用作免疫测定的标准化对照的人因子xiii的制作方法

用作免疫测定的标准化对照的人因子xiii的制作方法
【专利摘要】本发明提供了用于对测定，如免疫测定中检测的信号的量进行标准化的组合物和方法。该组合物和方法可用于改善免疫测定的精确度，如检测对象是否感染逆转录病毒如HIV的免疫测定。
【专利说明】用作免疫测定的标准化对照的人因子XIII
[0001] 相关专利申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2012年6月22日提交的美国临时专利申请第61/663, 293号的优先 权，其通过引用全文纳入本文。 发明领域
[0003] 本发明涉及免疫诊断的领域。 技术背景
[0004] 检测生物样品中HIV抗原和针对HIV抗原的抗体的免疫测定可用于测定对象是否 感染或已经暴露于HIV。现有的测定检测HIV抗原和针对HIV-1的抗体，包括组0和M，以 及针对HIV-2的抗体。然而，检测生物样品中分析物的量的测定受到可能产生欺骗性结果 的误差的影响。存在多种可能产生误差的因素。这些因素包括试剂浓度的变化（例如，由 于试剂稳定性或设备吸量误差所致）、设备处理步骤（例如，试剂分散体积、洗涤步骤后不 完全抽吸导致试剂稀释、孵育计时）、设备条件（检测器温度）和样品基质影响（例如，血清 与血浆）。
[0005] 美国专利号7, 141，362中描述了一种用于对测定中分析的样品的量或体积进行 检验的方法。该方法检测了样品中人血凝集因子XIII(hFXIII)亚基a和b的量以确定样 品的体积，并且也可用于将血浆和血清与其他类型的生物样品区分开。在使用固体支持物 上固定的针对hFXIII亚基的抗体的免疫测定中检测样品中hFXIII的量。
[0006] 另外，对样品如校准物、对照或患者试样（血清或血浆）的重复分析可能产生不一 致的结果，其导致高变异系数（相对标准偏差％)。在一些情况中，变化可高达50%或更大 并且可能足够对于一些重复样产生归为阳性的响应但对其他重复样则呈阴性。这种变异性 在诸如HIV检测的关键测定中是不可接受的。本发明解决了在分析中导致高变异系数的误 差的问题。


【发明内容】

[0007] 本发明描述了一种可用作生物测定中的标准化标准和/或内部对照的标准化因 子。在一些实施方式中，使所述标准化标准与测定中包括的固体支持物连接。在一个方面， 描述了一种用于对检测生物样品中分析物的免疫测定中的结果进行标准化的方法。通过与 特异性结合单一分析物的结合成员结合来检测分析物。通过在测试中包含标准化因子，可 以校正由样品处理中的变化或与各种样品类型相关的生物基质影响导致的误差。在一些实 施方式中，标准化因子并不与样品中的分析物特异性结合。
[0008] 因此，在一些实施方式中，生物样品与结合样品中一种或多种分析物的一种或多 种结合成员一起孵育，并且检测其中是否有任何分析物与结合成员结合。例如，如果分析物 是抗原，则相应的结合成员可以是特异性结合该抗原的抗体。同样，如果分析物是抗体，则 相应的结合成员可以是特异性结合该抗体的抗原。因此，单个靶分析物特异性结合相应的 结合成员，并且一组分析物可结合至相应的一组结合成员。然后鉴定与给定的结合成员结 合的分析物。这种鉴定的一个方式是使用固定于固体支持物的结合成员，并对于各结合成 员使用不同的固体支持物。例如，在单个固体支持物上仅固定一种结合成员的分子，并且可 通过结合成员本身以外的方式互相区分不同结合成员的固体支持物。可通过使用与固体支 持物相关的区分参数来互相区分固体支持物，带有任何一种结合成员的所有支持物可通过 区分参数与带有任何其他结合成员的所有支持物区分。因此，可使用区分参数来将固体支 持物分成可互相区分的亚群。
[0009] 可通过使用结合试剂来实现对来自样品的分析物与结合成员之间的免疫结合的 检测。例如，可使用对标准化因子具有结合亲和性的结合试剂和对样品中各分析物具有结 合亲和性的结合试剂来检测结合。在某些实施方式中，结合试剂与其上固定有结合成员的 固体支持物在促进结合试剂与标准化因子和分析物结合的条件下孵育。在一些实施方式 中，结合试剂与标签偶联。在一些实施方式中，该标签是生物素。在一些实施方式中，该标 签是可检测标签，如荧光部分。
[0010] 在结合试剂与固体支持物孵育之后，回收固体支持物以从未结合的结合试剂分离 其上结合有分析物和/或标准化因子的支持物。在结合试剂与生物素偶联的实施方式中， 固体支持物可与和可检测标签耦合的链霉亲和素孵育。在一些实施方式中，该可检测标签 是荧光标签，如藻红蛋白（PE)。然后检测与固体支持物结合的标签的量。例如，可通过能够 测量由标签发出的荧光信号的量的任何方法来检测标签。
[0011] 检测到的标签的量可与区分参数相关联以得到代表样品中各单独分析物的水平 或量的值，以及代表与固体支持物结合的标准化因子的水平或量的值。这允许代表样品中 各单独分析物的水平的值对代表标准化因子的水平的值进行标准化。该标准化允许待校正 的样品处理中的变化，从而改善测定的性能。该标准化也允许待校正的例如来自可检测标 签的信号强度的变化，其中信号强度的变化是由于样品的来源（即，生物基质影响）。
[0012] 在一个实施方式中，标准化因子是人因子XIII (hFXIII)。在一个实施方式中，该 方法使用与固体支持物耦合的人因子XIII作为生物测定中的标准化因子和/或内部对照。 因此，在某些实施方式中，固体支持物的一个亚群具有固定其上的hFXIII。在一些实施方 式中，固体支持物是珠或磁珠。在一个实施方式中，hFXIII固定于珠。在一些实施方式中， hFXIII固定于磁珠。在一个实施方式中，固定于珠或磁珠的hFXIII被称为信号标准化珠 (SNB)。可使用抗-hFXIII抗体检测与固体支持物结合的hFXIII。如本文所述，该抗-hFXIII 抗体一般不存在于从对象中分离的生物样品中，但是在样品处理期间与对分析物具有特异 性的其他结合试剂一起加入，以提供检测固定于固体支持物的hFXIII的方式。
[0013] 在一些实施方式中，固体支持物的一个亚群含有固定于其上的针对hFXIII的抗 体，其用于检测生物样品中存在的hFXIII(即，亚基a和/或b)的结合，如美国专利号 7, 141，362所述，其通过引用全文纳入本文。因此，在一些实施方式中，抗-hFXIII抗体固定 于包含珠或磁珠的固体支持物上。在一个实施方式中，具有固定于其上的抗-hFXIII抗体 的珠或磁珠被称作血清检验珠（SVB)。SVB允许确认测定中存在血清样品。
[0014] 在另一个方面，提供了一种用于对测定结果进行标准化的方法，如用于检测生物 样品中分析物的多重免疫测定。在某些实施方式中，免疫测定是用于检测一组分析物，其水 平表示生物样品中人免疫缺陷病毒（HIV)的感染。通过与各自单独结合单独的分析物的相 应的一套或一组结合成员结合来检测该组分析物。样品中的一个或多个分析物与一个或多 个结合成员的结合表明该生物样品来自感染HIV的对象。通过包含标准化因子，可对由样 品处理中的变化或生物基质影响的变化导致的误差进行校正。
[0015] 在一些实施方式中，该组分析物的成员是HIV抗原和/或结合至HIV-1和HIV-2 的抗体。在某些实施方式中，该组分析物的成员包括：
[0016] (i)p24 抗原，
[0017] (ii)针对HIV 1型的抗体，
[0018] (iii)针对HIV 2型的抗体，
[0019] (iv)针对HIV 1型，组0的抗体，和
[0020] (v)针对HIV 1，组M的抗体。
[0021] 在一些实施方式中，结合成员与上述的一组HIV分析物中的一员特异性结合。在 一些实施方式中，结合成员是抗-P24抗体、HIV-1包膜蛋白gp-160、SP0H或AFR。
[0022] 免疫测定也可包含其上固定有针对人因子XIII的抗体的固体支持物。如上述，针 对人因子XIII的抗体与生物样品中存在的hFXIII结合，并且因此用作检验样品含有血清 或血浆的测定，有助于避免假阴性结果。因此，在一个实施方式中，结合成员是针对人因子 XIII的抗体。
[0023] 也可使用生物素化的偶联物来检测一组分析物的结合，其水平表示HIV感染。在 一些实施方式中，生物素化的偶联物与HIV抗原、针对HIV-1的抗体和针对HIV-2的抗体结 合。在一些实施方式中，生物素化的偶联物与标准化因子结合。在一些实施方式中，标准化 因子是hFXIII。
[0024] 在一些实施方式中，生物素化的偶联物选自39^^^886、5￥2￥、4?1?、针对口24抗原 的抗体和针对人因子XIII的抗体。
[0025] 在一些实施方式中，固体支持物是珠或磁珠。
[0026] 在一些实施方式中，固体支持物与四甲基尸胺若丹明（TMRC)耦合。
[0027] 本发明还涉及包含固定于固体支持物上的标准化因子和一组结合成员（其各自 固定于固体支持物上）的试剂盒。该组结合成员包括任何上述各种结合成员，并且固体支 持物还含有经选择的区分参数，使得带有该组的任一结合成员的所有支持物可通过这些参 数与带有组中其他结合成员的所有支持物区分。
[0028] 在一些实施方式中，试剂盒包括用于确定对象是否感染HIV或用于确定对象中感 染阶段的一组结合成员。在一些实施方式中，所述对象是人。因此，在一些实施方式中，试 剂盒包括固定于固体支持物上的标准化因子和多种结合成员，固定于固体支持物上的各 结合成员，所述多种结合成员包括：（i)抗-p24抗体，（ii)HIV-l包膜蛋白gp-160，（ii) HIV-2SPOH和（iv)HIV-O AFR。在一些实施方式中，固体支持物包括经选择的区分参数，使 得带有多种结合成员中的任一结合成员的所有支持物可与带有多种结合成员的其他结合 成员的所有支持物区分。
[0029] 在一些实施方式中，试剂盒包括不与来自生物样品的分析物结合的标准化因子。 在一个实施方式中，标准化因子是hFXIII。该试剂盒还可包括固定于固体支持物上的针对 人因子XIII的抗体。
[0030] 在某些实施方式中，该试剂盒还提供了固定于固体支持物上的四甲基尸胺若丹明 (TMRC)。在一些实施方式中，固体支持物是珠或磁珠。
[0031] 定义
[0032] "结合试剂"是对另一种化合物具有结合亲和性的化合物。例如，结合试剂可以高 亲和性与固定于固体支持物上的标准化因子结合。结合试剂也可与生物样品中的分析物结 合。结合试剂可与标准化因子或靶分析物发生免疫反应。例如，结合试剂可以是特异性结 合生物样品中的标准化因子或抗原的抗体，或者结合试剂可以是特异性结合生物样品中的 抗体的抗原。该结合试剂可与允许结合试剂被检测到的标签偶联。在一些实施方式中，结 合试剂并不固定于固体支持物上。
[0033] 本文使用的术语"结合成员"指特异性结合至靶分析物的分子或试剂。结合成员 可以与靶分析物发生免疫反应。例如，结合成员可以是特异性结合生物样品中的抗体的抗 原，或者结合成员可以是特异性结合生物样品中的抗原的抗体。结合成员可固定于固体支 持物上，包括但不限于固定于珠或磁珠上。
[0034] "标准化因子"是可用于对测定结果进行标准化的分子。标准化因子通常不与样品 中感兴趣的分析物反应或以高亲和性与之结合。
[0035] 本文所用术语"标签"或"可检测部分"指可通过光谱、光化学、生物化学、免疫化 学、化学或其它物理手段检测的组合物。标签的示例是32P、荧光染料、高电子密度试剂、酶 (例如，ELISA中常用）、生物素、地高辛以及可被检测的半抗原和蛋白质或其他实体（例 如通过将放射性标签整合至肽中或用于检测与肽特异性反应的抗体）。该标签可整合至例 如抗体和/或其它蛋白质的任何位置。可以采用本领域已知的用于使抗体或蛋白质（肽） 与标签偶联的任何方法，例如，使用如下文献中所述的方法：Hermanson，Bioconjugate Techniques (《生物结合技术》）1996,学术出版社有限公司（Academic Press，Inc.)，圣迭 戈。或者，使用高亲和性相互作用的方法可以获得相同的效果，其中一对结合伴侣（binding partner)中的一个能够结合另一个，例如生物素和链霉亲和素。本文所述本发明的蛋白质 可直接用同位素、发色团、发光团、色原体标记，或者间接标记，例如通过生物素，该生物素 随后可被复合体中的链霉亲和素（包含荧光、放射性或可被直接检测的其他部分）结合。因 此，生物素化的抗体被认为是本文使用的"经标记的抗体"。
[0036] 本文所用术语"抗体"指由一个或多个免疫球蛋白基因编码的多肽，或其特异性结 合并识别分析物（抗原）的片段。识别的免疫球蛋白轻链被归类为K或X。免疫球蛋白重 链分为y、U、a、S或e，它们进而分别定义免疫球蛋白类型IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。
[0037] 免疫球蛋白G(IgG抗体）的结构单元的一个示例是四聚体。各这类四聚体由相同 的两对多肽链组成，每对包含一条"轻"链（约25kD)和一条"重"链（约50-70kD)。每条 链的N末端确定约100至110个或更多个氨基酸构成的可变区，所述可变区主要负责抗原 识别。术语"轻链可变区"（VL)和"重链可变区"（VH)分别指这些轻链和重链。
[0038] 抗体以完整的免疫球蛋白形式或用不同肽酶对完整的免疫球蛋白进行消化产生 的具有良好表征的片段形式存在。因此，例如，胃蛋白酶在铰链区中的二硫键连接附近消 化抗体，产生F(ab' )2, Fab的二聚体，其本身是由二硫键连接于VH_CH1的轻链。可在温和 条件下还原F(ab' )2二聚体以打断铰链区中的二硫连接，从而将F(ab' )2二聚体转化为 两个Fat/单体。Fat/单体实质上是具有部分铰链区的Fab (参见Paul编，Fundamental Immunology (《基础免疫学》），第三版，雷文出版社（Raven Press)，纽约，1993)。虽然根据 对完整抗体的消化定义了多种抗体片段，但是本领域技术人员应理解，这类片段也可用化 学方法或重组DNA方法从头合成。因此，本文中所用术语"抗体"也包括通过全抗体修饰或 用重组DNA方法从头合成所产生的抗体片段，如单链Fv。
[0039] 涉及蛋白质、肽或抗原时，描述与抗体结合的术语"特异性（或选择性）"或"特异 性（或选择性）与……发生免疫反应"或"具有对……的结合特异性"指能在蛋白质和其 它生物物质的异质群体存在的情况下确定是否存在蛋白质、肽或抗原的结合反应。因此， 在给定的免疫测定条件下，特定的抗体结合样品中的特定蛋白质而不以显著量结合样品中 存在的其他蛋白质。在这样的条件下与抗体的特异性结合可能需要就抗体对特定蛋白质 的特异性来选出的抗体。例如，可以选择针对某一蛋白质产生的抗体以得到不与其他蛋白 质而与该蛋白质发生特异性免疫反应的抗体。可利用各种免疫测定形式来选择与特定蛋 白质发生特异性免疫反应的抗体。例如，常规使用固相ELISA免疫测定、Western印迹或免 疫组化法来选择与某一蛋白质发生特异性免疫反应的单克隆抗体。参见，Harlow和Lane， Antibodies，A Laboratory Manual (《抗体，实验室手册》），冷泉港出版社（Cold Spring Harbor Publications)，纽约（1988)，来获得关于可用于确定特定免疫反应性的免疫测定 形式和条件的描述。通常，特异性或选择性反应会是背景信号或噪音的至少2倍，更通常而 言是背景的多于10至100倍。
[0040] 用于本发明的某些实施方式的抗体是抗人抗体，尤其是那些经标记的抗人抗体。 这些抗人抗体中优选针对人IgG的那些抗体、针对人IgM的那些抗体和针对人IgA的那些 抗体。
[0041] 术语"生物样品"包括从生物体中得到的多种样品类型。该术语包括体液诸如血 液、唾液、血清、血浆、尿液和生物来源的其它液体样品，固体组织样品诸如活检样品或组织 培养物或来源于其中的细胞及其子代。如本文所述，生物样品一般是含有可检测量的感兴 趣分析物，例如抗原、抗体、蛋白质、肽、核酸或小分子的体液或组织。该术语包含获得后经 任何方式处理的样品，如试剂处理、溶解、沉降或对某些组分的富集。该术语包括临床样品， 也包括细胞培养物中的细胞、细胞上清液、细胞裂解物、血清、血浆、其他生物液体和组织样 品。优选的生物样品是血液样品、血浆样品和血清样品。
[0042] 本文所用术语"固体支持物"指可固定试剂（如抗体或抗原）的固体惰性表面或 主体，所述试剂在本文所述任何结合反应中具有反应活性。本文所用术语"固定"指分子基 础的偶联，其在本文所述试验的任意步骤期间、在任何施加的条件下都不会移开或去耦合。 这类固定可通过共价键、离子键、亲和型键或任何其他化学键实现。
[0043] 本文所用术语"颗粒"指固体主体，通常任何形状或表面结构的线性尺寸为微米级 (即小于100微米）。本文所用术语"珠"指形状为球形或近球形的颗粒，通常在组合物中 多聚化。
[0044] "多重"测定是在单个样品中同时检测超过一种分析物的分析方法。
[0045] 本文所用术语"分析物"或"靶分析物"表示生物样品中存在的分子并且指示对象 (如人对象）中生物学状况存在与否。术语生物学状况可以不受限制地使用，并且可包括 正常状况和异常状况。例如，生物学状况可以是病理状况，如疾病、感染、癌症或自身免疫疾 病。分析物也可指示疾病或感染的阶段或发展，如在疾病治疗期间或感染的不同阶段期间。 分析物也可指示对生物学状况的诊断或预后。
[0046] 术语"经标记的结合部分"是指与标签偶联或耦合的分子或试剂。标签可以是可 检测标签，如荧光团，或可以是间接标记的标签，例如生物素或链霉亲和素标记，或用可用 于产生可检测信号的酶如碱性磷酸酶（AP)或马辣根过氧化物酶（HRP)标记。经标记的结 合部分可与结合试剂结合，或者当标签是亲和素、链霉亲和素或等同物时，与生物素化的偶 联物结合。
[0047]本文所用术语"区分参数"是指与连接或固定至固体支持物的结合成员无关的固 体支持物的特征。因此，区分参数允许其上固定有不同结合成员的固体支持物可通过除了 结合成员本身以外的方式互相区分。
[0048] 术语"生物基质"是指含有感兴趣的分析物的样品的来源。例如，生物基质可以是 生物流体，例如但不限于，血清、血浆、全血、尿、唾液、淋巴液或脑脊液。术语"生物基质影 响"指当样品衍生自不同的生物基质时，测定信号的变化。

【专利附图】

【附图说明】
[0049] 图1说明了使用人因子XIII包被的珠作为对照并且在检测HIV p24抗原的代表 性HIV测定中产生经标准化的信号。进行了 12个重复样，并且如实施例1所述对数据进行 标准化。
[0050] 图2说明了使用人因子XIII包被的珠作为对照并且在检测针对HIV-1的人多克 隆抗体的代表性多重HIV对照测定中产生经标准化的信号。进行了 5个重复样，并且如实 施例2所述对数据进行标准化。
[0051] 图3说明了使用人因子XIII包被的珠作为对照并且在检测针对HIV-2的人多克 隆抗体的代表性多重HIV对照测定中产生经标准化的信号。进行了 5个重复样，并且如实 施例2所述对数据进行标准化。
[0052] 图4说明了使用人因子XIII包被的珠作为对照并且在检测针对HIV-0的兔单克 隆抗体的代表性多重HIV对照测定中产生经标准化的信号。进行了 5个重复样，并且如实 施例2所述对数据进行标准化。
[0053]图5说明了在检测针对HIV-0的抗体的代表性实验中反应容器中剩余的生物素偶 联物的各种量所降低的测定信号，如实施例5所述。
[0054] 图6说明了在补充有相同浓度的HIV p24抗原的各种生物基质中的来自相同供体 的血清和血浆样品中检测到的HIV p24抗原信号和人因子XIII信号的相对响应的曲线图。
[0055] 图7说明了来自图6所示的相同实验的经标准化的信号的曲线图，显示了不同生 物基质中所有样品的较低变化。
[0056] 选择的实施方式的描述
[0057]本发明提供了用于在进行生物测定时校正样品处理和/或生物基质影响中的变 化的组合物和方法。该组合物包含与固体支持物耦合的标准化因子。在一些实施方式中， 标准化因子可以是能够与固体支持物连接且不与生物样品中靶分析物特异性结合的任何 合适的分子。标准化因子可与固体支持物共价或非共价连接。在一些实施方式中，固体支 持物是珠或磁珠。因此，在一些实施方式中，标准化因子与珠耦合，并且标准化珠以与来自 样品的分析物特异性结合的珠相同的方式与测定中的后续检测步骤期间使用的试剂相互 作用。与标准化因子耦合的固体支持物可用于检验校正样品处理和用于测定信号标准化。 信号标准化提供了对于生物样品、对照和校准物的提高的测定精确度，并且改善了在测定 中使用的试剂的使用期间的信号稳定性。
[0058] 在一个实施方式中，标准化因子是人因子XIII (hFXIII)。在一个实施方式中，该 方法使用与固体支持物偶联的人因子XIII作为生物测定中的标准化因子和/或内部对照。 在一个方面，提供了与hFXIII耦合的固体支持物用作标准化标准和/或内部对照。
[0059] 因此，在一些实施方式中，可在免疫测定中使用hFXIII-耦合的固体支持物来校 正样品处理中的变化。在一个实施方式中，hFXIII-耦合的固体支持物允许对检测到的信 号的量进行标准化以提高测定精确度。可通过例如标签来产生信号。在一个实施方式中， hFXIII-耦合的固体支持物允许对检测到的标签的量进行标准化以校正所述方法中所用试 剂的储存期间可检测标签的量的损失。
[0060] 在一些实施方式中，hFXIII-耦合的固体支持物允许检测无效测定，例如，通过当 测定信号落入预定极限以下时进行检测来进行所述检测。例如，可使用hFXIII对各样品的 信号进行标准化，并且将经标准化的信号与期望的对照值相比较。如果经标准化的样品信 号太低，则测定结果可能会由于基质影响或其他处理误差而降低，因而结果可被标记为无 效。
[0061] 可在用于分析生物样品是否存在一种或多种分析物的方法中使用与固体支持物 耦合的标准化因子，这些分析物的水平指示对象中的疾病状态。在一些实施方式中，一种或 多种分析物包括一组分析物。本发明的分析物包括在来自对象（包括但不限于人对象）的 生物样品中存在的抗原和抗体。在一些实施方式中，样品中分析物的存在、缺失或水平指示 对象患有疾病或其它病理状况，或处于发展疾病或其他病理状况的风险中。例如，在一些实 施方式中，分析物表示对象被病毒感染，如逆转录病毒。因此，在一些实施方式中，分析物表 示对象被人免疫缺陷病毒（HIV)、丙型肝炎病毒（HCV)或单纯疱瘆病毒（HSV)感染。在一个 实施方式中，分析物表示患者被HIV感染。指示人对象的HIV感染的分析物包括HIV抗原， 如P24抗原、针对HIV-1 (组M、0、N和P)的抗体，和针对HIV-2 (包括多种亚型）的抗体。
[0062] 在该方法的一些实施方式中，生物样品与其上固定有针对组中各分析物的结合成 员的多种固体支持物孵育。本发明的结合成员包括能够特异性结合至生物样品中分析物 的抗原和抗体。例如，能够特异性结合至指示人对象的HIV感染的分析物的结合成员包括 抗-P24抗体、用于检测HIV-1的gpl60蛋白、用于检测HIV-1/M的39PEN、用于检测HIV-1/ 0的AFR、用于检测HIV-2的SPOH、用于检测HIV-2的gp36肽和用于检测HIV-2的SV2V。 39PFN和AFR分别是模拟HIV-1组M和0的免疫优势区的肽。SPOH和SV2V是模拟HIV-2 的免疫优势区的肽。在下表（表1)中提供了所述肽的序列。
[0063] 表1:结合HIV抗体的肽的序列。
[0064]

【权利要求】
1. 一种对结果进行标准化的方法，所述方法包括： (a) 将生物样品与其上固定有结合成员的一种或多种固体支持物在促进分析物与所述 结合成员结合的条件下接触，所述结合成员特异性结合所述生物样品中的所述分析物，所 述固体支持物被分成能通过区分参数互相区分的亚群，固定于各亚群上的所述结合成员与 所述样品中的一种分析物结合； (b) 将所述生物样品与其上固定有标准化因子的固体支持物接触，所述固体支持物能 与其上固定有结合成员的固体支持物区分； (c) 将所述固体支持物与对所述标准化因子具有结合亲和性的结合试剂和对各所述分 析物具有结合亲和性的结合试剂在促进所述结合试剂与所述固体支持物上的所述分析物 结合的条件下接触； (d) 对与所述固体支持物结合的所述结合试剂进行定量，并且将结合试剂的量与所述 区分参数相关联以得到单独代表所述分析物水平和所述标准化因子水平的值，并且 (e) 将代表所述分析物水平的值对代表所述标准化因子的值进行标准化，从而校正在 所述方法实施期间样品处理或生物基质影响的变化。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述标准化因子并不与来自所述生物样品 的分析物结合。
3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述标准化因子是hFXIII。
4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述结合试剂与标签偶联。
5. 如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述标签选自下组：生物素、荧光部分、藻红 蛋白和马辣根过氧化物酶（HRP)。
6. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述定量步骤还包括将所述固体支持物与 经标记的结合部分接触，并且检测与所述固体支持物结合的标签的量。
7. 如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述经标记的结合部分包括链霉亲和素或 亲和素。
8. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述固体支持物选自珠、磁珠、膜、玻璃表面 和塑料表面。
9. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括将所述样品与其上固定有 针对hFXIII的抗体的固体支持物孵育。
10. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括将所述样品与其上固定有 四甲基若丹明尸胺（TMRC)的固体支持物孵育。
11. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物样品包含血浆或血清。
12. -种制备包含标准化因子的固体支持物的方法，所述方法包括： 将标准化因子与所述固体支持物连接。
13. 如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述标准化因子与所述固体支持物共价 连接。
14. 如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述标准化因子与所述固体支持物非共 价连接。
15. -种对测定结果进行标准化的方法，所述方法包括： (a)将生物样品与其上固定有结合成员的一种或多种固体支持物孵育，所述结合成员 特异性结合所述生物样品中的分析物，所述固体支持物被分成能通过区分参数互相区分的 亚群，固定于各亚群上的所述结合成员仅与所述样品中的一种分析物结合，并且在促进所 述样品中可能存在的所述分析物与固定于固体支持物的所述结合成员的结合的条件下进 行所述孵育； (b)将所述生物样品与其上固定有标准化因子的固体支持物孵育，所述固体支持物能 与其上固定有结合成员的所述固体支持物区分； (C)从所述样品回收所述固体支持物并将由此回收的所述固体支持物与具有对标准化 因子的结合亲和性的生物素化的偶联物和对各所述分析物具有结合亲和性的生物素化的 偶联物在促进所述生物素化的偶联物与各所述固体支持物上的所述标准化因子和所述分 析物结合的条件下孵育； (d) 回收来自步骤（C)的所述固体支持物并且将由此回收的所述固体支持物与选自链 霉亲和素和亲和素的经标记的结合成员孵育；和 (e) 回收来自步骤（d)的所述固体支持物并且检测与由此回收的所述固体支持物结合 的标签，将由此检测到的所述标签与所述区分参数相关联以得到单独代表所述分析物水平 和所述标准化因子水平的值，并且将代表所述分析物水平的值对代表所述标准化因子的值 进行标准化，从而校正在所述方法实施期间样品处理或生物基质影响的变化。
16. 如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述分析物选自HIV p24抗原、针对HIV-1 的抗体、针对HIV-2的抗体、针对HIV-1组0的抗体和针对HIV-1组M的抗体。
17. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述结合成员选自与以下物质结合的肽： 针对HIV-1、HIV-2和HIV-0的抗体，以及结合HIV肽的抗体。
18. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述结合成员选自抗-p24抗体、gpl60、 SPOH、AFR和针对人因子XIII的抗体。
19. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物素化的偶联物选自39-PFN、SV2V、 AFR、SPOH和针对人因子XIII的抗体。
20. -种用于确定对象是否感染HIV或受感染的对象的感染阶段的试剂盒，所述试剂 盒包含固定于固体支持物上的标准化因子，和多种结合成员，各结合成员固定于固体支持 物上，所述多种结合成员包括： (i) 抗-p24抗体， (ii) HIV-l 包膜蛋白 gp-160， (iii) HIV-2SPOH，和 (iv) HIV-O AFR ； 所述固体支持物还具有经选择的区分参数，从而能够区分所有具有所述多种结合成员 中的任一结合成员的所述支持物与所有具有所述多种结合成员之外结合成员的所述支持 物。
21. 如权利要求20所述的试剂盒，其特征在于，所述标准化因子并不与来自所述生物 样品的分析物结合。
22. 如权利要求20所述的试剂盒，其特征在于，所述标准化因子是hFXIII。
23. 如权利要求20所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含固定于固体支持物 上的针对人因子XIII的抗体。
24. 如权利要求20所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含固定于固体支持物 上的TMRC。
25. 如权利要求20所述的试剂盒，其特征在于，所述固体支持物是珠或磁珠。
【文档编号】G01N33/543GK104487846SQ201380035093
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2013年6月20日 优先权日:2012年6月22日
【发明者】D·金, W·F·林克, 罗萨里奥 R·德尔, M·里奥斯 申请人:生物辐射实验室股份有限公司