多聚化学发光标记试剂及其制备方法与应用的制作方法
【专利摘要】多聚化学发光标记试剂及其制备方法与应用，涉及化学发光标记物。所述多聚化学发光标记试剂的原料组成如下：化学发光标记物；多聚物骨架；配体、受体或官能团。所述多聚化学发光标记试剂的制备方法：1）多聚物骨架修饰；2）配体或受体修饰；3）配体-多聚物共轭体或受体-多聚物共轭体的合成；4）多聚化学发光标记试剂的合成。所述多聚化学发光标记试剂可广泛应用于医疗诊断、生物技术、生物医药、生命科学、食品安全、环保检测等领域。具体来说，多聚化学发光标记试剂的最普遍应用是免疫分析诊断，其次为新药研发中配体-受体之间相互作用分析，再次是核酸或基因检测。
【专利说明】多聚化学发光标记试剂及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及化学发光标记物，尤其是涉及多聚化学发光标记试剂及其制备方法。【背景技术】
[0002]化学发光是指在化学反应过程中产生可见光的一种现象，通常是指一些化合物在没有紫外光或可见光照射的情况下，通过吸收化学能，从基态激发至激发态，在退激时释放能量产生光子，实现化学能到光能装换，从而导致发光的现象。通过测量化学发光反应的光强度，可对痕量化合物的含量进行精准定量分析。近年来发展起来的化学发光免疫检测技术(chemiluminescent immunoassay, CLIA)是化学发光技术与免疫学方法相结合的产物，不但具有发光检测的高度灵敏性，而且还具有免疫分析的高度特异性。同时，化学发光免疫检测技术不仅检测快速、可实现高通量检测，而且避免传统的放射性标记试剂的使用，从而避免放射性危害，减少对环境的冲击。化学发光免疫检测技术的检测灵敏度是目前光学检测中最好的技术之一，最低检测限(LOD)可达10_21mol / L。
[0003]目前最广泛的化学发光检测技术可分为板式化学发光和管式化学发光。板式化学发光使用抗体包被的96孔或更多孔的多孔板，通过抗体-抗原的特异性作用把检测目标(抗原)从样品中提取出来，加入化学发光标记的抗体后形成“三明治(sandwich)”夹心层。根据化学发光标记种类的不同，板式化学发光既可是酶促化学发光，也可是非酶促化学发光。酶促化学发光技术使用酶标记，常用的酶有辣根过氧化物酶(horse radishperoxidase, HRP)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)、黄嘌呤氧化酶等。其最大特点是通过酶的催化作用放大发光信号，从而提高检测灵敏度。同时，发光过程中作为标记物的酶基本不被消耗，而反应体系中发光底物试剂充分过量，发光信号强而稳定，发光时间较长，可采用速率法测量。因此，酶促化学发光检测方式简单、成本较低、灵敏度高。非酶促化学发光技术也被称之为直接化学发光，使用吖唳酯(acridanium ester,AE)或异鲁米诺(如aminobutylethylisoluminol, ABEI),特点是不使用生物酶、可简化化学发光检测过程、降低试剂成本，但在其发光过程中作为标记物的发光剂会被消耗，导致发光信号持续时间较短。另外，由于发光剂被很快消耗，只能进行一次性测量。
[0004]管式化学发光是最近发展起来的一种新型化学发光检测技术，使用磁性或非磁性微粒作为包被载体。比起板式化学发光来说，管式化学发光有着不少优势，特别是使用磁性微粒的管式发光技术，在大型、全自动的诊断仪上有着广泛的应用。当然，管式化学发光也有其弱点，包括如何降低散射作用对检测灵敏度的影响、如何控制磁性微粒体积分布均匀、如何保证磁性微粒-抗体共轭体的质量、如何避免磁性微粒的聚合问题等。
[0005]国内目前普遍使用异鲁米诺(ABEI)作为直接化学发光标记，虽然异鲁米诺标记很稳定，但其发光效率不高。而相对于异鲁米诺来讲，吖啶酯则具有高得多的发光效率，是欧美国家所采用的直接化学发光标记物。吖啶酯标记好的蛋白或抗体曾遇到过标记物稳定性的问题，但可通过使用合适的缓冲液来解决；这些新技术进一步扩大了吖啶酯在生命科学、特别是生物诊断领域的应用。吖啶酯虽有较异鲁米诺更好的化学发光特性，但在超低浓度检测时也会遇到灵敏度不够的问题。正是因为这种需求促使我们寻求更好的直接化学发光标记技术。
[0006]利用多聚效应的概念来提高灵敏度或药效是最近发展起来的一种新型生命科学技术，典型例子包括多价药物(Polyvalent drug) (M.Mammen, S.-K.Choi, andG.M.Whitesides Angew.Chem.1nt.Ed.1998，37，2754-2794)和多聚辣根过氧化酶(PolyHRP)(C.A.Marquette and L.J.Blum Bioanalysis, 2009, I(7), 1259-1269 ；S.DhawanExpert Rev Mol Diagn6 (5)，749，2006)。前者在抗癌药物、抗病毒药物及其它药物开发上别具一格，后者在提高酶免检测灵敏度技术上应用广泛。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于针对直接化学发光生化分析(特别是酶联免疫分析)检测技术中面对的灵敏度问题，提供一种可提高发光效率、增强检测灵敏度的多聚化学发光标记试剂及其制备方法。
[0008]所述多聚化学发光标记试剂的原料组成如下:
[0009]化学发光标记物(chemiluminescentlabel)；
[0010]多聚物骨架(polymericbackbone)；
[0011]配体(ligand)、受体(receptor)或官能团(functionalgroup)。
[0012]所述化学发光标记物为任何通过吸收化学能而发光的标记物，可选自:
[0013]a) Π丫唳酮系列如Π丫唳酯(acridinium ester, AE)及其衍生物,包括磺基化的Π丫唳酯(sulfonated acridinium ester, SAE), APS-5(9-(4-chlorophenylthiophosphoryl-oxymethylidene)-10-methylacridan)及其衍生物等；
[0014]b)酰肼系列,如鲁米诺(111111；[1101)、异鲁米诺(180111111；[1101)、鲁米诺相关的酰肼或环酸餅(cyclic hydrazides)；
[0015]c)苯多酌系列，如邻苯三酌'(pyrogallol)、间苯三酌'(phioroglucinol)'间苯二酿(rescorcinol)；
[0016]d)金刚烷(dioxetane)系列，如3_(2_螺旋金刚烷_4_甲氧基_4_甲基_4-(3_磷酸氧基)-苯基-1，2-二氧乙烷(AMPPD)；
[0017]e)其它系列，如过氧草酸酯、光泽精、洛粉碱等。
[0018]f )能量转移类发光标记物，可选自能量转移类的鲁米诺衍生物(energy-transferluminol derivative),所述能量转移类的鲁米诺衍生物可选自鲁米诺-Π丫唳酮(luminol-acridone)共轭体；或鲁米诺-突光素(luminol-fIuorescein)共轭体；或鲁米诺-罗丹明(luminol-rhodamine)共轭体；其中，吖唳酮、突光素、罗丹明是能量受体(参见文献 J.Pharma&Biomed.Anal.12, 433-462，1994、Biotech Annual Rev.9, 199, 2003 及Methods in Enzymology, Vol.LVII409, 1978),其它能量受体可同样被采用。
[0019]所述多聚物骨架为:
[0020]I)含有多个供化学发光标记修饰的官能团的人造多聚物或天然多聚物，可选自葡聚糖(chitosan)、琼脂糖(agarose)、纤维素(cellulose)、聚乙烯亚胺(PEI,polyethyIeneimine)>聚丙烯酸及其衍生物、树状纳米微球(dendrimer)、聚赖氨酸(polylysine)、牛血清白蛋白(BSA，bovine serum albumin)、人血清白蛋白(HSA, humanserum albumin)或其它蛋白质、多肽(peptide)等。
[0021]2)特殊化学修饰的核酸。现代核酸化学技术已发展出很多有效的化学修饰来引入化学标记。举例来说，在碱基的非碱基配对位置上引入氨基以加上荧光标记是基因测序技术中常用技术。这些氨基同样可以用来标记吖啶酯或其它化学发光标记，从而产生以DNA为骨干的多聚吖啶酯。在核苷酸糖环或磷酸基上亦可通过化学修饰引入吖啶酯或异鲁米诺。特别值得指出的是树状DNA (branched DNA)是一类很好的多聚物骨架。
[0022]所述配体是相互间具有特异性作用配对中的一方，如抗原-抗体、配体-受体、DNA碱基配对或RNA碱基配对、底物-酶、配体-蛋白等。配体可选自生物配体(bioaffinityligand)包括生物素(biotin)、亚氨基生物素(2_iminobiotin)、唾液酸(sialic acid)、叶酸(folic acid)、凝集素(lectin)、伴刀豆凝集素 A (Concanavalin A，ConA)、|丐调素(Calmodulin)、肝素(heparin)、抗原(antigen)、精氨酸(arginine)、赖氨酸(Lysine)、谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、地高辛(digcxin)、透明质酸(Hyaluronicacid，HA)、苯硼酸(phenylboric acid)、明胶(gelatin)、憐酸腺苷(AMP，Adenosinemonophosphate)、二憐酸腺苷(ADP,Adenosine diphosphate)、三憐酸腺苷(ATP,Adenosinetriphosphate)、烟酸胺腺^^票呤二核苷酸(NAD，Nicotinamide adenine dinucleotide)、烟酉先胺腺11票呤二核苷酸憐酸(NADP，Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate)、苯甲脉(benzimidine )、汽巴隆蓝(Cibacron Blue)、普施安红(Procion Red)、DNA 片段、RNA 片段、荷尔蒙多肽、激素、荧光素(fluOToscein)等。
[0023]所述受体是相互间具有特异性作用配对中的另一方，可选自链霉亲和素(streptavidin)、抗生物素蛋白(avidin)、NutraAvidin、抗体(antibody)、G 蛋白偶联受体(GPCR)及其它细胞表面受体(cellular receptor)、生物酶、其它特殊蛋白等；其中亲和素或抗生物素蛋白及其衍生物与生物素之间的作用力是共价键之外最强的，因此被广泛应用；而抗体则是一类非常有用的受体，常用抗原-抗体配对包括荧光素-抗荧光素抗体、地高辛-抗地高辛抗体等。
[0024]所述官能团是可用来修饰抗体或DNA或其它生物分子的化学基团，通过它们可对这些生物分子进行标记，可选自醒基(aldehyde)、氨基(amine)、羧基(carboxyl)、巯基(thiol)、炔基(alkyne)、叠氮(azido)、氧氨(oxyamine)、肼(hydrazide)、α -卤代羧基(α -halocarboxyl)、异氰酸酯(isocyanate)、异硫氰酸酯(isothiocyanate)、N-羟基琥?白酯(NHS ester)、环氧化物(epoxide)、环氧乙焼(oxirane)、氮丙唳(aziridine)、马来酉先亚胺(maleimide)、乙烯砜(vinylsulfone)、娃醇基(silanol)、螯合剂(chelator)等；所述官能团(functional group)可进一步选自生物共轭反应配对中的一个:a) SFB (甲酉先基苯甲酸N-羟基玻?自酸亚胺酯，succinimidyl-4-formyl benzoate)或SANH (2，5_ 二氧批咯焼 _1_ 基 _6_(2_(丙-2-亚基)月井基)烟酸，succinamidyl6-hydrazinonicotinate acetone hydrazone);其中SANH更具吸引力，因为其配对可以是除SFB之外的其它醒基，而很多生物分子，如抗体，可通过氧化产生醒基；b) SMCC (4-(Maleimidomethyl)cyclohexanecarboxylic acid)或疏基；c)点击化学(Click Chemistry)配对；d)原生化学链接(Native Chemical Ligation) ;e)狄尔斯-阿尔德反应(Diels-Alder Reaction)等。
[0025]上述概念很容易从图1的综合性描述中理解认识。作为特殊例子，以抗体为配体的多聚化学发光标记试剂展示在图2。抗体在生物分析检测、疾病诊断(特别是免疫诊断)、生命科学、生物医药、食品安全，甚至环境保护检测等领域占有独特地位。因此，多聚化学发光标记的抗体具有重要的应用价值和广泛的应用范围。
[0026]这里要指出的是所述配体-受体系统可交互使用，也就说如果选择用配体修饰多聚吖啶酯，则可用受体修饰要标记的目标如蛋白质；反之亦然。此方法同样适用于共轭配对，也就说，如果共轭配对中的一个被用来修饰多聚吖啶酯，则另一个可用来修饰要标记的目标如蛋白质。而所述官能团则可利用其特殊反应性来标记目标。其中最广泛应用的基团包括N-轻基琥拍酯(NHS ester)、马来酰亚胺(maleimide)、羧基、氨基、齒素、羰基、肼等。
[0027]另一方面，如果用核酸(如人工化学合成的寡聚脱氧核糖核酸(ODN)、DNA或基因片段或RNA)做骨架，核酸序列本身就是配体，可通过经典的Watson-Crik碱基互补配对原则来检测目标基因或目标RNA。
[0028]值得指出的是,本发明的主要应用方向除化学发光免疫分析(chemiluminescentimmunoassay, CLIA)之外,还可用于核酸(包括DNA、RNA,特别是基因)检测、食品安全、环保检测、生物医药开发、生命科学等领域。
[0029]所述多聚化学发光标记试剂的制备方法，包括以下步骤:
[0030]I)多聚物骨架(polymeric backbone)修饰
[0031]根据多聚物不同的结构以及配体-多聚物共轭体不同的合成方法需要设计不同的多聚物骨架修饰方法；
[0032]若生物共轭化学是以SFB及SANH为基础的，则需要在多聚物上修饰SFB或SANH，以便与SANH或SFB修饰的配体进行配对反应从而制备配体-多聚物共轭物；
[0033]若其它生物共轭反应配对，包括SMCC-巯基、点击化学(Click Chemistry)配对、原生化学链接(Native Chemical Ligation)、狄尔斯-阿尔德反应(Diels-AlderReaction)等亦可应用于此；
[0034]若生物素(Biotin)引入到多聚物上，其方法包括NHS-活化的生物素与含氨基的多聚物形成酰胺键；
[0035]若酶链亲和素(Streptavidin),通过EDC稱合反应引入到多聚物上；
[0036]其它方法包括还原性席夫碱形成、α -卤素取代、芳香叠氮(aryl azide)光化学等(见 G.T.Hermanson “Bioconjugate Techniques” 2008)都可用于多聚物的修饰。
[0037]2)配体(ligand)或受体(receptor)修饰
[0038]根据配体的结构以及多聚物骨架上所含的官能团的不同需要设计不同的修饰方法，尤其需要据生物共轭反应配对来设计与多聚物互补的修饰化学，以上所述多聚物修饰化学也适用于配体的修饰，包括配体的NHS活化、生物共轭配对修饰、点击化学、原生化学链接、狄尔斯-阿尔德反应、席夫碱形成等，类似生物共轭化学技术可同样应用到受体(receptor)的修饰上。
[0039]3)配体-多聚物共轭体或受体-多聚物共轭体的合成
[0040]当多聚物、配体在被适当的基团修饰后(上述步骤I和2)，生物共轭反应可合成相应的配体-多聚物共轭体；
[0041]若配体是NHS-活化的，而多聚物含有氨基，则通过酰胺键的形成合成配体-多聚物共轭体；
[0042]若配体是SFB修饰的，而多聚物是SANH，则通过SFB-SANH间独特的席夫碱形成可合成配体-多聚物共轭体。在此领域的化学家可根据文献(G.T.HermansoniiBioconjugateTechniques” 2008)很容易设计多种合成方法。同时，此处的“配体”可理解为一个广泛的概念，即可指传统意义上的配体，也可指受体。
[0043]除配体及受体之外，一些特殊的官能团可直接用来标记目标分子，所述特殊的官能团包括醒基(aldehyde)、氨基(amine)、羧基(carboxyl)、巯基(thiol)、炔基(alkyne)、叠氮(azido)、氧氨(oxyamine)、肼(hydrazide)、α -卤代羧基(a -halocarboxyl )、异氰酸酯(isocyanate)、异硫氰酸酯(isothiocyanate)、N-羟基琥拍酯(NHS ester)、环氧化物(6口(《丨(16)、环氧乙烧((《;[以116)、氮丙卩定(32；[1^(1;[116)、马来酰亚胺(maleimide)、乙烯砜(vinylsulfone)、娃醇基(siIanol)等,这些基团可与目标分子中的相应基团进行化学反应而形成共轭键来标记。
[0044]4)多聚化学发光标记试剂的合成
[0045]对步骤3)的共轭体引入化学发光标记基团，利用NHS-活化的吖啶酯对含氨基共轭体的修饰，若氨基修饰的ABEI，则可通过EDC耦合反应或还原性席夫碱的形成而引入；若吖啶酯或ABEI被其它官能团所修饰，则其它方法包括点击化学、SMCC-巯基化学等亦可用来引入化学发光基团。
[0046]在步骤I)中，所述多聚物骨架(polymeric backbone)修饰,根据多聚物不同的结构以及配体-多聚物共轭体不同的合成方法需要设计不同的多聚物骨架修饰方法；一些多聚物可能不需修饰，比如含官能团氨基的多聚物(BSA、PE1、树状纳米微球、聚赖氨酸等)可以利用其氨基，与NHS-活化的配体可进行直接反应合成配体-多聚物。
[0047]所述多聚化学发光标记试剂的应用如下:
[0048]所述多聚化学发光标记试剂可广泛应用于医疗诊断、生物技术、生物医药、生命科学、食品安全、环保检测等领域。具体来说，多聚化学发光标记试剂的最普遍应用是免疫分析诊断，其次为新药研发中配体-受体(ligand-receptor)之间相互作用分析,再次是核酸或基因检测。
[0049]a)免疫诊断分析
[0050]链霉亲和素(streptavidin)被广泛用来修饰抗体形成抗体-亲和素共轭物。通过亲和素-生物素之间非常强的作用力(亲和系数为1.3X IO15IT1)可引入含生物素的多聚吖啶酯。通过生物共轭技术，多聚吖啶酯可用来标记抗原或抗体。常用的共轭技术包括SFB与SANH配对、SMCC与巯基配对等。因此，含SFB的多聚吖啶酯可用来标记含SANH的抗体或抗原；含SANH的多聚吖唳酯还可用来标记NaIO4氧化后的抗体(形成腙键，hydrozone)；而含SMCC的多聚吖啶酯可用来巯基化的抗体。一旦被多聚吖啶酯所标记，抗体或抗原便可被用于化学发光免疫诊断分析。
[0051]b)配体-受体(ligand-receptor)作用分析
[0052]配体-受体作用是生命科学中最重要的作用之一，对于新药研发、各类疾病原理的揭示等具有指导性意义。通过多聚吖啶酯标记的小分子配体可研究癌症等疾病细胞表面的受体，从而对新 药研发、疾病原理研究提供有效的化学发光检测手段。举例来讲，叶酸(folic acid)可被引入到多聚卩丫唳酯修饰的树状纳米微球(dendrimer)上,通过叶酸-叶酸受体间的特异性作用可研究癌症细胞在抗癌新药作用下的变化从而为新药开发提供高效的分析工具。[0053]c)基因分析
[0054]核酸或基因的最突出特点是碱基配对(base-pairing)作用，被广泛应用于基因或核酸分析。目前应用最多的是基因的荧光分析，包括荧光基因测序，其关键是荧光标记的核苷(fluorescent nucleotides)或引物(fluorescent primers)。此突光标记可被化学发光标记如B丫唳酯所取代，形成化学发光核苷或引物(chemiluminescent nucleotides orprimers),可用于化学发光的基因分析。
[0055]举例来说，利用化学发光杂交保护分析的原理可检测空肠弯曲菌、单核细胞增生性李斯特氏菌、大肠杆菌0157和金黄色葡萄球菌4种致病菌特异性RNA序列，这种方法无需物理分离，利用吖啶酯标记DNA探针，通过核酸杂交保护分析法，即应用人工合成的靶DNA保守区的寡核苷酸，在合成时引入一个烷氨基的手臂，经活化后接上吖啶酯，制成化学发光探针。杂交后无需分离步骤，而是利用差分水解来鉴别，即加入碱性溶液，游离的发光探针遇碱水解失去发光特性，而与特异性目的片段结合的探针形成DNA-RNA杂交体，由于吖啶酯是平面结构很容易进入双螺旋的内部而获得杂交保护，水解速度缓慢(半衰期达IOmin以上)，仍有发光性能，可以在发光仪上显示化学发光信号，从而实现对病原菌的检测。
[0056]本发明的核心技术是化学发光标记(如吖啶酯、ABE1、金刚烷、APS-5等)的多聚化，从而提高化学发光量(几倍到几十倍)，进而提高免疫分析、基因检测等生物分析的灵敏度。另一个特点是本发明利用生命科学中最重要的抗原-抗体、配体-受体、碱基配对等特异性作用开发产品，选择性高、应用范围广泛，具有高度商业前景。
[0057]本发明的基本思想也是利用多聚效应将高效发光的吖啶酯、鲁米诺或其它化学发光标记物制备成多聚化学发光标记试剂以进一步提高其发光量及灵敏度。
[0058]本发明为化学发光免疫分析领域或基因检测领域提供一种新的、高效化学发光标记技术，其技术核心是带有多个发光标记基团(如吖啶脂、鲁米诺、异鲁米诺、酰肼或环酰肼、金刚烷等)的多聚化学发光标记，其中标记基团可用来标记生物大分子(如抗体、蛋白质、多糖、DNA、RNA、基因或其它生物大分子)或生物小分子(如生物素、激素、荷尔蒙、类固醇等)。相对于单个吖啶酯标记来说，多聚吖啶酯标记可提高标记物的发光强度，从而提高检测灵敏度，对于超低浓度的生物分子的分析检测尤为有益。本发明可广泛应用于生物诊断、生物技术、生命科学、生物医药、食品安全、环保检测等领域。
【专利附图】
【附图说明】
[0059]图1为多聚吖啶酯的整体概念示意图，其中配体是相互间具有特异性作用配对(如配体-受体)中的一方，包括抗体、抗原、生物素(biotin)、亚氨基生物素(2-1minobiotin)、链霉亲和素(straptavidin)、抗生物素蛋白(avidin)、地高辛(Digoxin)、Digoxigenin、唾液酸(sialic acid)、叶酸(folic acid)、凝集素(lectin)、伴刀豆凝集素 A(ConcanavalinA, ConA), DNA、RNA、激素、荷尔蒙、类固醇等；化学发光标记包括吖啶酯、异鲁米诺、金刚烷、APS-5 等。
[0060]图2为图1特例的抗体-多聚吖啶酯示意图，图1中的配体为抗体。
[0061]图3为多聚吖啶酯标记物的通用制备方法。Oo为配体；X为氨基、羧基、巯基、肼基(hydrazine)、醒基、氧氨基(oxyamine)、环氧乙烧(oxirane)等；Y 或 Z 为 NHS、SMCC、SFB、SANH等，也可等同于X。图3描述了所述多聚化学发光标记试剂的通用制备方法。化学发光标记中使用最广泛者当属吖啶酯及氨基修饰的异鲁米诺(ABEI)。N-羟基琥珀酯(NHS)-活化的吖啶酸可参照文献(Bioorg.Med.Chem.Lett.14 (2004)，2313-7)以化学合成手段合成出来，也可以从供应商采购；ABEI可从供应商采购。多聚物骨架可直接采用含活泼基团的蛋白质(如BSA)或带有官能团的合成高分子，也可修饰天然产物(如葡聚糖)以引入目的官能团。核酸片段或基因骨架可通过全自动核酸合成法(solid phase oligonucleotidesynthesis，SP0S)引入氨基或其它基团，也可通过其它方法(如氧化)在DNA或RNA链上直接引入基团。至于配体、受体或官能团则可据上述方法为不同分子设计不同的制备方法。举例来说，生物素可通过NHS-活化来制备成生物素-NHS活化酯以便于修饰含氨基的多聚物骨架。一旦上述片段制备完毕就可将其组装起来。以NHS-活化酯为例，配体-NHS酯、NHS-吖啶酯可很容易与含氨基的多聚物在中性缓冲液中形成稳定的酰胺键，从而形成配体-多聚物-吖啶酯(图3)。这里的配体、多聚物、吖啶酯的配比可据需求进行调整。上述制备方法中所用原料均从供应商购买并直接使用。
[0062]图4为生物素-多聚吖啶酯分析数据:生物素-G4-多聚吖啶酯在亲和素检测中的应用。配体为生物素，化学发光标记为吖啶酯，多聚物骨架为G4 (第4代树状纳米微球)。单一吖啶酯为生物素-吖啶酯，多聚吖啶酯为生物素-G4-多聚吖啶酯。图4以亲和素为代表性范例描述了生物大分子的检测。此例中的配体为生物素，多聚物骨架为G4树状纳米微球，化学发光标记为吖啶酯，它们组成生物素-G4-多聚吖啶酯。而作为单一吖啶酯的生物素-吖啶酯可用来作对比。从图4数据分析，多聚吖啶酯将单一吖啶酯的发光量提高数倍(在其它实验中，分析数据显示，多聚吖啶酯可将单一吖啶酯的发光量提高60倍以上)，其线性良好，R2达0.998，对于提高亲和素的检测灵敏度极有帮助。由于生物素-亲和素是生命科学中应用最广泛的一对配体-受体，这里描述的多聚吖啶酯广泛地应用于生物素或亲和素标记的生物大分子的检测中。
[0063]图5为地高辛-多聚吖啶酯分析数据:地高辛-BSA-多聚吖啶酯(Dig-BSA-pSAE)在地高辛竞争法检测的应用。配体为地高辛，化学发光标记为吖啶酯，多聚物骨架为BSA。图5以地高辛为代表性范例描述了生物小分子的竞争法检测。此例中的配体为地高辛，多聚物骨架为BSA，化学发光标记为吖啶酯。竞争法是检测生物小分子常用的方法，地高辛是心脏病检测中一项重要指标。图5数据显示地高辛-BSA-多聚吖啶酯可通过竞争法来检测地高辛，其线性良好，R2达0.996。另外，数据进一步显示，地高辛-BSA-多聚吖啶酯的发光量可达地高辛-吖啶酯(单一吖啶酯)的56倍(数据没显示)。
【具体实施方式】
[0064]以下实施例将对本发明作进一步的说明。
[0065]本发明的三个组成部分包括化学发光标记(chemiluminescent label)、多聚物骨干(polymeric backbone)及配体(ligand)或官能团(functional group)。以下例子以口丫唳酯作为化学发光标记，多聚物选自牛血清白蛋白(BSA)、树状纳米微球(dendrimer)、聚乙烯亚胺(PEI)、葡聚糖(chitosan),配体选自生物素(biotin, Bt)、链霉亲和素(streptavidin, SAv)、地高辛(digoxin)等。
[0066]⑴所需仪器:[0067]Orion II Microplate Luminometer (Berthold,Germany)、Berthold 的 Sirius LTubeLuminometer,全自动酶标洗板仪(PW-812,汇松)、紫外可见分光光度计(TU-1810,北京普析通用仪器有限责任公司)，全自动新型电热培养箱(ZDP-A2080A，上海智城分析仪器制造有限公司)。
[0068](2)所需药品:
[0069]除非特殊注明，下列药品是从3丨811^-41(11^(311、4]^3、1'(:1、百灵威、西亚、国药、北京万泰、上海源叶、安耐吉等商业机构购买并直接使用。[0070]生物素、链霉亲和素、葡聚糖、缩水甘油、2_(对羟基苯偶氮)苯甲酸(HABA)、己二酸二酰肼(ADH)、聚酰胺-胺型树枝状高分子(PAMAM)、2，2’ -联喹啉_4，4’ - 二羧酸二钠(BCA)、地高辛、透明质酸、双氧水、Tris盐酸盐、Tris碱、硼酸盐、HEPES、磷酸盐、碳酸盐、EDTA、盐酸、氢氧化钠、吐温20 (Tween20)、鹿糖(Sucrose)、酪蛋白钠盐、小牛血清(FBS)及牛血清白蛋白(BSA)(上海符达生物有限公司)；C183D是经过重组表达的乙肝壳蛋白核心抗原、MB-Ab中使用的抗体(Ab)是针对C183D的。
[0071]磺基化吖啶酸(NSP-SA )、磺基化吖啶酸-琥珀酰亚胺酯(NSP-SA-NHS或SAE )、对-甲酰基苯甲酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SFB)、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸(SANH)、生物素-吖啶酯(单一吖啶酯)由赫利森生物科技公司自己合成的。
[0072](3)操作方案:
[0073]以下例子仅选取三类配体(生物素、地高辛或链霉亲和素)、牛血清白蛋白(BSA)或树状纳米微球(G4)以及葡聚糖为多聚物骨架、吖啶酯为化学发光标记来说明本发明的多聚化学发光标记试剂的合成、分析及应用。使用其它配体或多聚物骨架的数据在此不再赘述。
[0074]第一类:以生物素为配体的多聚吖啶酯(Bt-pSAE)
[0075]I)生物素-BSA-多聚吖啶酯(Bt-BSA-pSAE)
[0076]合成步骤:取5mg的BSA溶液，加入适量的NHS活化的生物素(Bt-NHS)溶液，室温下反应一个h。再加入适量的NHS活化的吖啶酯(SAE-NHS)溶液，室温下反应30min。反应液经G25脱盐柱脱盐，磷酸盐缓冲液(pH6.3，IOOmM)洗脱，收集洗脱液(每管0.5mL)，通过BCA蛋白分析法以决定产品收集。
[0077]样品分析:取以上G25脱盐收集液产品中的样品做分析，标记为Bt-BSA-pSAE，用水稀释20倍后进行测量。
[0078]a)吖啶酯(SAE)浓度测试:分别取150 μ L上述样品通过紫外可见吸收光谱(UV-Vis)测试369nm及562nm处吸光值，以吖啶酯在369nm处的摩尔吸光系数146501^(^1计算吖啶酯浓度=A369=0.186，吖啶酯浓度=0.254mM。
[0079]b)BSA浓度测试:分别取20μ L上述样品，加入200 μ L的BCA工作液，在37°C孵化15min后测量562nm处发光值，对照标准曲线计算BSA浓度=A562=0.343，BSA浓度=0.033mM。
[0080]c)吖啶酯 /BSA 比例:【吖啶酯】/ [BSA] =0.254mM/0.033mM=7.79。
[0081]d)生物素(Biotin，Bt)测定:2_ (对-羟基苯偶氮)苯甲酸-链霉亲和素(HABA-SAv)配合物在500nm具有特殊吸收，其吸光系数为35500^^?'当生物素加入到此溶液中由于生物素-链霉亲和素之间的亲和系数(约1.3X IO15M4)远大于HABA-链霉亲和素(约6X IO6IT1),生物素将取代HABA与链霉亲和素结合从而将其释放到溶液中导致500nm处的吸收峰降低。此特性被广泛用于生物素的定量分析。[0082]溶液配制:磷酸盐缓冲液:0.05M磷酸盐，0.15M NaCl，pH6 ;2_(对-羟基苯偶氮)苯甲酸(HABA)溶液:在IOmM的NaOH溶液中配制2.42mg/mL的HABA溶液。链霉亲和素(Streptavidin, SAv) (lmg/mL):在PBS溶液中配制2.2mg/mL的链霉亲和素溶液。工作液:ImL的上述链霉亲和素溶液与25 μ L上述HABA溶液混合后制成工作液。
[0083]样品分析:取10 μ L的Bt-BSA-pSAE样品加入90 μ L工作液，测试500nm处吸光值=HABA-SAv在500nm处的吸光值为0.307，Bt-BSA-pSAE样品在500nm处的吸光值为
0.279，差值为0.028，换算成测试液浓度为7.9X104mM，而稀释前样品浓度为0.079mM。因此，此样品的每条BSA链上平均含有约7.8个吖啶酯标记、2.4个生物素标记。
[0084]2)生物素-G4-多聚吖啶酯(Bt-G4_pSAE)
[0085]a)生物素-吖啶酯(Bt-SAE)的合成:取IOmg NHS-活化的吖啶酯溶入无水DMF，溶解后加入适量生物素酰肼，室温反应18h，浓缩除去DMF后通过制备型薄层板分离得生物素-吖啶酯产品。b)生物素-G4-多聚吖啶酯(Bt-G4-pSAE)的合成:称取5mg PAMAM(G4)树状纳米微球，溶于ImL的0.1M磷酸盐缓冲液(pH7.0)中，加入适量的NHS-活化生物素(Bt-NHS) DMF溶液，室温反应Ih后，加入适量的NHS-活化的吖啶酯(SAE-NHS)的DMF-磷酸盐溶液，室温下避光反应2h，加入适当试剂处理后，取清液浓缩得17.2mg产品。
[0086]3)化学发光测试:
[0087]溶液配制:a)生物素-吖啶酯(Bt-SAE):称取3.3mg的上述生物素-吖啶酯溶于2mL的DMF制成生物素标记的单一吖啶酯。b)生物素-G4-多聚吖啶酯(Bt_G4-pSAE):称取17.2mg的上述生物素-G4-多聚吖啶酯溶于2mL的水中制成树状物微球为骨架的多聚吖啶酯溶液。
[0088]化学发光测试:通过EDC (l-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimidehydrochloride)稱合,链霉亲和素(SAv)被修饰到含羧基的磁珠表面。将不同浓度的生物素-吖啶酯或生物素-多聚吖啶酯分别溶解在PH7.4的磷酸盐缓冲液中，反应十min，然后用磷酸盐缓冲液洗涤4次，样品加入到特殊发光试管后置入Berthold的Sirius L管式发光检测仪(Tube Luminometer),自动加入发光引发剂后测量发光量,单一与多聚吖唳酯化学发光测试对比参见表1，表1的数据被用来制作图4。
[0089]表1
[0090]
【权利要求】
1.多聚化学发光标记试剂，其特征在于其原料组成如下: a)化学发光标记物； b)多聚物骨架； c)配体、受体或官能团。
2.如权利要求1所述多聚化学发光标记试剂，其特征在于所述化学发光标记物为任何通过吸收化学能而发光的标记物，选自: a)吖啶酮系列，所述吖啶酮系列选自吖啶酯及其衍生物，包括磺基化的吖啶酯，APS-5(9-(4-chlorophenylthiophosphoryl-oxymethylidene)-10-methylacridan)及其衍生物； b)酰肼系列，所述酰肼系列选自鲁米诺、异鲁米诺、鲁米诺相关的酰肼或环酰肼； c)苯多酚系列，所述苯多酚系列选自邻苯三酚、间苯三酚或间苯二酚； d)金刚烷系列，所述金刚烷系列选自3-(2-螺旋金刚烷-4-甲氧基-4-甲基-4-(3-磷酸氧基)-苯基_1，2- 二氧乙烧； e)其它系列，所述其它系列选自过氧草酸酯、光泽精或洛粉碱； f )能量转移类发光标记物，所述能量转移类发光标记物选自能量转移类的鲁米诺衍生物，所述能量转移类的鲁米 诺衍生物选自鲁米诺-吖啶酮共轭体；或鲁米诺-荧光素共轭体；或鲁米诺-罗丹明共轭体；其中，吖啶酮、荧光素、罗丹明是能量受体，其它能量受体可同样被采用。
3.如权利要求1所述多聚化学发光标记试剂，其特征在于所述多聚物骨架选自: 1)含有多个供化学发光标记修饰的官能团的人造多聚物或天然多聚物，选自葡聚糖、琼脂糖、纤维素、聚乙烯亚胺、聚丙烯酸及其衍生物、树状纳米微球、聚赖氨酸、牛血清白蛋白、人血清白蛋白或其它蛋白质或多肽； 2)特殊化学修饰的核酸，所述特殊化学修饰的核酸，在核苷酸糖环、磷酸基或碱基上通过化学修饰引入吖啶酯或异鲁米诺，优选树状DNA。
4.如权利要求1所述多聚化学发光标记试剂，其特征在于所述配体是相互间具有特异性作用配对中的一方，所述配体为抗原-抗体、配体-受体、DNA碱基配对或RNA碱基配对、底物-酶、配体-蛋白；所述配体可选自生物配体包括生物素、亚氨基生物素、唾液酸、叶酸、凝集素、伴刀豆凝集素A、钙调素、肝素、抗原、精氨酸、赖氨酸、谷胱甘肽、谷胱甘肽-S-转移酶、地高辛、透明质酸、苯硼酸、明胶、磷酸腺苷、二磷酸腺苷、三磷酸腺苷、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸、苯甲脒、汽巴隆蓝、普施安红、DNA片段、RNA片段、荷尔蒙多肽、激素、荧光素中的一种。
5.如权利要求1所述多聚化学发光标记试剂，其特征在于所述受体是相互间具有特异性作用配对中的另一方，所述受体选自链霉亲和素、抗生物素蛋白、NutraAvidin、抗体、G蛋白偶联受体及其它细胞表面受体、生物酶中的一种；所述抗体可选自荧光素-抗荧光素抗体或地高辛-抗地高辛抗体。
6.如权利要求1所述多聚化学发光标记试剂，其特征在于所述官能团是可用来修饰抗体或DNA或其它生物分子的化学基团，所述官能团选自醛基、氨基、羧基、巯基、炔基、叠氮、氧氨、肼、α -卤代羧基、异氰酸酯、异硫氰酸酯、N-羟基琥珀酯、环氧化物、环氧乙烷、氮丙啶、马来酰亚胺、乙烯砜、硅醇基、螯合剂中的一种。
7.如权利要求1所述多聚化学发光标记试剂，其特征在于所述官能团选自生物共轭反应配对中的一个: a)甲酰基苯甲酸N-羟基琥珀酰亚胺酯或2，5-二氧吡咯烷-1-基-6-(2-(丙-2-亚基)餅基)烟酸；
b)SMCC (4- (Maleimidomethyl) cyclohexanecarboxylic acid)或疏基； c)点击化学配对； d)原生化学链接(NativeChemical Ligation)配对； e)狄尔斯-阿尔德反应(Diels-AlderReaction)配对。
8.如权利要求1所述多聚化学发光标记试剂的制备方法，其特征在于包括以下步骤: O多聚物骨架修饰 根据多聚物不同的结构以及配体-多聚物共轭体不同的合成方法需要设计不同的多聚物骨架修饰方法； 若生物共轭化学是以SFB及SANH为基础的，则需要在多聚物上修饰SFB或SANH，以便与SANH或SFB修饰的配体进行配对反应从而制备配体-多聚物共轭物； 若其它生物共轭反应配对，包括SMCC-巯基、点击化学配对、原生化学链接、狄尔斯-阿尔德反应亦可 应用于此； 若生物素引入到多聚物上，其方法包括NHS-活化的生物素与含氨基的多聚物形成酰胺键； 若酶链亲和素，通过EDC耦合反应引入到多聚物上； 还原性席夫碱形成、α -卤素取代、芳香叠氮光化学； 2)配体或受体修饰 根据配体的结构以及多聚物骨架上所含的官能团的不同需要设计不同的修饰方法，尤其需要据生物共轭反应配对来设计与多聚物互补的修饰化学，以上所述多聚物修饰化学也适用于配体的修饰，包括配体的NHS活化、生物共轭配对修饰、点击化学、原生化学链接、狄尔斯-阿尔德反应、席夫碱形成等，类似生物共轭化学技术可同样应用到受体的修饰上； 3)配体-多聚物共轭体或受体-多聚物共轭体的合成 当多聚物、配体在被适当的基团修饰后，生物共轭反应可合成相应的配体-多聚物共轭体； 若配体是NHS-活化的，而多聚物含有氨基，则通过酰胺键的形成合成配体-多聚物共轭体； 若配体是SFB修饰的，而多聚物是SANH，则通过SFB-SANH间独特的席夫碱形成可合成配体-多聚物共轭体； 除配体及受体之外，一些特殊的官能团可直接用来标记目标分子，所述特殊的官能团包括醛基、氨基、羧基、巯基、炔基、叠氮、氧氨、肼、α -卤代羧基、异氰酸酯、异硫氰酸酯、N-羟基琥珀酯、环氧化物、环氧乙烷、氮丙啶、马来酰亚胺、乙烯砜或硅醇基，这些基团与目标分子中的相应基团进行化学反应而形成共轭键来标记； 4)多聚化学发光标记试剂的合成 对步骤3)的共轭体引入化学发光标记基团，利用NHS-活化的吖啶酯对含氨基共轭体的修饰，若氨基修饰的ABEI，则可通过EDC耦合反应或还原性席夫碱的形成而引入；若吖啶酯或ABEI被其它官能团所修饰，则其它方法包括点击化学、SMCC-巯基化学等亦可用来引入化学发光基团。
9.如权利要求1所述多聚化学发光标记试剂在医疗诊断、生物技术、生物医药、生命科学、食品安全、环保检测中的应用。
10.如权利要求9所述应用，其特征在于所述诊断为免疫分析诊断，所述生物技术为配体-受体之间相互作用分析，核酸、基因分析与检测。
【文档编号】G01N21/76GK103792346SQ201410050951
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2014年2月14日 优先权日:2014年2月14日
【发明者】刘涧泉, 黄炳河 申请人:赫利森（厦门）生物科技有限公司