一种区分不同品种钩藤的高效液相色谱检测方法
【专利摘要】本发明属于中药材分析领域，具体公开区分不同品种钩藤的高效液相色谱方法，通过优化各个实验参数，实现钩藤药材HPLC检测时各色谱峰的有效分离，减少色谱峰相互干扰、拖尾等现象，并实现不同品种钩藤HPLC的不同成分色谱峰的基本彼此不干扰，为鉴别不同品种的钩藤及构建钩藤HPLC指纹图谱提供基础。
【专利说明】一种区分不同品种钩藤的高效液相色谱检测方法
【技术领域】
[0001]本发明属于中药材分析领域，具体涉及一种区分不同种钩藤的高效液相色谱检测方法。
【背景技术】
[0002]钩藤是中医临床的常用中药，其性微寒味甘，归肝、心包经，可清热平肝、熄风定惊，对心血管疾病、神经系统疾病有一定疗效。
[0003]钩藤的化学成分多，不同品种的钩藤其化学成分也不尽相同。钩藤中所含主要化学成分有吲哚生物碱类、三萜类、黄酮类、香豆素类、喹喏酸皂苷类、酚类及有机酸等，而目前钩藤主要的有效化学成分为生物碱类成分。
[0004]2010年版《中国药典》规定钩藤为菌草科植物钩藤Uncaria rhynchophylla(Miq.) Miq.ex Havi1.、大叶钩藤 Uncaria macrophylla Wall.、毛钩藤 Uncariahirsute Havil.、华钩藤 fecaria sinensis (Oliv.) Havi1.和无柄果钩藤 fecariasessilifructus Roxb.的干燥带钩莖枝。但目前市面上钩藤药材远不止这几种，不同品种的钩藤，即使是同一种的钩藤由于生长环境、采收季节、加工方法和贮存条件不同，其所含化学成分、含量、疗效有较大差异。钩藤药材种类多，来源广，成分复杂，是品种混乱，鉴别困难的药材。目前，对于不同品种钩藤药材的鉴别主要是基于药材的性状和显微特征以及薄层色谱鉴别，但性状和显微特征鉴别困难，而且主观性较强，而薄层色谱法亦不能有效地鉴别钩藤品种。建立不同品种钩藤的常规鉴别方法，能更有效的针对不同品种钩藤进行对症治疗，并解决钩藤品种混乱的现状。因此，建立该常规鉴别方法十分迫切和具有现实意义。
[0005]钩藤生物碱是钩藤主要药效成分，也是建立区别不同种钩藤的主要要分离的成分。目前，我国主要钩藤品种现已发现几十个钩藤生物碱成分，虽然不同品种钩藤含有的成分大多不同，但由于钩藤生物碱均为吲哚生物碱，母体结构相似，并有较多的同系物、同分异构体，有些是立体异构，应用分离效果远高于TLC的HPLC技术分离，以及区分不同品种钩藤成分也颇为困难，影响后续钩藤种类的鉴别及其指纹图谱的建立。现有技术亟待一种针对不同品种钩藤均适用的，不同成分色谱峰彼此不干扰的高效液相色谱检测方法，以便于建立一种简单、实用的鉴定不同品种钩藤的方法。
【发明内容】
[0006]本发明的发明目的在于克服现有技术不同品种钩藤药材近似成分液相色谱峰重叠，难以分离或区分的技术难题，提供一种区分不同品种钩藤高效液相色谱方法，通过优化各个实验参数，实现I小时内钩藤药材HPLC检测时各色谱峰的有效分离，并实现多种钩藤HPLC的不同成分色谱峰的基本彼此不干扰，为鉴别不同品种的钩藤以及构建钩藤HPLC指纹图谱提供便利。
[0007]本发明的上述目的通过如下技术方案予以实现:
一种区分不同品种钩藤高效液相色谱检测方法，包括以下步骤:(1)制备钩藤检测溶液:
(2)高效液相色谱检测:用5μ m Platisil ODS-RP色谱柱，甲醇-乙腈-缓冲液为流动相洗脱液，流速:1.0ml/min ;检测波长:245nm和226nm ;进样量:20 μ I ;柱温:35 V ;梯度洗脱程序如下:
时间Omin 洗脱液组成为甲醇12%、乙腈24%、缓冲液64% ；
时间15min 洗脱液组成为甲醇18%、乙腈26%、缓冲液56% ；
时间30min 洗脱液组成为甲醇30%、乙腈30%、缓冲液40% ；
时间60min 洗脱液组成为甲醇30%、乙腈30%、缓冲液40% ；
所述缓冲液为PH大于7的磷酸盐缓冲液或浓度不低于0.1%氨水溶液；
(3)区分不同品种钩藤:根据钩藤的高效液相色谱图中特征色谱峰的相对保留时间及特征吸收波长来区分不同品种钩藤。
[0008]本领域技术人员均知晓，不同品种的钩藤，即使是同一种的钩藤由于生长环境、采收季节、加工方法和贮存条件不同，其所含化学成分、含量、疗效有较大差异，因而现有技术中尚未有一种能将不同品种钩藤的特征液相色谱峰均能彼此不干扰的分离的方法，但是本发明所公开的方法适用于不同品种钩藤样品，本发明所述钩藤包括正品钩藤(Uncariarhynchophylla (Miq.) Jacks.)、大叶钩藤(U.macrophylla Wall.)、华钩藤(U.sinensis(Oliv.) Havi1.) > 无柄果钩藤(Uncaria sessilifructus Roxb.)、毛钩藤(Uncariahirsute Havil.)或攀莖钩藤(U.scandens (Smith) Hutch)。
[0009]作为一种优选方案，钩藤检测溶液制备步骤具体为:称取钩藤药材粉0.5~lg，加入氯仿:甲醇:氨水混合溶剂25ml，超声4(T50min，取滤液，低温浓缩后，残渣用70%甲醇水溶液稀释至2(T25ml，过滤，取滤液作为检测溶液；所述氯仿:甲醇:氨混合溶剂中，氯仿、甲醇与氨水的体积比为15:5:0.5。`采用混合溶剂超声萃取有利于钩藤检测溶液的制备。
[0010]作为另一种优选方案，钩藤检测溶液制备步骤具体为:称取钩藤药材粉0.5^1g,加入70%甲醇水溶液2(T25ml超声4(T50min，过滤，取滤液作为检测溶液。直接采用70%甲醇水溶液超声制备钩藤检测溶液，可以省略溶剂挥发浓缩再稀释等步骤，有利于简化工艺，节约成本。
[0011]优选地，所述钩藤药材粉过40目筛，更有利于超声提取。
[0012]本发明所述流动相洗脱液的组成及比例并非常规选择，本领域技术人员均知晓流动相洗脱液的组成及比例是影响后续液相色谱峰分离的重要因素之一，对流动相洗脱液组成及比例的确定需要通过大量实验才能优化出来，不同样品，其所含物质种类及含量的不同，其高效液相色谱检测参数也必须相应优化调整，否则容易出现色谱峰干扰、拖尾、变形等不良后果。由于钩藤药材主要分离成分吲哚生物碱成分较多，有较多的同分异构体，立体异构体，本发明不但要求每一样品内的成分分离良好，而且要使不同品种钩藤的不同成分色谱峰的基本彼此不干扰，这是相当困难的，需要大量的实验研究。
[0013]优选地，所述磷酸缓冲液的浓度为5~10 mmol/L。发明人通过实验发现，流动相洗脱液选用不同浓度的磷酸缓冲液，对色谱峰会有较大的影响，当磷酸缓冲液浓度较低时，色谱峰的峰宽增大，严重时会出现峰形拖尾，当浓度过高时，会缩短色谱柱的使用寿命。
[0014]本发明公开的区分不同品种钩藤高效液相色谱检测方法，能够实现色谱峰的有效分离，不出现色谱峰重叠、拖尾和变形等现象，并使不同品种钩藤的不同成分色谱峰的基本彼此不干扰，同时利用钩藤样品的HPLC色谱图的主要吸收峰位置结合色谱峰特征吸收可以区别钩藤的不同品种，具体的区别方法如下:
一、当钩藤为正品钩藤时，HPLC色谱图中特征色谱峰有9个，其相对钩藤碱的保留时间及特征吸收波长分别为(2) 0.55min/226nm、(3) 0.58min/226nm、(4) 0.83min/246nm、(异钩藤喊，简称 A) 0.87min/245nm> (5) 0.89min/245nm> (钩藤喊，简称 B) 1.00min/246nm>
(6)1.02min/226nm、(7) 1.04min/226nm、(8) 1.09min/226.2nm ；(色谱峰编号对应说明书附图1)。
[0015]二、当钩藤为大叶钩藤时，HPLC色谱图中特征色谱峰有4个，其相对钩藤碱的保留时间及特征吸收波长分别为(A)0.87min/245nm、(B) 1.00min/246nm、(9) 1.02min/245nm、
(10)1.09min/246nm ；(色谱峰编号对应说明书附图2)。
[0016]三、当钩藤为毛钩藤时，HPLC色谱图中特征色谱峰有6个，其相对钩藤碱的保留时间及特征吸收波长分别为(14)0.77min/234nm、(15)0.82min/244nm, (16)0.84min/239nm,
[17]0.91min/245nm、(18)0.98min/243nm、(19) 1.08min/246nm ；(色谱峰编号对应说明书附图3)。
[0017]四、当钩藤为华钩藤时，HPLC色谱图中特征色谱峰有3个，其相对钩藤碱的保留时间及特征吸收波长分别为(11)0.69min/242nm、(12) 0.85min/243nm、(13)0.99min/245nm ；(色谱峰编号对应说明书附图4)。
[0018]五、当钩藤为无柄果钩藤时，HPLC色谱图中特征色谱峰有2个，其相对钩藤碱的保留时间及特征吸收波长分别为(A)0.87min/245nm、⑶1.00min/246nm ；(色谱峰编号对应说明书附图5)。
[0019]六、当钩藤为攀茎钩藤时，HPLC色谱图中特征色谱峰有4个，其相对钩藤碱的保留时间及特征吸收波长分别为(11) 0.694min/242nm、(12) 0.85min/243nm、
(13)0.99min/245nm、(20)0.49min/243nm ；(色谱峰编号对应说明书附图 6)。
[0020]由于钩藤检测领域的技术人员均知晓现有技术中的高效液相色谱检测方法中可对正品钩藤或某一种钩藤样品的成分色谱峰分离，但是不同品种的成分多，而且成分近似度高，现有的高效液相色谱方法不易实现不同品种钩藤间的不同成分色谱峰的彼此不干扰，因而至今尚未出现有关鉴别不同品种钩藤的高效液相方法。本发明正好填补了现有技术这方面的空白，为日后鉴定不同品种钩藤或构建其他品种钩藤的指纹图谱提供了有力条件。
[0021]与现有技术相比，本发明具有如下有益效果:
(I)本发明的方法能够在于I小时内实现不同品种钩藤药材HPLC检测时各色谱峰的有效分离，减少色谱峰相互干扰、拖尾和变形等现象，并使不同品种钩藤的不同成分色谱峰的基本彼此不干扰，为构建钩藤HPLC指纹图谱以及鉴别不同品种的钩藤提供便利。本方法已经采集基源清楚的各品种样品数十个进行验证(后面每一品种只列举几个，见图1飞)，鉴别结果均准确。
[0022](2)采用甲醇-乙腈-磷酸盐缓冲液(pH大于7)或0.1%氨水作为流动相洗脱液，耐用性好，不干扰色谱峰吸收光谱，能较好保护柱子；另外，采用0.1%氨水作为流动相洗脱液，可以适用于质谱等液相检测器。
[0023](3)甲醇-乙腈-的磷酸盐缓冲液(pH大于7)或0.1%氨水流动相三元梯度可换算成二元梯度，便于不同仪器应用。二元梯度如下:
时间Omin 洗脱液组成为A20%、B80%、
时间15min 洗脱液组成为A30%、B70%、
时间30min 洗脱液组成为A50%、B50%、
时间50min 洗脱液组成为A50%、B50%、
其中A为40%乙腈+60%甲醇；B为20%乙腈+80%水(缓冲液)。
【专利附图】
【附图说明】
[0024]图1为不同来源的正品钩藤的HPLC对比图；其中，SI为贵州天柱县正品钩藤，S2为江西正品钩藤，S3为广东梅州市正品钩藤，S4为广东梅州大浦县正品钩藤，S5为韶关阳山县正品钩藤，S6为广西梧州市正品钩藤，S7为贵阳正品钩藤，S8为广西南宁市正品钩藤。
[0025]图2为不同来源的大叶钩藤的HPLC对比图；其中，SI为广东肇庆鼎湖山大叶钩藤，S2为广西植物园大叶钩藤，S3为广东罗浮山大叶钩藤。
[0026]图3为不同来源的毛钩藤的HPLC对比图；其中，SI为广东肇庆鼎湖山毛钩藤钩茎、S2为广东肇庆鼎湖山毛钩藤叶、S3为广西毛钩藤。
[0027]图4为不同来源的华钩藤的HPLC对比图；其中，SI为贵州安顺华钩藤、S2为四川重庆金佛山华钩藤、S3为贵州剑河华钩藤。
[0028]图5为不同来源的无柄果钩藤的HPLC对比图；其中，SI为广西植物园无柄果钩藤、S2为广西中医学院药圃无柄果钩藤。
[0029]图6为不同来源的攀茎钩藤的HPLC对比图；其中，SI为广州南方医学院药圃攀茎钩藤、S2为华南植物园攀茎钩藤钩、S3为华南植物园攀茎钩藤叶子。
[0030]图7为不同品种钩藤的HPLC对比图；其中，SI为攀茎钩藤、S2为毛钩藤、S3为无柄果钩藤、S4为华钩藤、S5为大叶钩藤、S6为正品钩藤。
[0031]图8为对比例I改变流动相比例后正品钩藤的HPLC对比图；其中，SI为未改变流动相比例的图谱、S2为改变流动相比例的图谱。
[0032]图9为对比例2变动流动相组成后正品钩藤的HPLC对比图；其中，SI为未改变流动相组成的图谱、S2为改变流动相组成的图谱。
[0033]图10为对比例3变动流动相组成后正品钩藤的HPLC对比图；其中，SI为未改变流动相组成的图谱、S2为改变流动相组成的图谱。
[0034]图11为对比例4不同浓度磷酸缓冲液的HPLC对比图。
【具体实施方式】
[0035]下面结合具体实施例对本发明作进一步的解释说明，但具体实施例并不对本发明作任何限定。除非特别说明，实施例中所涉及的试剂、方法均为本领域常用的试剂和方法。
[0036]一、制备钩藤检测溶液
(O精密称取过40目的钩藤药材粉0.5g，加入氯仿:甲醇:氨水混合溶剂25ml，超声45min，取滤液，低温浓缩后，残渣用70%甲醇水溶液稀释至25ml，过滤，取滤液作为检测溶液；所述氯仿:甲醇:氨混合溶剂中，氯仿、甲醇与氨水的体积比为15:5:0.5。
[0037]二、高效液相色谱检测选用 Platisil ODS-RP 色谱柱(250臟\4.6臟，5 4 111，861#5032395),?1161101116116叉SecurityGuard通用保护柱(4mmX 3mm, 5 μ m);甲醇-乙腈-0.1%氨水缓冲溶液为流动相洗脱液，流速:1.0ml/min ;检测波长:245nm和226nm ;进样量:20 μ I ;柱温:35 V ;梯度洗脱程序如下:
时间Omin 洗脱液组成为甲醇12%、乙腈24%、缓冲液64% ；
时间15min 洗脱液组成为甲醇18%、乙腈26%、缓冲液56% ；
时间30min 洗脱液组成为甲醇30%、乙腈30%、缓冲液40% ；
时间60min 洗脱液组成为甲醇30%、乙腈30%、缓冲液40% ；
所述缓冲液的PH值大于7，浓度为5 mmol/L磷酸盐缓冲液。
[0038]实施例1
采用上述步骤一的方法，制备来源地分别是广东梅州大浦县，贵州天柱县，广东梅州市，贵州贵阳市，韶关阳山县，广西梧州，广西南宁市和江西的正品钩藤(均经植物鉴别专家性状鉴别，并经DNA分子鉴别技术鉴定)茎钩检测溶液7份，采用步骤二的方法进行高效液相色谱检测，色谱图如图1所示。
[0039]实施例2
采用上述步骤一的方法，制备来源地分别是广东肇庆鼎湖山，广西植物园，广东云浮新兴的大叶钩藤(均经植物 鉴别专家性状鉴别，并经DNA分子鉴别技术鉴定)茎钩检测溶液3份，采用步骤二的方法进行高效液相色谱检测，色谱图如图2所示。
[0040]实施例3
采用上述步骤一的方法，制备来源地分别是广东鼎湖山的毛钩藤茎钩和叶、广西南宁毛钩藤(均经植物鉴别专家性状鉴别，并经DNA分子鉴别技术鉴定)检测溶液3份，采用步骤二的方法进行高效液相色谱检测，色谱图如图3所示。
[0041]实施例4
采用上述步骤一的方法，制备来源地分别是贵州安顺，重庆金佛山，贵州遵义的华钩藤(均经植物鉴别专家性状鉴别，并经DNA分子鉴别技术鉴定)茎钩检测溶液3份，采用步骤二的方法进行高效液相色谱检测，色谱图如图4所示。
[0042]实施例5
采用上述步骤一的方法，制备来源地分别是广西植物园、广西中医学院药圃的无柄果钩藤(均经植物鉴别专家性状鉴别，并经DNA分子鉴别技术鉴定)茎钩和叶检测溶液3份，采用步骤二的方法进行高效液相色谱检测，色谱图如图5所示。
[0043]实施例6
采用上述步骤一的方法，制备来源地分别是广州南方医科大学药圃，华南植物园的攀茎钩藤(均经植物鉴别专家性状鉴别，并经DNA分子鉴别技术鉴定)茎钩和叶检测溶液3份，采用步骤二的方法进行高效液相色谱检测，色谱图如图6所示。
[0044]实施例对比分析:
(I)将图1飞中的SI重新组合为一张图进行对比比较，如图7所示，从图7可以看出，采用本发明方法检测六种不同品种的钩藤所得到的高效液相色谱图中洗脱峰分离明显，不存在色谱峰重叠、拖尾和变形等现象。
[0045](2)从图1飞及图7我们还可以看出，不同品种钩藤谱峰的数量及出峰位置均有差另|J，结合色谱峰光谱图就可区别钩藤的品种。下面是结合液质联用检测确定不同品种钩藤的鉴别特征成分，具体结果如下:
图1中不同来源地的正品钩藤均出现9个特征峰，具体成分分别是3 a -卡丹宾碱(2)，育亨宾碱(3),异去氢钩藤碱(4),钩藤碱(A),去氢钩藤碱(5),异钩藤碱(B),毛钩藤碱(6)缝籽嗪甲醚，(7)去氢毛钩藤碱(8)，是正品钩藤的共有特征成分。
[0046]图2中不同来源地的大叶钩藤均出现4个特征峰，具体成分为钩藤碱(A)，异钩藤碱(B)、柯诺辛碱(9)和柯诺辛碱B (10)，是大叶钩藤的共有特征成分。
[0047]图3中不同来源的毛钩藤均出现6个特征峰，具体成分分别是异帽柱木碱(14)，钩藤碱A (15)，帽柱木碱(16)，台钩藤碱B (17)，3-异-19-表-四氢蛇根碱(18)，19-ep1-ajmalicine (19),是毛钩藤共有特征成分。
[0048]图4中不同来源地的华钩藤均出现3个特征峰，具体成分分别是异翅柄钩藤碱
(11)，翅柄钩藤碱(12)，台钩藤碱F (13)，这些特征成分在攀茎钩藤也有，但攀茎钩藤还有glabratine (20)成分色谱峰。
[0049]图5中不同来源地的无柄果钩藤只出现钩藤碱(A)和异钩藤碱(B)，但其它成分不明显，故这两成分是无柄果钩藤的共有特征成分。
[0050]图6中不同来源的攀茎钩藤均出现4个特征峰，具体成分为异翅柄钩藤碱(11)，翅柄钩藤碱(12)，台钩藤碱F (13), glabratine (20)，是攀茎钩藤的共有特征成分。
[0051]对比例I
采用上述步骤一的方法，制备来源地分别是江西的正品钩藤(均经植物鉴别专家性状鉴别，并经DNA分子鉴别技术鉴定)检测溶液，采用步骤二的方法进行高效液相色谱检测，但将步骤二梯度洗脱程序做了相应改动，具体为:洗脱时间30min改为时间37min时，洗脱液组成为甲醇48%、乙腈20%、0.1%氨水32% ;洗脱时间50min改为53min时，洗脱液组成为甲醇56%、乙腈20%、0.1%氨水24% ;其他条件不变，液相色谱图如图8所示，从图8中可以看出，由于流动相的变化，导致钩藤碱(B)与后面(异)柯南因碱(6)的峰分不开；如果将53min改为甲醇48%、乙腈20%、0.1%氨水32% ;分离有一定改进，但钩藤碱(B)仍不能与后面(异)柯南因碱(6)的峰分开。
[0052]对比例2
采用上述步骤一的方法，制备来源地分别是江西的正品钩藤(均经植物鉴别专家性状鉴别，并经DNA分子鉴别技术鉴定)检测溶液，采用步骤二的方法进行高效液相色谱检测，但将步骤二流动相洗脱液中乙腈部分替换为甲醇，其他条件不变，液相色谱图如图9所示，从图9中可以看出，钩藤碱及其后面的三个色谱峰成分只分出两个峰，色谱峰的分离明显达不到要求；继续在此基础上反复优化，也难以在SOmin内完全分离后面这几个色谱峰，尤其钩藤碱及其临近的成分峰。
[0053]对比例3
采用上述步骤一的方法，制备来源地分别是江西的正品钩藤(均经植物鉴别专家性状鉴别，并经DNA分子鉴别技术鉴定)检测溶液，采用步骤二的方法进行高效液相色谱检测，但将步骤二流动相洗脱液中甲醇部分替换为乙腈，其他条件不变，液相色谱图如图10所示，从图10中可以看出，在I个小时内，钩藤碱后面的三个色谱峰成分只分出两个峰，另外正品钩藤前面，包括I?3号峰得不到较好的分离，故色谱峰的分离达不到要求。[0054]对比例4
采用上述步骤一的方法，制备来源地分别是江西的正品钩藤(均经植物鉴别专家性状鉴别，并经DNA分子鉴别技术鉴定)检测溶液，采用步骤二的方法进行高效液相色谱检测，但将步骤二流动相洗脱液中磷酸缓冲液的浓度改为2.5 mmol/L、5 mmol/LUO mmol/L、20mmol/L,其他条件不变,液相色谱图如图11所示,从图11中可以看出，磷酸缓冲液的浓度为2.5 mmol/L时，检测得到的色谱图中峰宽增大，峰形有拖尾，而磷酸缓冲液的浓度为20mmol/L时，易缩短色谱柱的寿命，因而最优条件是磷酸缓冲液的浓度为5?10 mmol/L,色谱峰尖锐，色谱峰不拖尾。
[0055]对比例结果分析:
对比例广4中，分别改变了流动相的组成或配比、高效液相色谱检测参数，钩藤的高效液相检测均出现了峰重叠或拖尾现象，色谱峰无法充分分离；这会影响后续特征成分的分离鉴定，给钩藤指纹图谱的构建或不同品种钩藤的鉴定造成困难。不同种钩藤的生物碱成分不同，但又有较多的同分异构体，甚至立体异构体，上述对比例主要是针对正品钩藤各色谱峰的分离，后面还要保证每种钩藤各成分分离，其实更主要的是在同一梯度分离好每种钩藤样品各色谱峰的基础上，还要经过大量的研究实验优化梯度使不同种钩藤色谱峰彼此不干扰，以能在较短时间内(I小时)完成不同种钩藤鉴别，所以本发明的流动相的组成及配比是经过大量实验测试才能研究出来的。
【权利要求】
1.一种区分不同品种钩藤高效液相色谱检测方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)制备钩藤检测溶液； (2)高效液相色谱检测:用5μ m ODS-RP色谱柱，甲醇-乙腈-缓冲液为流动相洗脱液，流速:1.0ml/min ;检测波长:245nm和226nm ;进样量:20μ I ;柱温:35 °C;梯度洗脱程序如下: 时间Omin 洗脱液组成为甲醇12%、乙腈24%、缓冲液64% ； 时间15min 洗脱液组成为甲醇18%、乙腈26%、缓冲液56% ； 时间30min 洗脱液组成为甲醇30%、乙腈30%、缓冲液40% ； 时间60min 洗脱液组成为甲醇30%、乙腈30%、缓冲液40% ； 所述缓冲液为PH大于7的磷酸盐缓冲液或浓度不低于0.1%氨水溶液； (3)区分不同品种钩藤:根据钩藤的高效液相色谱图中特征色谱峰的相对保留时间及特征吸收波长来区分不同品种钩藤。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，钩藤检测溶液制备具体为:称取钩藤药材粉0.5?lg，加入氯仿:甲醇:氨水混合溶剂25ml，超声4(T50min，取滤液，低温浓缩后，残渣用70%甲醇水溶液稀释至2(T25ml，过滤，取滤液作为检测溶液；所述氯仿:甲醇:氨混合溶剂中，氯仿、甲醇与氨水的体积比为15:5:0.5。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，钩藤检测溶液制备具体为:称取钩藤药材粉0.5?lg，加入70%甲醇水溶液2(T25ml超声4(T50min，过滤，取滤液作为检测溶液。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述钩藤包括正品钩藤、大叶钩藤大叶钩藤、华钩藤华钩藤、无柄果钩藤、毛钩藤或攀茎钩藤。
5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液的浓度为5?10mmol/L。
6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(3)所述区分不同品种钩藤的具体方法为: 当钩藤为正品钩藤时，HPLC色谱图中特征色谱峰有9个，其相对钩藤碱的保留时间及特征吸收波长分别为 0.55min/226nm、0.58min/226nm、0.83min/246nm、0.87min/245nm、0.89min/245nm>1.00min/246nm>1.02min/226nm>1.04min/226nm>1.09min/226.2nm ； 当钩藤为大叶钩藤时，HPLC色谱图中特征色谱峰有4个，其相对钩藤碱的保留时间及特征吸收波长分别为 0.87min/245nm> 1.00min/246nm> 1.02min/245nm> 1.09min/246nm ；当钩藤为毛钩藤时，HPLC色谱图中特征色谱峰有6个，其相对钩藤碱的保留时间及特征吸收波长分别为 0.77min/234nm、0.82min/244nm、0.84min/239nm、0.91min/245nm、0.98min/243nm、1.08min/246nm ； 当钩藤为华钩藤时，HPLC色谱图中特征色谱峰有3个，其相对钩藤碱的保留时间及特征吸收波长分别为 0.69min/242nm、0.85min/243nm、0.99min/245nm ； 当钩藤为无柄果钩藤时，HPLC色谱图中特征色谱峰有2个，其相对钩藤碱的保留时间及特征吸收波长分别为0.87min/245nm、1.00min/246nm ； 当钩藤为攀茎钩藤时，HPLC色谱图中特征色谱峰有4个，其相对钩藤碱的保留时间及特征吸收波长分别为 0.694min/242nm、0.85min/243nm、0.99min/245nm、0.49min/243nm。
7.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述钩藤药材粉碎过40目筛。
【文档编号】G01N30/02GK103869010SQ201410065339
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2014年2月25日 优先权日:2014年2月25日
【发明者】曾常青, 黄样增, 陈其钊 申请人:广东药学院