述生物液体可以选自动脉或静脉血，血清，来自生殖器粘膜 的液体，呼吸道的液体，具体而言，来自支气管肺泡灌洗，支气管抽吸，气管抽吸，咳痰， 唾液的液体，用于收集皮肤和体被的液体，渗漏液，来自闭腔的液体，尤其是脑髓液，来自 胃肠道或尿道的液体，以及来自研磨活检碎片的液体。
[0040] 本发明还包括实施本发明的方法的试剂盒。根据一个具体实施方案，其包括：
[0041] -至少一种由能实施反向色谱法的固体疏水相组成的起始支持物；
[0042]-至少一种第二容器，其包含进料口，输出口，以及包含在进料口和输出口之间的 粉末化活性碳填充物。
[0043] 所述的填充物可根据本领域技术人员已知的原则，或根据Whistler and Durso, Journal of American Chemical Society, 1950中所描述的，通过混合等量可商购的 活性碳C6 lite? (硅藻土）来制备。
[0044] 所述的固体疏水相可以相分离的形式存在并包含磁性材料，以便于在接触所述生 物液体后通过磁石去除所述的固相。例如，所述疏水相可以是以疏水材料覆盖的、包含亚铁 或磁性材料的多个珠子的形式。使所述分离形式的固体疏水相与生物液体样品相接触。可 以将其混合。所述的珠子提供了大的接触表面积。接触了一段时间之后，用磁石去除所述 的固体疏水相，例如，将磁石浸入所述生物液体和固体疏水相珠子的混合物中，所述的珠子 黏附于磁石，使得经处理的生物液体容易地被分离。
[0045] 根据另一种操作方法，所述的试剂盒还包含给定量的标准化合物，所述的标准化 合物选自：可能经放射性同位素标记的单糖，二糖和三糖，尤其是氘化的海藻糖。
[0046] 有益地，所述的试剂盒还包含给定量的、能与由生物液体中所包含的多糖和/或 寡糖和/或单糖形成的复合物反应的酶。
[0047] 包含可实施上述反向色谱法的固体疏水相的支持物可以是平板，孔，柱子，试管， 或包含大量孔的平板。
[0048] 填充固体活性碳的容器可以是与上述支持物的选自无关的孔，柱子，试管，或包含 大量孔的平板。有益地，本发明的试剂盒还包含MALDI平板。
[0049] 本发明还涉及所关注化合物在通过MALDI-T0F质谱分析法进行侵染性真菌感染 体外诊断中的用途，所述的所关注化物选自多糖，寡糖和单糖，尤其是海藻糖。
[0050] 在附有下文中的非-穷尽的实施例以及选自下述的附图的说明书描述中，本发明 的特征，具体技术特征及其各种有益效果更加清晰明了，所述的附图为：
[0051] -图Ia-Id分别示出根据本发明的方法通过由列于表1的G25, G32, G49和G48血 清制备的MALDl平板分析获得的质谱（MALDI-T0F)，存在于血清样品中的化合物以峰（或信 号）示于图谱上，图谱的X轴表示以峰的形式显示的所述化合物的m/z比率（以质量单位 计-MU)，Y轴显示信号高度（峰高度）的强度，其相应于包含于所述样品中的化合物的量， 以来自全部血清的遍在内源信号值为100% ;和
[0052] -图2a其纵轴上所示的是，X轴上所示的表1所列血清样品中包含的甘露聚糖 (ng/mL)的量，所述的数量由Plat6lia?的白色念珠菌试剂盒获得；
[0053] -图2b示出表1的血清样品中所含的葡聚糖（ng/mL)的量，Y轴上示出葡聚糖的 量，血清号于X轴上显示；所述的量是利用FungiteH?试剂盒测定的；
[0054] -图2c示出表1中每个样品所包含的己糖寡聚体（由两个己糖形成的寡聚体，详 见下文）的量。Y轴上示出以遍在信号百分数计的上述寡聚体的量，所述的组示于X轴，所 述的数量利用本发明的方法获得，表示由上述寡聚物获得的峰高度与遍在信号Xioo获得 的峰高度之间的比率；
[0055] 定义
[0056] 根据本发明，所述的哺乳动物没有限制：其可以是人或任意其他的哺乳动物。由 此，本发明可用于人类医药或兽类医药。
[0057] 根据本发明，所述的寡糖和多糖定义为通过糖苷键彼此相连的单糖。所述的寡糖 由2-10个单糖组成，所述的多糖由10个以上的单糖组成。
[0058] MALDI-T0F光谱仪是质谱仪，其中辅以激光解吸/电离作用的MALDI基质与 TOF(飞行时间）质谱仪分析器相偶联。这种类型的仪器应用广泛，包括医院环境。
[0059] 根据本发明，所关注化合物的存在由通过MALDI-T0F光谱测定法获得的质谱上的 可见峰定义。本领域技术人员也可以在所述光谱上识别可见因而显著的峰。具体而言，根 据本发明显著的峰表示为参照峰强度的1%或以上；有益地，3%或以上，或更有益地，至少 等于参照峰强度的近5%。
[0060] 根据本发明，术语"侵染性真菌感染"集合了由哺乳动物外周血中的酵母 (mushrooms)引起的感染以及引起血液以及至少一种组织损伤的感染。如果是,例如白色念 珠菌的感染，可能发生由酵母血管外血源性扩散引起的肝脏和肾损伤，术语"侵染性真菌感 染"集合了念珠菌血症和侵染性念珠菌病。
[0061] 根据本发明，所关注化合物的存在由通过MALDI-T0F光谱测定法获得的质谱上的 可见峰定义。本领域技术人员也可以在所述光谱上识别可见因而显著的峰。具体而言，根 据本发明显著的峰表示为参照峰强度的1%或以上；有益地，3%或以上，或更有益地，至少 等于参照峰强度的近5%。
[0062] 根据本发明，术语"侵染性真菌感染"集合了由哺乳动物外周血中的酵母 (mushrooms)引起的感染以及引起血液以及至少一种组织损伤的感染。如果是,例如白色念 珠菌的感染，可能发生由酵母血管外血源性扩散引起的肝脏和肾损伤，术语"侵染性真菌感 染"集合了念珠菌血症和侵染性念珠菌病。
[0063] 根据本发明，作为在宿主液体中病源性微生物的任意残留物质的、来自病源性真 菌微生物的化合物，可自发地、或作为微生物本身或通过宿主酶解聚/降解结果释放。所 述的所关注化合物可来源于，与来自病源性真菌微生物的糖蛋白或糖脂相偶联的多糖或聚 糖。所述的所关注化合物可来源于病源性真菌微生物的细胞壁，或病源性真菌微生物细胞 壁的降解产物，由所述病源性真菌微生物分泌的/排泄的化合物，或当所述微生物被宿主 细胞破坏时由所述病源性真菌微生物表达并释放的化合物。也可能是来自受感染的哺乳动 物和所述病源性真菌微生物之间的相互作用的化合物。
[0064] 术语病源性真菌微生物指真菌（酵母），其遗传机制使其多糖或寡糖序列不同于 哺乳动物产生的那些多糖或寡糖，或以生理上不存在于它们机体中的量产生。
[0065] 根据本发明，术语"生物液体"指来自活体生物，尤其是哺乳动物，更特别是人的任 何液体，包含水，至少一种蛋白质和/或一种类型的液体和/或至少一种以离子，例如钠， 钾，形式存在的矿物盐，所述的离子可以是金属离子。就本发明而言，盐定义为离子形式的 矿物盐。
[0066] 以下描述的实验，指由白色念珠菌引起的真菌感染，可由所研究的一种、两种或更 多种病源性微生物人工感染哺乳动物制备。因而，下述的实验可用于确定适合用作有待研 究的病源性微生物引起的侵染性真菌感染标记的所关注化合物，表征所述的所关注化合 物，并确定它/它们与所述感染之间的关系。
[0067] 实验部分
[0068] 第一阶段：处理生物样品以检测聚糖，所述程序适用于血清。
[0069] -将300pL的试验样品加入到I. 5ml无菌微试管中，向每管中加入100 μ L的处理 溶液（EDTA酸溶液）
[0070] - "涡旋"混合
[0071] -将用锁闭装置密封的微试管在加热器上，120°C下，6min
[0072] -移出所述试管，10, OOOg离心IOmin
[0073] -将上清（150 μ 1)转移到I. 5ml无菌微试管中
[0074] 接下来，通过质谱分析法在上清中检测聚糖。该处理步骤释放/解离凝聚在凝 块中的蛋白质复合物中的甘露聚糖和半乳甘露聚糖，所述的处理步骤不会改变葡聚糖 (Fungitell? kit)的比色测量值,其所产生的结果与未经处理的样品所产生的结果一致。 相比之下，这一处理步骤去除了由过多的蛋白质，甘油三酯，胆红素和/或血红蛋白造成 的干扰。
[0075] 第二阶段：在实施质谱分析法之前处理上清液以纯化并浓缩所述的寡糖
[0076] 将100 μ L的上清置于固相提取（SPE)柱（ref SPE-C18:C18S印-Pak柱体 (Waters)) (1体积）），（具有疏水填充物的一个柱），所述的柱已用五倍体积的乙腈溶液 (ANC)和水（75:25, vol/vol)预平衡，并经10倍体积的水洗过。在所收集的上清进入柱体 后，用两倍体积的水漂洗，收集。所述的C18柱洗脱液置于含等重的商购活性碳和C6 (当量体积）混合物SPE柱，所述的柱已用五倍体积的乙腈ANCVH 2O (25:75, vol/vol)溶液 预平衡并经10倍体积的水洗过。所述体积的上清流入所述柱体后，用20倍体积的水漂洗 所述的柱体，弃去洗脱液。所述的柱用2倍体积的乙腈ANCVH 2O (25:75, vol/vol)溶液漂洗。 弃去第一个100 μ L，收集之后的200 μ L。干燥所述的洗脱液（ANCVH2O)。
[0077] 第三阶段：由质谱分析法分析寡糖
[0078] 所用的质谱仪是 MALDI-T0F Voyager Elite DES-TR 分光光度计（Perspective Biosystems Framingham, MA)。将所述的干提取物溶于水，向IpL溶液中掺入1 μ L(10mg/ ml，于ACN/H2050/50中）二氢苯甲酸溶液。将1 μ L所述溶液存放于MALDI TOF板（不锈钢 盘，96孔，环形），于50°C结晶。所述的MALDI-T0F分析以正反射模式（positive reflectron mode)进行，所述的正反馈模式，利用具有1，000以下的m/z比率的中性寡糖优化的采集参 数。采集数据后，通过观察生成的加合物（M+Na) +确定所述混合物中存在的寡聚葡萄糖。 根据公式M HeXn=180+[162](n-l)+23计算用于诊断的、所关注的质量（M)。通过计算M Hexn信号，即遍在的内源信号的比率，或利用被加到第二阶段的第一相中的样品中的外标， 计算分子组的相对定量（Relative quantification)。迄今为止，用于诊断的所关注的信号 是M Hex2 = 365。进一步给出的分析示例基于对365/361比率的计算。
[0079] 人血清分析
[0080] 将本发明的方法应用于来自Lille地方大学医院住院患者的12份血清，并基于下 述原则进行筛选：
[0081] i)患者在住院期间曾患有全身性念珠菌病，经至少一种白色念珠菌血液培养证 实；
[0082] ii)患者曾被要求进行血液葡聚糖或甘露聚糖检测，结果之一或两者为阳性，其曾 指向或证实了，针对发现血液培养样品为阳性两周内或之前获取的血清样品的诊断；
[0083] iii)以合法理由，于_20°C储存一年的至少Iml剩余血清的可获得性。
[0084] 以下的表I概括了利用Piat6 IiaK抗原和Fongite·?试剂盒，由符合上述标准因 而遭受IFD的12位患者的血清所获得的结果。血清样品甘露聚糖由Plat6 Ha雜检测，葡聚 糖由Fongitell?检测。
[0085] 表 I
[0086]
【权利要求】
1. 一种用于病源性真菌微生物引起的侵染性真菌感染的体外诊断方法，其中，所述方 法包括： -提取由哺乳动物获得的生物液体样品中所含的多糖和/或寡糖和/或单糖，所述的 生物液体样品包含蛋白质和/或脂质和/或盐，和/或易于与所述的蛋白质和/或脂质和 /或盐形成复合物的所述多糖和/或寡糖和/或单糖； -利用MALDI-TOF质谱分析法确定所提取的多糖，寡糖和/或单糖中是否存在来源于 所述真菌微生物、且选自所述多糖，寡糖和单糖的至少一种所关注的化合物； -推断如果所述样品中存在所关注的化合物，则所述的哺乳动物正遭受侵染性真菌感 染。
2. 权利要求1的方法，其中，为了从所述的生物样品提取所述的多糖和/或寡糖和/或 单糖： -通过沉淀/凝聚大多数所述蛋白质或所述脂质，分离包含于所述生物液体样品中的 所述复合物； -离心所述的样品，使上清与固相分离； -回收上清； -通过，尤其是反向色谱法，将包含于上清液中的所述多糖和/或寡糖和/或单糖与残 余蛋白质和残余脂质分离，通过，尤其是吸收色谱法，使所述的多糖和/或寡糖和/或单糖 与所述的盐分离。
3. 权利要求2的方法，其中，为了解离所述的复合物，向所述样品中添加络合剂，尤其 是喊，具体而目是EDTA，将所述的混合物加热至沸腾，具体而目加热到100°C和140°C之间 的温度，特别是接近120°C。
4. 权利要求2和3任一项的方法，其中，先进行反向色谱法，之后进行吸收色谱法。
5. 权利要求3和4任一项的方法，其中，含疏水相的柱用于反向色谱法，含活性碳的柱 用于吸收色谱法。
6. 权利要求1-5任一项的方法，其特征在于，所述的所关注化合物具有1000以下的m/ z比率。
7. 上述权利要求任一项的方法，其中，加入至少一种易于作用于所述多糖和/或寡糖 的酶，和/或进行化学处理，以切断由于所述复合物的分解所产生的所述多糖和/或寡糖 链，结果潜在地增加所述所关注化合物的量。
8. 上述任一权利要求的方法，其中，所述的所关注化合物选自下述的单体和寡聚体：[N-乙酰-氨基葡萄糖0-(1，4)N-乙酰-氨基葡萄糖]n，n是1以上10以下的数或等于 10,糖，包含2-10个糖的寡糖，具体而言是己糖寡聚体，尤其是己糖二聚体；葡聚糖，特别 是[￠-(1,3)葡萄糖，葡萄糖]n，[￠-(1,6)葡萄糖，葡萄糖]n型的葡聚糖，n是1以上10 以下的数或等于10 ;甘露聚糖，特别是[a-(1，2)甘露糖]n，a _(1，3)甘露糖]n，a _(1，6) 甘露糖]"和a-(l，2)甘露糖]"型的甘露聚糖；其中，n是[a-(l，2)甘露糖]n，[a-(l，3) 甘露糖甘露糖]n，a-(1，6)[甘露糖甘露糖]n，甘露糖[a _(1，2)甘露糖，甘露糖]n的数， 半乳聚糖，半乳甘露聚糖，阿拉伯半乳聚糖和葡糖醛酸木甘露聚糖。
9. 权利要求7的方法，其中，所述的所关注化合物是由所述病源性真菌微生物在所述 哺乳动物免疫系统的作用下产生的化合物，更具体地，是海藻糖。
10. 上述任一权利要求的方法，其中，所述的病源性真菌微生物选自：念珠菌属的种 (Candida spp.)，尤其是白色念珠菌，曲霉属的种，镰孢属的种（Fusarium spp.)，丝孢酵母 属的种（Trichosporon spp.)，酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae),支顶饱菌属的种 (Acremonium spp.),足放线病菌属的种（Scedosporium spp.),粗球抱子菌（Coccidioides immitis),荚膜组织胞楽菌（Histoplasma capsulatum),申克氏抱子丝菌属（Sporothrix schenckii)和卡氏肺囊虫属（Pneumocystis jirovecii)，且应答所述哺乳动物免疫系统的 作用，所述的病源性真菌微生物产生海藻糖。
11. 上述任一权利要求的方法，其中，向所述样品中加入已知量的至少一种标准化合 物，以便于将由所述给定的所关注化合物获得的信号与由所述标准化合物获得的信号相比 较，由此确定所述样品中包含的所关注化合物的量。
12. 上述任一权利要求的方法，其中，确定来自给定的所关注化合物的信号的强度与遍 在的内源信号的强度的比率，所述内源信号之前确定并可能特异于获取所述样品的生物液 体的类型，由上述的结果可定量所述样品中包含的所关注化合物。
13. 上述任一权利要求的方法，其中，所述的生物液体选自：动脉或静脉血，血清，生殖 器粘膜的液体，呼吸道的液体，具体而言，来自支气管肺泡灌洗，支气管抽吸，气管抽吸， 咳痰，唾液的液体，用于收集皮肤和体被部分的液体，渗漏液，来自闭腔的液体，尤其是脑 髓液，来自胃肠道或尿道的液体，以及来自研磨活检碎片的液体。
14. 能实施上述任一权利要求的方法的试剂盒，其中，所述的试剂盒包括： -至少一种包含能实施反向色谱法的固体疏水相的起始支持物； -至少一种第二容器，其包含进料口，输出口，以及在进料口和输出口之间的固体活性 碳填充物。
15. 权利要求14的试剂盒，其中，所述的填充物通过混合等量活性碳和硅藻土来制备。
16. 权利要求14或15的试剂盒，其中，所述的疏水固相以相分离的形式存在并包含磁 性材料。
17. 权利要求14-16任一项的试剂盒，其中，所述试剂盒还包含给定量的标准化合物， 所述的标准化合物选自：可能经放射性同位素标记的单糖，二糖和三糖，尤其是氘化的海 藻糖。
18. 权利要求14-17任一项的试剂盒，其中，所述的试剂盒还包含给定量的、能与生物 液体中所包含的多糖和/或寡糖和/或单糖形成的复合物反应的酶。
19. 权利要求14-18任一项的试剂盒，其中，所述包含可实施反向色谱法的疏水固相的 支持物以及包含所述活性碳填充物的容器，分别独立地选自下述：平板，孔，柱子，试管，或 包含大量孔的平板。
20. 权利要求14-19任一项的试剂盒，其中，所述的试剂盒还包含MALDI平板。
21. 所关注化合物在通过MALDI-T0F质谱分析法进行侵染性真菌感染体外诊断中的用 途，所述的所关注化物选自多糖，寡糖，单糖，和海藻糖。
【文档编号】G01N33/68GK104411833SQ201380034007
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2013年6月24日 优先权日:2012年6月26日
【发明者】D.普兰, B.森迪德, Y.格拉德尔, N.弗朗索瓦 申请人:里尔大学地区医疗中心, 里尔法律与医疗卫生大学, 里尔科学技术大学, 国家科学研究中心