一种液相色谱串联质谱方法在大规模吸烟人群样本生物监测3-乙基腺嘌呤的应用的制作方法
【专利摘要】一种液相色谱串联质谱方法在大规模吸烟人群样本生物监测3-乙基腺嘌呤的应用，包括以下具体过程：1）取样，招募吸烟者、非吸烟者志愿者，对志愿者进行筛选，采集志愿者尿液；2）逐一对志愿者尿液进行处理、测定，得到每一个志愿者尿液样品中3-乙基腺嘌呤的含量；3）将每一志愿者尿液样品的测定数据输入数据分析软件进行分析处理，找出吸烟者尿液中3-乙基腺嘌呤的含量规律。本发明通过对大规模志愿者的招募，大量尿液样品的保存条件及处理检测条件的优化，建立了分析、检测中国吸烟者尿液中3-乙基腺嘌呤的含量水平的应用方法，适合于分析大量的吸烟人群尿液中3-乙基腺嘌呤水平，为相应的样本生物监测研究提供了具体的数据支撑，具有十分重要意义。
【专利说明】一种液相色谱串联质谱方法在大规模吸烟人群样本生物监测3-乙基腺嘌呤的应用
[0001]【技术领域】:
本发明属于尿液样本的理化检验技术应用领域，主要涉及尿液中3-乙基腺嘌呤(3-EtA的测定技术应用领域，具体说是一种采用液相色谱-电喷雾电离-串联质谱仪(LC-ES1-MS/MS)测定尿液中3-乙基腺嘌呤(3_EtA)的方法的应用。
[0002]【背景技术】:
3-乙基腺嘌呤(3-EtA)是外源性化合物体内代谢生成的自由基与腺嘌呤结合后的产物。由于尿中内源性3-乙基腺嘌呤本底值低，又能较为准确的反映原型化合物的特性，因此作为生物监测指标广泛用于环境烷基化污染物的生物监测。据报道，尿液中3-乙基腺嘌呤(N3-ethyladenine，3-MeA)与吸烟者烟气接触水平有较强的相关性，能够用于评价烟气中有害成分亚硝胺的接触水平。
[0003]目前，关于尿液中DNA加合物的分析检测方法应用的报道较多，但是大规模采集中国吸烟者尿液并对其进行分析的未见报导。
【发明内容】
[0004]本发明的目的正是基于上述现有技术状况而提出的一种采用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)技术应用于分析大规模尿液样品中3-乙基腺嘌呤(3-EtA)的方法。该方法具有快速、准确，可靠等特点，可用于大规模吸烟者尿液中3-乙基腺嘌呤(3-EtA)的定性定量分析。
[0005]本发明的目的是通过以下技术方案来实现的:
一种液相色谱串联质谱方法在大规模吸烟人群样本生物监测3-乙基腺嘌呤的应用，其特征在于:包括以下具体过程:
(O 取样，招募吸烟者、非吸烟者志愿者，对志愿者进行筛选，采集入选志愿者24小时排泄的全部尿液收集存放于5L的聚丙烯桶中，每一志愿者尿液分别存放于_80°C超低温冰箱中保存；
(2)逐一对志愿者尿液进行处理、测定，得到每一个志愿者尿液样品中3-乙基腺嘌呤的含量，具体步骤如下:
测定的具体步骤如下:
a、样品前处理:尿液在室温状态下解冻并混合均匀，取4mL尿液，加入4mL超纯水，力口Λ100 μ L内标，内标为氘代-3-乙基腺嘌呤d5-3-EtA，内标浓度为100 ng/mL。用水浴锅调节温度到75-85°C，取超纯水稀释至8 mL后的尿液置于固相萃取柱中；固相萃取用WatersOasis MCX固相萃取柱，预先用2 mL甲醇、5 mL水溶液活化，上样量为8 mL，用2 mL 10%甲醇/水溶液淋洗，然后用I mL乙酸乙酯淋洗，最后用甲醇/乙酸乙酯/氨水混合液洗脱(具体配比为47.5: 47.5: 5)，收集洗脱液并于60 1:下用氮气吹至干，然后用100 yL水溶液溶解，供LC-MS/MS分离分析；
b、标准工作液的配制:用乙腈配制不同浓度的3-乙基腺嘌呤(3-EtA)标准工作溶液；C、液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)测定，吸取配制好的不同浓度的3-乙基腺嘌呤(3-EtA)的标准工作溶液，注入LC-MS/MS系统，得到线性回归方程，对样品待测液进行测定，测得分析物与内标峰面积的比值，代入一元线性回归方程，求得样品待测液中分析物的含量。在色谱测定过程中，选取了 Waters HILIC色谱柱(150 mm x 2.1 mm, 2.5 Mm),流动相体系选取A:乙腈和B:1Om mol/L甲酸铵/水溶液，A:B为95:5。洗脱条件:流动相A:乙腈溶液，pH 4.0,流动相B:1OmM甲酸铵/水溶液,pH 4.0, A:B为95:5 ;流速0.25 mL/min ；柱温25 ° C ;进样量3 PL，洗脱时间:0~20 min。
[0006]质谱条件:电喷雾离子源(ESI)，正离子扫描方式；喷雾(IS)电压为5500 V ;雾化气(Gasl)压力为 344.5 kPa(50 psi);气帘气(CUR)压力为 206.7 kPa(30 psi);辅助雾化气(Gas2)压力为310.0 kPa(45 psi);离子源温度(TEM)为500°C ;去蔟电压(DP)为85eV ;碰撞能(CE)为26eV ;驻留时间为40ms，监测离子对为3-EtA:164 — 136 (定量离子对)，164 — 119 (定性离子对);内标 d5-3-EtA 为 169 — 137。[0007](3)将每一志愿者尿液样品的测定数据输入数据分析软件进行分析处理，找出吸烟者尿液中3-乙基腺嘌呤的含量规律；所述数据分析软件为Office excel或SPSS统计分析软件。
[0008]本发明通过对大规模志愿者的招募，大量尿液样品的保存条件及处理检测条件的优化，建立了分析、检测中国吸烟者尿液中3-乙基腺嘌呤的含量水平的应用方法，适合于分析大量的吸烟人群尿液中3-乙基腺嘌呤(3-EtA水平。每个样本在20 min内就可完成
3-乙基腺嘌呤的检测，并使用Excel和SPSS软件对大规模检测样品进行分析，找出吸烟者尿液中3-乙基腺嘌呤的含量规律，为相应的样本生物监测研究提供了具体的数据支撑，具有十分重要意义。
[0009]本发明具体的测定过程进一步详述如下:
1、样品前处理
样品前处理:尿液在室温状态下解冻并混合均匀，取4 mL尿液，加入4mL超纯水，加入100 UL内标(100ng/mL)，用水浴锅调节温度到80°C。取超纯水稀释后的尿液置于10 mL固相萃取柱中。固相萃取选取Waters Oasis MCX (6 mL, 500 mg)小柱,预先用2 mL的甲醇，5 mL的水活化柱子，上样量为8 mL，用2 mL的10%的甲醇淋洗，然后I mL乙酸乙酯溶液淋洗，然后用I mL乙酸乙酯淋洗，最后用甲醇/乙酸乙酯/氨水(47.5: 47.5: 5)洗脱，收集洗脱液并于60 1:下用氮气吹至干，然后用100 111^水溶液溶解，供^:-1^/^3分离分析。
[0010]2、LC-MS/MS 测定
(I)LC-MS/MS 条件
色谱条件:Waters HILIC (150 mm x 2.1 mm, 2.5 Mm)色谱柱,流动相A:乙腈溶液,pH
4.0，流动相B:1OmM甲酸铵/水溶液，pH 4.0，Α:Β为95:5 ;流速0.25 mL/min;柱温25。C ；进样量3 μ?。洗脱时间:0~20 min。
[0011]质谱条件:电喷雾离子源(ESI)，正离子扫描方式；喷雾(IS)电压为5500 V ;雾化气(Gasl)压力为 344.5 kPa(50 psi);气帘气(CUR)压力为 206.7 kPa(30 psi);辅助雾化气(Gas2)压力为310.0 kPa(45 psi);离子源温度(TEM)为500°C;去蔟电压(DP)为85eV ；碰撞能(CE)为26eV ;驻留时间为40 ms。监测离子对及其相应的碰撞能量(CE)见表1。[0012]表1多反应监测模式下3-EtA及其氘代内标的部分质谱参数
【权利要求】
1.一种液相色谱串联质谱方法在大规模吸烟人群样本生物监测3-乙基腺嘌呤的应用，其特征在于:包括以下具体过程: 取样，招募吸烟者、非吸烟者志愿者，对志愿者进行筛选，采集入选志愿者24小时排泄的全部尿液收集存放于5L的聚丙烯桶中，每一志愿者尿液分别存放于_80°C超低温冰箱中保存； 逐一对志愿者尿液进行处理、测定，得到每一个志愿者尿液样品中3-乙基腺嘌呤的含量; 将每一志愿者尿液样品的测定数据输入数据分析软件进行分析处理，找出吸烟者尿液中3-乙基腺嘌呤的含量规律。
2.根据权利要求1所述的液相色谱串联质谱方法在大规模吸烟人群样本生物监测3-乙基腺嘌呤的应用，其特征在于:对志愿者尿液进行处理、测定的具体步骤如下: a、样品前处理:尿液在室温状态下解冻并混合均匀，取4mL尿液，加入4mL超纯水，加Λ 100 μ L内标,用水浴锅调节温度到75-85°C,取超纯水稀释至8 mL后的尿液置于固相萃取柱中；固相萃取用Waters Oasis MCX固相萃取柱，预先用2 mL甲醇、5 mL水溶液活化，上样量为8 mL，用2 mL 10%甲醇/水溶液淋洗，然后用I mL乙酸乙酯淋洗，最后用甲醇/乙酸乙酯/氨水混合液洗脱，收集洗脱液并于60 1:下用氮气吹至干，然后用100 yL水溶液溶解，供LC-MS/MS分离分析； b、标准工作液的配制:用乙腈配制不同浓度的3-乙基腺嘌呤(3-EtA)标准工作溶液； C、液相色谱-串联质谱(LC`-MS/MS)测定，吸取配制好的不同浓度的3-乙基腺嘌呤(3-EtA)的标准工作溶液，注入LC-MS/MS系统，得到线性回归方程，对样品待测液进行测定，测得分析物与内标峰面积的比值，代入一元线性回归方程，求得样品待测液中分析物的含量。
3.根据权利要求2所述的液相色谱串联质谱方法在大规模吸烟人群样本生物监测3-乙基腺嘌呤的应用，其特征在于:所述内标为氘代-3-乙基腺嘌呤，内标浓度为100 ng/mL。
4.根据权利要求2所述的液相色谱串联质谱方法在大规模吸烟人群样本生物监测3-乙基腺嘌呤的应用，其特征在于:所述甲醇/乙酸乙酯/氨水混合液的具体配比为47.5:47.5: 5。
5.根据权利要求2所述的液相色谱串联质谱方法在大规模吸烟人群样本生物监测3-乙基腺嘌呤的应用，其特征在于:在c步骤中，选取了 Waters HILIC色谱柱，规格150 mmX 2.1 mm, 2.5 Mm，流动相体系选取A:乙腈和B:1Om mol/L甲酸铵/水溶液，A:B为95:5。
6.根据权利要求2或5所述的液相色谱串联质谱方法在大规模吸烟人群样本生物监测3-乙基腺嘌呤的应用，其特征在于:色谱测定中的洗脱条件:流动相A:乙腈溶液，pH 4.0，流动相B =IOmM甲酸铵/水溶液，pH 4.0,Α:Β为95:5 ;流速0.25 mL/min ;柱温25 ° C ;进样量3 PL，洗脱时间:0~20 min。
7.根据权利要求2所述的液相色谱串联质谱方法在大规模吸烟人群样本生物监测3-乙基腺嘌呤的应用，其特征在于:质谱条件:电喷雾离子源，正离子扫描方式；喷雾电压为5500 V ;雾化气压力为344.5 kPa ;气帘气压力为206.7 kPa ;辅助雾化气压力为310.0kPa ;离子源温度为500°C ;去蔟电压为85eV ;碰撞能为26eV ;驻留时间为40 ms，监测离子对为3-EtA:164 — 136定量离子对，164 — 119定性离子对；内标d5-3_EtA为169 — 137。
8.根据权利要求1所述的液相色谱串联质谱方法在大规模吸烟人群样本生物监测3-乙基腺嘌呤的应用，其特征在于:步骤(3)中所述的数据分析软件为Office excel或SPSS统计分析软件。`
【文档编号】G01N30/02GK103822991SQ201410094977
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2014年3月14日 优先权日:2014年3月14日
【发明者】田永峰, 王安, 胡清源, 侯宏卫, 刘勇, 陈欢, 杨进, 韩书磊, 刘彤, 张小涛, 石龙凯, 刘洋 申请人:国家烟草质量监督检验中心, 中国科学院合肥物质科学研究院