肝癌术后复发预测标志物Capn4检测方法及试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了肝癌术后复发预测标志物Capn4检测方法。该方法将capn4抗体放入试剂盒的反应孔中包埋过夜，加入患者样品和标准品蛋白上清各四孔，加入包被缓冲液，混合1h，加入pan-capn4抗体和非特异性抗原，孵育洗涤后，加入辣根过氧化物酶标记抗体，然后加入底物，终止反应后读取实验各反应孔OD值，用标准品测定值绘制标准曲线，读出相应的数值，取平均值，患者样品数值超过标准品组1.5倍的判断为阳性。采用该方法兼顾了高通量和检测个体及时性，定量检测，可机器检测读取数值减少主观性带来的误差。本发明还公开了该方法应用的试剂盒，试剂盒包括矩阵排列的96个反应孔，每个反应孔中放置有capn4抗体。
【专利说明】肝癌术后复发预测标志物Capn4检测方法及试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种肝癌术后复发预测标志物Capn4检测方法，还涉及该检测方法应用到的试剂盒。
【背景技术】
[0002]肿瘤标志物通常是指肿瘤组织自身特有的可反映肿瘤存在、复发的物质，可在肿瘤患者的组织标本、体液中检测。现在已发现的肿瘤标志物包括肿瘤特异性抗原、酶类、癌基因及抑癌基因及其产物等。理想的标志物应该具备:肿瘤细胞所特有，与肿瘤的分期及预后相关，采用高灵敏的方法可定性或定量地检测。完全符合的肿瘤标志物至今未能发现。
[0003]原发性肝癌是居中国第二位的恶性肿瘤，每年全世界新发肝癌的一半以上发生在我国。肝癌病人的预后非常差，手术切除被认为是根治肝癌的最好手段，但很多肝癌患者多伴有严重的门脉高压和肝炎肝硬化，由于肝脏代偿功能丧失而失去了手术机会，手术病例中术后总体5年生存率只有62.9%，大肝癌的术后5年生存率只有34.6%。肝癌如合并血管侵犯，包膜侵犯和肝内外的侵犯，预后就更差。肝癌术后复发和转移仍是引起患者死亡和影响预后的重要原因之一，肿瘤大小、血管侵犯、AFP等目前常用的肿瘤的生物学特征指标难以准确预测肝癌术后转移复发，这将不利于更好地把握肝移植适应症和术后个体化治疗方案的制定。
[0004]从肿瘤生物学角度看，转移是一个复杂的、多步骤的、与宿主相互作用的连续过程，包括癌细胞从原发灶脱落、侵袭周围组织、进入循环系统、逃避免疫监视、血管形成及在远隔器官形成转移灶等，其中肿瘤细胞的侵袭运动和迁移能力是实现远处转移的关键。
[0005]组织芯片得益于基因芯片技术的发展和延伸，近年来成为芯片家族的新成员。1998年Kononen等首次成功运用组织芯片技术对乳腺癌组织中6种基因的表达情况进行了研究，证实了该技术的实用价值并宣告组织芯片概念的诞生。在短短几年时间里，组织芯片技术飞速发展，改变了传统病理学的命运，以其高通量、快速省时、低误差、用途广等优点广泛渗透到基础研究、临床研究、应用研究等科技领域。组织芯片技术为肿瘤标记物的大规模临床筛选和验证提供了便利。
[0006]我们之前研究结果选取了其中之一 Capn4进行了体内外功能验证，发现其表达与肝癌的侵袭运动能力成正相关，我们利用组织芯片结合免疫组织化学的技术对此进行了初步的研究，结果提示其表达也能够用来进行临床愈后的判断。
[0007]组织芯片及免疫组织化学方法
1.组织芯片制作
1.1临床石蜡标本
根据所选定病例的手术切除标本病理号将其相应的石蜡包埋标本取出，包括 肝脏肿瘤组织和对应的癌旁组织。每个病例的病理标本HE染色切片均经过 高年资病理科医生核对。
[0008]1.2组织芯片制作 1.2.1按照实验目的设计组织芯片阵列排列方式。
[0009]1.2.2制备合适的空白受体蜡块。
[0010]1.2.3使用直径1.0 mm的组织穿刺针取出石蜡标本的组织芯，并有规律的排列 在空白受体蜡块上制备成组织阵列块。通常每个石蜡标本的同一种组织
各取2个组织芯作为复点，以防止在进行实验时由于脱点而造成实验数 据的丢失。
[0011]1.2.4组织阵列块在52°C恒温烤箱中加热融合，使组织芯与受体蜡块紧密相连。
[0012]1.2.5对组织阵列块进行修整，直至80%的组织芯完全曝露。
[0013]1.2.6对组织阵列块进行4 μ m的常规切片，裱于10%多聚赖氨酸处理的载玻片 上制成组织芯片。
[0014]1.2.7组织芯片于60°C烤片16个小时。
[0015]1.2.8组织芯片按编号每隔10张抽取一张作HE染色，镜检判断组织芯片上的样 本点完整程度。
[0016]2.组织芯片免疫组织化学方法
2.1所有芯片染色均在相同条件下进行，每批染色均设阳性对照、空白对照。阳性对照用已知染色阳性的肝癌组织进行；空白对照用相当于一抗浓度的血清代替一抗孵育组织切片。
[0017]2.2白片经二甲苯脱蜡10minX2次，99.5%、95%和75%梯度酒精水化至蒸馏水后 进行抗原修复，放入盛有0.01 mM枸橼酸盐缓冲液(pH 6.0)的容器中。
[0018]2.3高压锅加热煮沸，盖上锅盖，扣上压力阀，继续加热至喷气，从喷气开始计 时，1 2 min后，闻压锅尚开电炉,室温冷却。
[0019]2.4切片先用蒸馏水冲洗两次，经3% H202孵育10 min去除内源性过氧化物酶影响，非特异染色经10%正常山羊血清封闭10 min去除，再用PBS冲洗备染色。
[0020]2.5加入1:100小鼠抗人Capn4抗体于4°C过夜，PBS冲洗三次。
[0021]2.6加HRP标记的羊抗小鼠IgG室温孵育I h，PBS冲洗三次。
[0022]2.7 DAB显色:滴加新鲜配制DAB显色液，显微镜下观察5?10分钟，在显色最佳时用PBS冲洗，中止显色。
[0023]2.8苏木素复染细胞核，然后水洗、蓝化、脱水、中性树胶封片。
[0024]3.免疫组化结果评分标准
阳性强度评分为:无着色O分、浅黄色I分、棕黄色2分、棕黑色3分。阳 性细胞占所有细胞的比例评分为:< 5% O分、5%?25% I分、26%?50% 2分、
51%?75% 3分、>75% 4分。根据两项乘积作为最后评分结果，分为一、土、+、
+ +四级，一、土定为阴性，+、+ +为阳性。
[0025]之前方法虽然是大通量，但是需要先取到所有的病人的临床病理标本，才能进行检测，其次，检测是半定量的检测，并且，判断应该是由两位高年资的病理科医生做出，主观性强，容易出错。
【发明内容】
[0026]本发明的目的是针对现有技术存在的不足，提供一种肝癌术后复发预测标志物Capn4检测方法，手段简单方便，兼顾了高通量和检测个体及时性，定量检测，可机器检测读取数值，减少主观性带来的误差；本发明还提供该检测方法应用到的试剂盒。
[0027]为实现上述目的，本发明肝癌术后复发预测标志物Capn4检测方法采用的技术方案是:一种肝癌术后复发预测标志物Capn4检测方法，capn4抗体放入试剂盒的反应孔中包埋过夜，加入患者样品和标准品蛋白上清各四孔，加入包被缓冲液，混合lh，加入pan-capn4抗体和非特异性抗原，孵育洗涤后，加入辣根过氧化物酶标记抗体，然后加入底物，终止反应后读取实验各反应孔OD值，用标准品测定值绘制标准曲线，读出相应的数值，取平均值，患者样品数值超过标准品组1.5倍的判断为阳性。
[0028]所述的肝癌术后复发预测标志物Capn4检测方法包括如下步骤:
包被:用0.05M PH9柚碳酸盐包被缓冲液将Capn4稀释至蛋白质含量为I?10 μ g /ml，在每个反应孔中中加0.1ml，4°C过夜，次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗涤，洗3次，每次3分钟；
加样:加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37°C孵育I小时,然后用洗涤缓冲液洗涤，洗3次，每次3分钟；
加酶标抗体:于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体0.1ml ;37°C孵育0.5?I小时，然后用洗涤缓冲液洗涤，洗3次，每次3分钟；
加底物液显色:于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml, 370C 10?30分
钟；
终止反应:于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml ；
结果判定:可于白色背景上，直接用肉眼观察结果；反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，测OD值:在ELISA检测仪上，于450nm处，若以ABTS显色，则410nm处，以空白对照孔调零后测各反应孔的OD值，若大于规定的标准品对照OD值的1.5倍，即为阳性。
[0029]所述的洗涤缓冲液为PBST，0.lmol/L，ρΗ=7.2-7.4。
[0030]加入新鲜稀释的酶标抗体根据待测定蛋白抗原的浓度滴定稀释。
[0031]该肝癌术后复发预测标志物Capn4检测方法所用的试剂盒，包括96个反应孔，96个反应孔矩阵排列，每个反应孔中放置有capn4抗体。
[0032]本发明与现有技术相比，具有以下优点:
该检测方法相对于现有技术的组织芯片及免疫组织化学方法简单的多，便于实施，检测结果比较可靠；兼顾了高通量和检测个体及时性，定量检测，可机器检测读取数值减少主观性带来的误差。
【专利附图】
【附图说明】
[0033]图1为检测试剂盒的结构示意图。
[0034]图2为图1的侧视图。
【具体实施方式】
[0035]下面结合附图和【具体实施方式】，进一步阐明本发明，应理解这些实施方式仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。
[0036]如图1所示，公开了一种肝癌术后复发预测标志物检测试剂盒，包括96个反应孔I，96个反应孔矩阵排列,每个反应孔中放置有capn4抗体2。
[0037]肝癌术后复发预测标志物Capn4检测方法，capn4抗体放入试剂盒的96个反应孔中包埋过夜，加入患者样品和标准品蛋白上清各四孔，加入包被缓冲液，混合lh，加入pan-capn4抗体和非特异性抗原，孵育洗涤后，加入辣根过氧化物酶标记抗体，然后加入底物，终止反应后读取实验各反应孔OD值，用标准品测定值绘制标准曲线，读出相应的数值，取平均值，患者样品数值超过标准品组1.5倍的判断为阳性。具体步骤包括:
包被:用0.05M PH9柚碳酸盐包被缓冲液将Capn4稀释至蛋白质含量为I?10 μ g /ml，在每个反应孔中中加0.1ml，4°C过夜，次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗涤，洗3次，每次3分钟；
加样:加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37°C孵育I小时,然后用洗涤缓冲液洗涤，洗3次，每次3分钟；
加酶标抗体:于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体0.1ml (稀释的酶标抗体根据待测定蛋白抗原的浓度滴定稀释)；37°C孵育0.5?I小时，然后用洗涤缓冲液洗涤，洗3次，每次3分钟；
加底物液显色:于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml, 370C 10?30分
钟；
终止反应:于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml ；
结果判定:可于白色背景上，直接用肉眼观察结果；反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，测OD值:在ELISA检测仪上，于450nm处，若以ABTS显色，则410nm处，以空白对照孔调零后测各反应孔的OD值，若大于规定的标准品对照OD值的1.5倍，即为阳性。
[0038]所述的洗涤缓冲液为PBST，0.lmol/L，ρΗ=7.2-7.4。
【权利要求】
1.一种肝癌术后复发预测标志物Capn4检测方法，其特征在于:capn4抗体放入试剂盒的反应孔中包埋过夜，加入患者样品和标准品蛋白上清各四孔，加入包被缓冲液，混合lh，加入pan- capn4抗体和非特异性抗原，孵育洗涤后，加入辣根过氧化物酶标记抗体，然后加入底物，终止反应后读取实验各反应孔OD值，用标准品测定值绘制标准曲线，读出相应的数值，取平均值，患者样品数值超过标准品组1.5倍的判断为阳性。
2.根据权利要求1所述的肝癌术后复发预测标志物Capn4检测方法，其特征在于，包括如下步骤: 包被:用0.05M PH9柚碳酸盐包被缓冲液将Capn4稀释至蛋白质含量为I?10 μ g /ml，在每个反应孔中中加0.lml，4°C过夜，次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗涤，洗3次，每次3分钟； 加样:加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37°C孵育I小时,然后用洗涤缓冲液洗涤，洗3次，每次3分钟； 加酶标抗体:于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体0.1ml ;37°C孵育0.5?I小时，然后用洗涤缓冲液洗涤，洗3次，每次3分钟； 加底物液显色:于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml, 370C 10?30分钟； 终止反应:于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml ； 结果判定:可于白色背景上，直接用肉眼观察结果；反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，测OD值:在ELISA检测仪上，于450nm处，若以ABTS显色，则410nm处，以空白对照孔调零后测各反应孔的OD值，若大于规定的标准品对照OD值的1.5倍，即为阳性。
3.根据权利要求2所述的肝癌术后复发预测标志物Capn4检测方法，其特征在于，所述的洗涤缓冲液为 PBST，0.lmol/L，ρΗ=7.2-7.4。
4.根据权利要求2所述的肝癌术后复发预测标志物Capn4检测方法，其特征在于，加入新鲜稀释的酶标抗体根据待测定蛋白抗原的浓度滴定稀释。
5.如权利要求1肝癌术后复发预测标志物Capn4检测方法所用的试剂盒，其特征在于:包括96个反应孔,96个反应孔矩阵排列,每个反应孔中放置有capn4抗体。
【文档编号】G01N33/574GK103743903SQ201410007478
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2014年1月8日 优先权日:2014年1月8日
【发明者】柏斗胜, 蒋国庆, 金圣杰, 张弛 申请人:江苏省苏北人民医院