一种谷胱甘肽转移酶抗原生物传感器的制备方法及应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种谷胱甘肽转移酶抗原生物传感器的制备方法及应用，属于新型纳米功能材料与生物传感【技术领域】。具体是基于磺酸化石墨烯（HSO3-GS）和双金属纳米多孔合金材料铂铁（PtFe），制备的检测谷胱甘肽转移酶的夹心型电化学免疫传感器，用于检测血清中的谷胱甘肽转移酶。其特征在于：（1）磺酸化石墨烯的制备；（2）双金属多孔材料铂铁—辣根过氧化物酶—谷胱甘肽转移酶二抗复合物的制备；（3）电化学免疫传感器的制备。PtFe对H2O2具有很强的催化能力，同时利于固定更多的二抗、保持物质生物活性；将电子媒介体天青A加入底液中，避免了修饰到电极上后的泄漏问题，制备的传感器灵敏度高、特异性好、易于操作、检测限低。
【专利说明】一种谷胱甘肽转移酶抗原生物传感器的制备方法及应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种谷胱甘肽转移酶抗原生物传感器的制备方法及应用。具体是基于磺酸化石墨烯(HSO3-GS)和双金属纳米多孔合金材料钼铁(PtFe)，制备谷胱甘肽转移酶的夹心型电化学免疫传感器，用于检测血清中的谷胱甘肽转移酶。属于新型纳米功能材料与生物传感【技术领域】。
【背景技术】
[0002]谷胱甘肽转移酶(GST)主要是在肝脏中参与生物转化第二相反应的一种生物酶，它既能在组织中又可在血清中检测到，而其它许多肿瘤标志物只能在组织中检测到，而且检测血清中的GST对机体无侵袭性，可以大大方便临床的应用，因此谷胱甘肽转移酶免疫传感器的研制具有重要的意义。
[0003]本发明基于合成纳米材料磺酸化石墨烯(HSO3-GS)以及双金属纳米多孔材料钼铁(PtFe)制备谷胱甘肽转移酶夹心型免疫传感器的研究，突出了电极修饰材料对生物传感器增大响应、提高检测灵敏度、增大线性范围等作用。HSO3-GS具有比表面积大、能加强电子传导等优势，利用化学键合作用可直接与谷胱甘肽转移酶一抗联接，无需采用传统交联剂戊二醛固定化。采用PtFe有利于固定更多的二抗、保持物质生物活性，并且对H2O2具有很强的催化能力。两者利用简单滴涂法修饰于玻碳电极上可增强电极在反应过程中的电化学响应。将电子媒介体天青A加入底液中，避免了修饰到电极上后的泄漏问题。
[0004]本发明制得的生物传感器的响应电流与GST浓度在0.01?12 ng/mL范围内保持良好的线性关系，检测限为2.1 pg/mL。
[0005]本发明利用免疫反应的高特异性，结合HSO3-GS和PtFe，制备了 一种谷胱甘肽转移酶夹心型免疫传感器。
[0006]本发明具有灵敏度高、特异性好、检测成本低、能快速检测谷胱甘肽转移酶等优势，且本发明制备过程简单，操作过程简便，有效克服了目前谷胱甘肽转移酶检测方法的不足。
【发明内容】
[0007]本发明的目的之一在于避免传统检测方法的仪器设备复杂、操作过程繁琐、检测人员要求高等缺点，提供了一种灵敏度高、特异性强、重现性好、操作简便的快速检测谷胱甘肽转移酶的电化学免疫传感器的制备方法。
[0008]本发明的目的之二是将该电化学免疫传感器应用于谷胱甘肽转移酶的检测。
[0009]为了实现上述目的，本发明是通过以下措施来实现的。
[0010]一种谷胱甘肽转移酶抗原生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤:
(I)PtFe的制备
将PtFeAl合金片放到装有0.5?1.0 mol.T1NaOH溶液的小烧杯中，置于恒温水浴中，40?50°C条件下，放置24?48 h，将得到的产物用二次水反复洗，室温下晾干，即制备出所需的PtFe。
[0011](2) PtFe/辣根过氧化物酶/谷胱甘肽转移酶二抗复合物(PtFe/HRP/Ab2)制备 将装有PtFe悬浮液超声，移取PtFe悬浮液、HRP溶液和Ab2溶液于一离心管中，体积比
为PtFe: HRP: Ab2 = 1: 0.5 ^ 2: 0.5 ^ 2进行混合，4°C条件下，进行振荡孵化，孵化12~24 h后，置于4 °C冰箱中保存待用。
[0012](3)电化学免疫传感器的制备
1)将直径4mm的玻碳电极依次用1.0,0.3和0.05 mm的三氧化二铝抛光粉抛光处理，乙醇超声清洗，再用超纯水冲洗干净，然后将电极置于5 mmol.L-1铁氰化钾溶液中，在一0.2~0.6 V电位下扫描，使峰电位差小于90 mV ；
2)将壳聚糖分散的HSO3-GS修饰于玻碳电极表面,室温干燥；
3)将谷胱甘肽转移酶一抗(Ab1)滴涂到步骤2)HS03-GS修饰的电极表面，置于4°C湿润条件下晾干； 4)将浓度为100Pg.ml/1牛血清白蛋白滴涂到步骤3)41^修饰的电极表面,4°C下湿润条件下晾干；
5)将GST滴涂在步骤4)牛血清白蛋白修饰的电极表面，4°C下湿润条件下晾干；
6)将PtFe/HRP/Ab2滴涂在步骤5)GST修饰的电极表面，4°C下湿润条件下晾干，电化学免疫传感器制备完成。
[0013]所述HSO3-GS的浓度为0.5~2.5 mg.mL—1，所述PtFe悬浮液的浓度为10mg.ml/1,所述HRP的浓度为1.0 mg.ml/1,所述Ab2的浓度为1.0 mg.mL'
[0014](4)电化学免疫传感器的应用 用于谷胱甘肽转移酶的检测，步骤如下:
1)采用0.10 mo I.ml/1, pH = 7.4的磷酸盐缓冲溶液,配制在0.01~12 ng.ml/1范围内不同浓度的GST溶液，将6 μ L不同浓度的GST溶液分别滴涂至上述步骤4)牛血清白蛋白修饰的电极表面，晾干后，按照上述步骤6)修饰电极，连接至电化学工作站中，分别将电极置于含有 2.0 ~3.0 mmol.L-1 天青 A 和 1.0 ~5.0 mmol.L-1 H2O2 的 ρΗ=7.4 的 PBS缓冲溶液中测定其电流变化；
2)根据所得电流差值与GST浓度呈线性关系，绘制工作曲线；
3)依据工作曲线的绘制方法进行样品中GST的检测，检测结果从工作曲线中查得。
[0015]本发明的有益成果
(I)谷胱甘肽转移酶抗原生物传感器，HSO3-GS引入到谷胱甘肽转移酶抗原电化学免疫传感器的制备当中，利用HSO3-GS良好的电子传递能力，显著改善了电极的性能。
[0016](2)将PtFe与肿瘤标志物二抗直接孵化，利用钼铁优异的生物相容性和高的催化性能，显著提高了电化学免疫传感器的重现性和稳定性。
[0017](3) PtFe与辣根过氧化物酶复合标记二抗，具有对信号的协同增敏作用。
[0018](4)本发明所制备的电化学免疫传感器，操作简单，检测速度快，可在短时间内实现批量样品的测定。
【具体实施方式】
[0019]实施例1 PtFe的制备将PtFeAl合金片放到装有0.5 mo I.T1NaOH溶液的小烧杯中，置于恒温水浴中，40 °C条件下，放置24 h，将得到的产物用二次水反复洗涤，室温下晾干，即制备出所需的PtFe。
[0020]实施例2 PtFe的制备
将PtFeAl合金片放到装有1.0 mo 1-L^1NaOH溶液的小烧杯中，置于恒温水浴中，50°C条件下，放置48 h，将得到的产物用二次水反复洗涤，室温下晾干，即制备出所需的PtFe。
[0021]实施例3 PtFe的制备
将PtFeAl合金片放到装有0.7 mo 1-L^1NaOH溶液的小烧杯中，置于恒温水浴中，45 V条件下，放置35 h，将得到的产物用二次水反复洗涤，室温下晾干，即制备出所需的PtFe。
[0022]实施例4 PtFe/HRP/Ab2 制备
将装有PtFe悬浮液超声，移取PtFe悬浮液、HRP溶液和Ab2溶液于一离心管中，体积比为PtFe: HRP: Ab2 = 1: 0.5: 0.5进行混合，4°C条件下，进行振荡孵化，孵化12 h后，置于4 °C冰箱中保存待用。
[0023]实施例5 PtFe/HRP/Ab2 制备
将装有PtFe悬浮液超声，移取PtFe悬浮液、HRP溶液和Ab2溶液于一离心管中，体积比为PtFe: HRP: Ab2 = 1:1:1进行混合，4°C条件下，进行振荡孵化，孵化24h后，置于4 °C冰箱中保存待用。
[0024]实施例6 PtFe/HRP/Ab2 制备
将装有PtFe悬浮液超声，移取PtFe悬浮液、HRP溶液和Ab2溶液于一离心管中，体积比为PtFe: HRP: Ab2 = 1: 2: 2进行混合，4°C条件下，进行振荡孵化，孵化18h后，置于4 °C冰箱中保存待用。
[0025]实施例7电化学免疫传感器的制备
(1)将直径4mm的玻碳电极依次用1.0、0.3和0.05 mm的三氧化二铝抛光粉抛光处理，乙醇超声清洗，再用超纯水冲洗干净，然后将电极置于5 mmol.I/1铁氰化钾溶液中，在一0.2~0.6 V电位下扫描，使峰电位差小于90 mV ；
(2)将壳聚糖分散的HSO3-GS修饰于玻碳电极表面,室温干燥；
(3)将谷胱甘肽转移酶一抗(Ab1)滴涂到步骤(2)HS03-GS修饰的电极表面，置于4°C湿润条件下晾干；
(4)将浓度为100Kg 牛血清白蛋白滴涂到步骤(S)Ab1修饰的电极表面，4°C下湿润条件下晾干；
(5)将GST滴涂在步骤(4)牛血清白蛋白修饰的电极表面，4°C下湿润条件下晾干；
(6)将PtFe/HRP/Ab2滴涂在步骤(5)GST修饰的电极表面，4°C下湿润条件下晾干，电化学免疫传感器制备完成。
[0026]实施例8电化学免疫传感器的应用 用于谷胱甘肽转移 酶的检测，步骤如下:
(1)采用0.10 mo I.ml/1, pH = 7.4的磷酸盐缓冲溶液,配制在0.01 ng.ml/1范围内不同浓度的GST溶液，将6 μ L不同浓度的GST溶液分别滴涂至实施例7中步骤(4)牛血清白蛋白修饰的电极表面，晾干后，按照实施例7中步骤(6)修饰电极，连接至电化学工作站中，分别将电极置于含有2.0 mmol.L-1天青A和1.0 mmol.L-1 H2O2的pH=7.4的PBS缓冲溶液中测定其电流变化；(2)根据所得电流差值与GST浓度呈线性关系，绘制工作曲线；
(3)依据工作曲线的绘制方法进行样品中GST的检测，检测结果从工作曲线中查得。
[0027]实施例9电化学免疫传感器的应用 用于谷胱甘肽转移酶的检测，步骤如下:
(1)采用0.10 mo I.ml/1, pH = 7.4的磷酸盐缓冲溶液,配制在12 ng.ml/1范围内不同浓度的GST溶液，将6 μ L不同浓度的GST溶液分别滴涂至实施例7中步骤(4)牛血清白蛋白修饰的电极表面，晾干后，按照实施例7中步骤(6)修饰电极，连接至电化学工作站中，分别将电极置于含有3.0 mmol.L-1天青A和5.0 mmol.L-1 H2O2的pH=7.4的PBS缓冲溶液中测定其电流变化；
(2)根据所得电流差值与GST浓度呈线性关系，绘制工作曲线；
(3)依据工作曲线的绘制方法进行样品中GST的检测，检测结果从工作曲线中查得。
[0028]实施例10电化学免疫传感器的应用 用于谷胱甘肽转移酶的检测，步骤如下:
(1)采用0.10 mo I.ml/1, pH = 7.4的磷酸盐缓冲溶液,配制在5.0 ng.ml/1范围内不同浓度的GST溶液，将6 μ L不同浓度的GST溶液分别滴涂至实施例7中步骤(4)牛血清白蛋白修饰的电极表面，晾干后，按照实施例7中步骤(6)修饰电极，连接至电化学工作站中，分别将电极置于含有2.5 mmol.L-1天青A和3.0 mmol.L-1 H2O2的pH=7.4的PBS缓冲溶液中测定其电流变化；
(2)根据所得电流差值与GST浓度呈线性关系，绘制工作曲线；
(3)依据工作曲线的绘制方法进行样品中GST的检测，检测结果从工作曲线中查得。
【权利要求】
1.一种谷胱甘肽转移酶抗原生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)双金属纳米多孔材料钼铁(PtFe)的制备 将PtFeAl合金片放到装有0.5~1.0 mol.T1NaOH溶液的小烧杯中，置于恒温水浴中，40~50°C条件下，放置24~48 h，将得到的产物用二次水反复洗涤，室温下晾干，即制备出所需的PtFe ； (2)PtFe/辣根过氧化物酶/谷胱甘肽转移酶二抗复合物(PtFe/HRP/Ab2)制备 将PtFe悬浮液超声，移取悬浮液、HRP溶液和Ab2溶液于一离心管中，体积比为PtFe:HRP: Ab2 = 1: 0.5~2: 0.5~2进行混合，4°C条件下，进行振荡孵化，孵化12~24h后，置于4 1:冰箱中保存待用； (3)电化学免疫传感器的制备。
2.如权利要求1所述的一种谷胱甘肽转移酶抗原生物传感器的制备方法，其特征在于，所述的电化学免疫传感器的制备，步骤如下: (1)将直径4mm的玻碳电极依次用1.0、0.3和0.05 mm的三氧化二铝抛光粉抛光处理，乙醇超声清洗，再用超纯水冲洗干净，然后将电极置于5 mmol.1铁氰化钾溶液中，在一0.2~0.6 V电位下扫描，使峰电位差小于80 mV ； (2)将壳聚糖分散的HSO3-GS修饰于玻碳电极表面,室温干燥； (3)将谷胱甘肽转移酶一抗(Ab1)滴涂到步骤(2)HS03-GS修饰的电极表面，置于4°C湿润条件下晾干； (4)将浓度为100Kg 牛血清白蛋白滴涂到步骤(S)Ab1修饰的电极表面，4°C下湿润条件下晾干； (5)将谷胱甘肽转移酶抗原(GST)滴涂在步骤(4)牛血清白蛋白修饰的电极表面，4°C下湿润条件下晾干； (6)将PtFe/HRP/Ab2滴涂在步骤(5)GST修饰的电极表面，4°C下湿润条件下晾干，电化学免疫传感器制备完成。
3.如权利要求1所述的一种谷胱甘肽转移酶抗原生物传感器的制备方法，其特征在于，所述HSO3-GS的浓度为0.5~2.5 mg.πι?Λ所述PtFe悬浮液的浓度为10 mg.mL—1，所述HRP的浓度为1.0 mg.ml/1,所述Ab2的浓度为1.0 mg.mL'
4.如权利要求1~3之一所述的制备方法制备的传感器的检测方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)采用0.10 mol.ml/1, pH = 7.4的磷酸盐缓冲溶液,配制在0.01~12 ng.mL-1范围内不同浓度的GST溶液，将6 μ L不同浓度的GST溶液分别滴涂至权利要求2中步骤(4)牛血清白蛋白修饰的电极表面，晾干后，按照权利要求2中步骤(6)修饰电极，连接至电化学工作站中，分别将电极置于含有2.0~3.0 mmol1天青A和1.0~5.0 mmol1 H2O2的pH=7.4的PBS缓冲溶液中测定其电流变化； (2)根据所得电流差值与GST浓度呈线性关系，绘制工作曲线； (3)依据工作曲线的绘制方法进行样品中GST的检测，检测结果从工作曲线中查得。
【文档编号】G01N27/48GK103868971SQ201410036028
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2014年1月26日 优先权日:2014年1月26日
【发明者】魏琴, 李月云, 闫涛, 胡丽华, 张勇, 吴丹, 李贺, 魏东 申请人:济南大学