细胞分析方法以及装置制造方法
细胞分析方法以及装置制造方法
【专利摘要】本发明提供细胞分析方法。该方法包括：温度调整工序，将保存有细胞的保存液调整为规定的温度；以及测定工序，对在所述温度调整工序中调整了温度的保存液中保存的细胞照射光来取得光学信息。
【专利说明】细胞分析方法以及装置
【技术领域】
[0001]本发明涉及分析从生物体提取的细胞的细胞分析方法以及装置。
【背景技术】
[0002]以往，已知自动地分析细胞的DNA量，并根据该DNA量提供与细胞的癌化有关的信息的分析装置。
[0003]例如，在US2009/091746中，公开了对从被验者提取的细胞实施PI染色等处理来调制测定试样，使所调制的测定试样流入到流式单元，对在该流式单元中流过的测定试样照射光，从而针对各个细胞取得荧光信号、散射光信号，解析各信号的波形，从而抽出反映了 DNA量、核的大小、细胞的大小等的特征参数，使用该特征参数来判别细胞的癌化/异型化的细胞分析装置。
[0004]另外，在US2013/217110中，记载了将收容保存有细胞的包含醇的保存液的生物体容器设置到细胞分析装置，在该装置内将生物体容器内的保存液置换为稀释液之后进行PI染色处理等，调制用于流入到流式单元的测定试样。
【发明内容】
[0005]本发明的保护范围仅由权利要求书限定，并且不受任何
【发明内容】
中的内容的影响。
[0006]在US2013/217110中，将所分析的细胞保存到包含醇的保存液中。这样，在保存液中保存细胞的情况下，保存有细胞的保存液的保存温度根据医院、检查设施而不同，有时在室温下保存，也有时冷藏保存。另外，在将细胞从医院输送到检查中心等的情况下，有时保存温度根据输送环境而变动。这样，保存液的保存温度根据保存条件、输送条件等而不同。
[0007]本申请的
【发明者】得知在将保存有细胞的保存液供给到US2013/217110记载那样的细胞分析装置来分析了细胞时，根据保存液的保存温度的差异，在所测定的光学信息(荧光信息、散射光信息)中产生偏差。
[0008]本发明的目的在于提供一种能够抑制保存有细胞的保存液的保存温度的差异所引起的光学信息的偏差的细胞分析方法以及装置。
[0009]本申请的
【发明者】针对保存有细胞的保存液的保存温度与用细胞分析装置取得的光学信息的关系进行了潜心研究的结果，发现通过将对细胞分析装置供给的保存有细胞的保存液调整为规定的温度，能够抑制在对细胞分析装置供给了该保存液中保存的细胞时取得的光学信息的偏差，完成了本发明。
[0010]S卩，本发明的细胞分析方法包括:包括:温度调整工序，将保存有细胞的保存液调整为规定的温度；以及测定工序，对在所述温度调整工序中调整了温度的保存液中保存的细胞照射光来取得光学信息。
[0011]根据本发明的细胞分析方法，通过包括将保存液调整为规定的温度的工序，无论保存液的保存温度如何，都能够适当地抑制在测定工序中取得的光学信息的偏差。因此，即使在使用了该光学信息的之后的处理中，也能够得到排除了保存液的保存温度的影响的正确的结果。
[0012]本发明的细胞分析装置具备:温度调整部，将保存有细胞的保存液调整为规定的温度；测定试样调制部，通过将由所述温度调整部调整了温度的保存液置换为稀释液，调制测定试样；以及测定部，对由所述测定试样调制部调制的测定试样中包含的细胞照射光来取得光学信息。
[0013]如上所述，通过具备将保存液调整为规定的温度的温度调整部，无论对细胞分析装置供给的保存液的保存温度如何，都能够适当地抑制由测定部取得的光学信息的偏差。因此，即使在使用了该光学信息的之后的处理中，也能够得到未受到所述保存温度的影响的正确的结果。
[0014]根据本发明，能够抑制保存有细胞的保存液的保存温度的差异所引起的光学信息的偏差。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1是示出本发明的一个实施方式的细胞分析装置的整体结构的立体图。
[0016]图2是示意地示出细胞分析装置中的测定装置的内部结构的说明图。
[0017]图3是示出流式细胞仪的结构的说明图。
[0018]图4是示出细胞分析装置的动作步骤的流程图。
[0019]图5 Ca)是说明在主测定中得到的前方散射光信号(FSC)和侧方荧光信号(SFL)的图、(b)是示意地示出子宫颈部的上皮细胞的放大剖面的图、(C)是示出N/C比与细胞的大小的关系的图形。
[0020]图6 (a)是示出细胞周期中的DNA量与细胞数的关系的说明图、(b)是示出针对每个细胞周期变化的DNA量的图。
[0021]图7是示出N/C比与细胞宽(细胞的大小)的关系的分布图。
[0022]图8是示出DNA量与细胞数的关系的直方图。
[0023]图9是示出与子宫颈部的上皮细胞有关的实验1-1的结果的图形。
[0024]图10是示出与子宫颈部的上皮细胞有关的实验1-2的结果的图形。
[0025]图11是示出与子宫颈部的上皮细胞有关的实验1-3的结果的图形。
[0026]图12是示出与子宫颈部的上皮细胞有关的实验1-4的结果的图形。
[0027]图13是示出与子宫颈部的上皮细胞有关的实验1-5的结果的图形。
[0028]图14是示出与子宫颈部的上皮细胞有关的实验1-6的结果的图形。
[0029]图15是示出与子宫颈部的上皮细胞有关的实验1-7的结果的图形。
[0030]图16是示出与子宫颈部的上皮细胞有关的实验2的结果的图形。
[0031]图17是示出与口腔粘膜的上皮细胞有关的实验3-1的结果的图形。
[0032]图18是示出与口腔粘膜的上皮细胞有关的实验3-2的结果的图形。
[0033]图19是示出与口腔粘膜的上皮细胞有关的实验3-3的结果的图形。
[0034]【符号说明】
[0035]1:细胞分析装置；2:测定装置；2a:检体设置部；3:数据处理装置(信息处理部)；10:温度调整部；13:副检测部(测定部)；14:辨别/置换部；19:第I试剂添加部(测定试样调制部)；20:第2试剂添加部(测定试样调制部)；22:主检测部(测定部)；23:容器清洗部
【具体实施方式】
[0036]下面参考【专利附图】
【附图说明】本发明的优选实施方式。
[0037]图1是示出本发明的一个实施方式的细胞分析装置的整体结构的立体图。
[0038]本实施方式的细胞分析装置I使包含从患者(被验者)提取的细胞(生物体试样)的测定试样流入到流式单元中，对在流式单元中流过的测定试样照射激光，检测来自测定试样的光(前方散射光、侧方散射光、侧方荧光)并分析其光信号，从而判定是否包括癌化或者处于其过程的细胞(以下将它们还总称为“癌化细胞”)。更具体而言，细胞分析装置I被用于使用从患者提取的子宫颈部的上皮细胞来筛查子宫颈癌。
[0039]如图1所示，细胞分析装置I具备:测定装置2，进行从患者提取的生物体试样的测定等；以及数据处理装置3，与该测定装置2连接，进行测定结果的分析以及显示(输出)等。在测定装置2的前表面，设置了用于设置多个保存有从患者提取的生物体试样(细胞)的、收容以甲醇为主成分的保存液的试样容器4 (参照图2)的检体设置部2a。数据处理装置3具备输入部31、显示部32、以及控制部33。
[0040][测定装置2的结构]
[0041]图2是示意地示出细胞分析装置中的测定装置的内部结构的说明图。
[0042]如图2所示，检体设置部2a将设置了多个试样容器4的架子4a依次搬送至利用检体移液管部11的试样的吸引位置。
[0043]检体移液管部11将试样容器4内的试样移送到温度调整部10。另外，检体移液管部11将温度调整部10内的试样移送到第I分散部12。进而，检体移液管部11将第I分散部12内的试样移送到副检测部13和辨别/置换部14。另外，检体移液管部11将在辨别/置换部14中浓缩了的浓缩液供给到测定试样容器5。检体移液管部11构成为能够向温度调整部10、第I分散部12的试样收容部12a、副检测部13的试样取入部13a、辨别/置换部
14、以及定位到试样交换部Ilb的测定试样容器5的上方位置移动。
[0044]检体移液管部11构成为具有进行试样的吸引以及吐出的移液管Ila,能够通过未图示的检体定量部(驱动定量缸、定量缸内的活塞的马达等)对试样进行定量而将规定量的试样供给到上述各部。
[0045]温度调整部10将从检体设置部2a的试样容器4移送的保存液调整为规定的温度。具体而言，温度调整部10构成为具备设置温度调整用的试样容器的试样设置部10a，通过对该试样设置部IOa内的试样容器进行加热来调整其内部的保存液的温度。
[0046]第I分散部12对试样执行用于使在试样中包含的凝集细胞分散的第I分散处理。具体而言，第I分散处理是对凝集细胞赋予剪切力而使其分散的剪切力赋予处理。第I分散部12构成为包括能够收容试样的试样收容部12a，针对对试样收容部12a供给的试样中的凝集细胞机械性地赋予剪切力。
[0047]副检测部13在利用主检测部22的主测定之前进行试样的浓度测定。副检测部13采用与后述主检测部22大致相同的结构的流式细胞仪40 (参照图3 (a))。
[0048]辨别/置换部14是接受通过第I分散部12实施了第I分散处理之后的试样，将在试样中包含的以甲醇为主成分的保存液用稀释液置换(稀释)。具体而言，利用使液体通过但不使细胞通过的过滤器，将试样中包含的以甲醇为主成分的保存液去除规定的程度，添加缓冲液。由此，保存液中的甲醇所致的向后述DNA的染色的影响变小，所以能够良好地对测定对象细胞的DNA进行染色。进而，辨别/置换部14辨别试样中包含的测定对象细胞(从被验者提取的子宫颈部的上皮细胞)、和其以外的细胞(红血球、白血球、细菌等)以及夹杂物。进而，辨别/置换部14为了得到在利用主检测部22的测定所需的细胞测定数，进行试样中含有的测定对象细胞的浓缩。为了处理的高效化，设置了 2个辨别/置换部14。
[0049]容器移送部15通过剪刀状的夹持部15a夹持设置于反应部18的测定试样容器5，移送到试样交换部lib、第2分散部16、液体去除部17、以及反应部18。容器移送部15构成为使夹持部15a沿着规定的圆周状轨迹移动。另外，容器移送部15构成为能够使夹持部15a在上下方向上移动。试样交换部lib、第2分散部16、液体去除部17、以及反应部18配置于该圆周状轨迹上。由此，能够通过容器移送部15的夹持部15a夹持设置于反应部18的测定试样容器5，移送到圆周状轨迹上的各部。
[0050]第2分散部16针对通过第I分散部12执行了第I分散处理的试样，执行与第I分散处理不同的第2分散处理。具体而言，第2分散部16构成为执行利用第I分散部12的第I分散处理，对在辨别/置换部14中浓缩了(提高了测定对象细胞的浓度)的试样赋予超声波振动。通过第2分散部16,在第I分散处理之后残存的凝集细胞被分散为单一细胞。
[0051]液体去除部17在通过第2分散部16执行了第2分散处理之后，将测定试样容器5的外表面上附着的液分去除(去水)。第2分散处理是在测定试样容器5浸溃到液体中的状态下执行的。液体去除部17构成为通过对测定试样容器5的外表面供给空气流，去除在测定试样容器5的外表面上附着的水滴。由此，在将测定试样容器5设置到反应部18等各部时，液体向各部的附着被防止。
[0052]反应部18促进测定试样容器5内的试样、和由第I试剂添加部19以及第2试剂添加部20添加的试剂的反应。反应部18具备构成为能够通过未图示的驱动部旋转的圆形的旋转平台18a。在旋转平台18a的外周缘部中，设置了用于设置测定试样容器5的多个保持部18b。在该保持部18b中，设置测定试样容器5。构成为通过旋转平台18a的旋转得到的保持部18b的轨迹、和容器移送部15的夹持部15a的圆周状轨迹在规定位置交叉，容器移送部15在该交叉位置将测定试样容器5设置到保持部18b中。反应部18将设置于保持部18b中的测定试样容器5加热到规定温度(约37°C)，促进试样和试剂的反应。
[0053]第I试剂添加部19和第2试剂添加部20向设置于保持部18b中的测定试样容器5内供给试剂。第I试剂添加部19和第2试剂添加部20设置于旋转平台18a的周缘部附近的位置，分别具有能够移动至在旋转平台18a中设置的测定试样容器5的上方的位置P1、P2的供给部19a、20a。由此，在通过旋转平台18a向位置P1、P2搬送了测定试样容器5时，能够从供给部19a、20a向测定试样容器5内添加规定量的试剂。
[0054]由第I试剂添加部19添加的试剂是用于对细胞进行RNA去除处理的RNase。由第2试剂添加部20添加的试剂是用于对细胞进行DNA染色处理的染色液。通过RNA去除处理，细胞中的RNA被分解，能够仅测定细胞核的DNA。DNA染色处理是通过作为包含色素的荧光染色液的碘化丙啶(PI)进行的。通过DNA染色处理，对细胞内的核选择性地实施染色。由此，能够检测来自核的荧光。另外，本发明中的“测定试样调制部”是指，在经过温度调整部10之后直至到达主检测部22的期间进行生物体试样的调制的部位，在本实施方式的情况下，包括分散部12、16、辨别/置换部14、反应部18、试剂添加部19、20。
[0055]试样吸引部21吸引设置于保持部18b中的测定试样容器5内的试样(测定试样)，并将所吸引的测定试样移送到主检测部22。试样吸引部21设置于旋转平台18a的周缘部附近的位置，具有能够移动至设置于旋转平台18a上的测定试样容器5的上方的位置P3的移液管21a。由此，试样吸引部21在通过旋转平台18a向位置P3搬送了测定试样容器5时，能够吸引测定试样容器5内的测定试样。另外，试样吸引部21构成为经由未图示的流路，连接到主检测部22的流式单元43 (参照图3 (a))，能够将由移液管21a吸引的测定试样供给到主检测部22的流式单元43。
[0056]主检测部22具备用于检测来自测定试样的光(前方散射光、侧方散射光、侧方荧光)的流式细胞仪40，将基于各光的信号(光学信号)输出到后级的电路。在后面，参照图3(a)、(b)来说明流式细胞仪40。
[0057]容器清洗部23对通过试样吸引部21将测定试样供给到主检测部22之后的测定试样容器5的内部进行清洗。容器清洗部23构成为通过向在旋转平台18a的保持部18b中保持的测定试样容器5内吐出清洗液，对测定试样容器5的内部进行清洗。由此，在之后的测定处理中使用了相同的测定试样容器5的情况下，能够抑制与其他试样的污染。
[0058]图3 Ca)是示出主检测部22的流式细胞仪40的结构的图。如图3所示，从半导体激光器41出射的激光通过包括多个透镜的透镜系42被聚光到在流式单元43中流过的测定试样。对流式单元43，如上所述，供给通过试样吸引部21的移液管21a吸引了的试样。
[0059]透镜系42具有如图3 (b)所示从半导体激光器41侧(图3 (a)、(b)的左侧)依次配置的准直透镜42a、柱面透镜系(平凸柱面透镜42b+两个凹柱面透镜42c)、以及会聚透镜系(会聚透镜42d+会聚透镜42e)。
[0060]聚光透镜44将测定试样中的细胞的前方散射光聚光到由光电二极管45构成的散射光检测器。侧方光用的聚光透镜46对测定对象细胞以及该细胞中的核的侧方散射光和侧方荧光进行聚光，导入到分色镜47。分色镜47使侧方散射光向光电倍增管(光电子倍增管)48反射，并且使侧方荧光向光电倍增管(光电子倍增管)49的一方透射。这样，侧方散射光被聚光到光电倍增管48，侧方荧光被聚光到光电倍增管49。这些光反映了测定试样中的细胞以及核的特征。
[0061]光电二极管45和光电倍增管48、49将所受光的光信号变换为电信号，分别输出前方散射光信号(FSC)、侧方散射光信号(SSC)、以及侧方荧光信号(SFL)。这些输出信号通过未图示的前置放大器放大，被输出到测定装置2的控制部24(参照图2)。该控制部24具有处理从光电二极管45以及光电倍增管48、49输出的光学信号的功能、控制主检测部22以及副检测部13的动作的功能、控制进行试样的调制的各部2a、10?12、14?21、23的动作的功能、在与数据处理装置3之间进行各种信息的发送接收的功能等。
[0062]控制部24包括微处理器等运算部、由ROM、RAM等构成的存储部。在存储部中，储存用于控制各检测部22、13、进行试样调制的各部2a、10?12、14?21、23的动作的控制程序、各种数据。将由测定装置2的控制部24处理的各信号FSC、SSC、SFL经由通信部发送到数据处理装置3。
[0063]主检测部22如上所述具备图3 Ca)所示的流式细胞仪40，从测定试样，输出前方散射光信号(FSC)、侧方散射光信号(SSC)、以及侧方荧光信号(SFL)。控制部24针对来自主检测部22的输出信号执行必要的信号处理。
[0064]另外，副检测部13采用与主检测部22大致相同的结构的流式细胞仪40，所以关于结构，省略说明。副检测部13在利用主检测部22的主测定之前进行试样的浓度测定。在本实施方式中，副检测部13构成为取得前方散射光信号(FSC),输出用于根据前方散射光信号对与上皮细胞相应的大小的细胞的数量进行计数的信号。从副检测部13输出的前方散射信号FSC被输入到控制部24并被处理。
[0065][数据处理装置的结构]
[0066]如图1所示，数据处理装置3由例如笔记本PC、桌面PC等个人计算机构成，包括输入部31、显示部32、以及控制部33。控制部33具备CPU、由ROM、RAM及硬盘等构成的存储部、CD-ROM驱动器等读出装置、以及各种输入输出接口等。在控制部33的存储部中，除了操作系统以及应用程序等各种程序以外，还安装了实施向图2所示的测定装置2的控制部24的动作命令发送、由测定装置2进行的测定结果的接收以及分析处理、以及所处理的分析结果的显示等的操作程序。另外，数据处理装置3与测定装置2的控制部24可通信地连接，能够在测定装置2与数据处理装置3之间进行数据的发送接收。
[0067]数据处理装置3的CPU通过执行在存储部中安装的程序，根据各信号FSC、SSC、SFL,取得前方散射光强度、侧方荧光强度等特征参数，根据这些特征参数，制作用于分析细胞、核的频度分布数据。然后，数据处理装置3的CPU根据该频度分布数据，进行测定试样中的粒子的辨别处理，判定癌化。
[0068][由细胞分析装置I实施的分析步骤]
[0069]在通过细胞分析装置I分析时，由操作者将收容有生物体试样(细胞)、和以甲醇为主成分的保存液的试样容器4设置到检体设置部2a (参照图2)，开始利用细胞分析装置I的分析。以下，参照图4，说明利用细胞分析装置I的分析的步骤。
[0070]如果开始了测定，则首先通过温度调整部10，进行保存液的温度调整。具体而言，通过检体移液管部11吸引设置于检体设置部2a中的试样容器4内的试样，供给到设置于试样设置部IOa中的试样容器。然后，以使试样容器中的保存液成为规定的温度的方式，调整温度(步骤SI)。温度调整部10中的调整温度成为与设置细胞分析装置I的室内的温度(设置环境温度)大致相同或者比其高的高温。设置细胞分析装置I的室内的温度通常是22°C?25°C程度(最大30°C程度)，相对于此，本实施方式的温度调整部10构成为将保存液加热到约37°C的温度。另外，温度调整部10构成为对保存液加热10分钟。另外，关于为了抑制保存温度的差异所致的光学信息的偏差而调整了温度的保存液的温度，只要是25°C?50°C的范围，则没有特别限制。根据进一步抑制保存温度的差异所致的光学信息的偏差的观点，优选为30°C?45°C的范围，更优选为35°C?45°C的范围，进一步优选为35°C?40°C的范围。
[0071]通过这样的温度调整部10中的保存液的温度调整，无论对细胞分析装置I供给之前的保存液的保存温度如何，都能够将保存液调整为大致恒定的温度，促进保存液中的细胞的醇固定，使细胞稳定化。由此，能够抑制之后在主检测部22、副检测部13中测定的光学信号(光学信息)的温度所致的偏差。另外，通过实验验证了由于保存液的保存温度的差异而在光学信号中产生偏差、以及能够通过保存液的温度调整抑制该光学信号的偏差。关于该实验的详细，将后述。另外，以能够有效地抑制光学信号的偏差的方式，根据所述实验的结果，使本实施方式的由温度调整部10实施的保存液的调整温度、调整时间适当化。
[0072]接下来，针对由温度调整部10调整了温度的保存液中保存的生物体试样，通过第I分散部12进行试样中的凝集细胞的分散处理(第I分散处理)(步骤S2)。具体而言，通过检体移液管部11吸引在温度调整部10的试样设置部1a中设置的试样容器内的试样，供给到试样收容部12a内。通过第I分散部12分散对试样收容部12a供给的试样。
[0073]如果第I分散处理结束，则通过检体移液管部11，将已分散的试样供给到副检测部13的试样取入部13a，向与图3 (a)的流式单元43同样的副检测部13的流式单元，流入规定量的已分散的试样。在副检测部13中，通过流式细胞法，进行在试样中包含的上皮细胞的数量的检测(预测定)(步骤S3)。在本实施方式中，根据上皮细胞的细胞数、和对副检测部13供给的试样的体积，计算该试样的浓度。
[0074]接下来，根据所计算的浓度，通过控制部24，决定用于调制在主测定中使用的测定试样的试样的吸引量(步骤S4)。即，根据预测定中使用的试样的浓度(每单位体积的细胞的数量)、和为了主测定中的癌细胞检测而所需的上皮细胞的细胞数，运算为了进行主测定而所需的试样的液量。在本实施方式中,对主检测部22的流式单元43供给的上皮细胞的数量是规定的数量(A)。在该情况下，对辨别/置换部14供给的试样中的上皮细胞的数量需要是比所述规定的数量(A)更多的数量(B)。因此，以将比所述规定的数量(A)多的数量
(B)的上皮细胞供给到辨别/置换部14的方式，运算步骤S4中的试样的液量。
[0075]接下来，针对所运算的液量的试样，执行辨别/置换处理(步骤S5)。S卩，通过控制部24驱动检体移液管部11，从第I分散部12的试样收容部12a，将第I分散处理后的试样吸引所运算的液量。通过将所吸引的试样供给到辨别/置换部14，开始辨别/置换处理。
[0076]接下来，通过第2分散部16进行试样中的凝集细胞的分散处理(第2分散处理)(步骤S6)。具体而言，容器移送部15将在反应部18的保持部18b中设置的测定试样容器5夹持并取出，定位到试样交换部lib。然后，将从辨别/置换部14通过检体移液管部11吸引了的试样供给到定位于试样交换部Ilb的测定试样容器5。之后，将该测定试样容器5通过容器移送部15移送到第2分散部16，执行第2分散处理。
[0077]如果将包括第2分散处理之后的试样的测定试样容器5设置到反应部18的保持部18b，则通过第I试剂添加部19添加试剂(包括RNase。以下将该试剂还称为RNA去除剂)，通过反应部18加热，而进行测定试样容器5内的测定对象细胞的RNA去除处理(步骤S7)。在RNA去除处理之后，通过第2试剂添加部20添加试剂(染色液)，通过反应部18加热，而进行测定试样容器5内的测定对象细胞的DNA染色处理(步骤S8)。在本实施方式中，通过预测定，在主测定中必要的有意义细胞数在某种程度上被保持为恒定，所以关于对细胞进行染色时的染色的程度，每当测定时不易产生偏差。另外，在本实施方式中，在温度调整工序(步骤SI)中保存液的温度被调整为大致恒定，从而保存液中的细胞中包含的染色质的变性被促进，从而细胞稳定化，染色的程度不易产生偏差。
[0078]接下来，通过试样吸引部21吸引已DNA染色处理的测定试样。将所吸引的测定试样送到主检测部22的流式单元43 (参照图3 (a))，进行针对测定试样中的细胞的主测定(步骤S9)。
[0079]在主测定之后，将所得到的测定数据从测定装置2的控制部24发送到数据处理装置3 (步骤S10)。具体而言，将针对测定试样中的各细胞得到的前方散射光信号(FSC)、侧方散射光信号(SSC)、以及侧方荧光信号(SFL)发送到数据处理装置3。数据处理装置3的控制部33 (CPU)始终判定是否从测定装置2接收到测定数据。如果从测定装置2接收到测定数据，则通过数据处理装置3的控制部33，根据该测定数据进行分析处理(步骤S11)。另外，关于步骤Sll的分析处理的详细，在后面参照图7以及图8来说明。
[0080][癌化信息的取得步骤]
[0081]接下来，说明本实施方式中的癌化信息的取得步骤。
[0082]图5 Ca)是说明在主测定(图4的步骤S9)中得到的前方散射光信号(FSC)和侧方荧光信号(SFL)的图。图5 (a)示出包含细胞核的细胞的示意图、和从该细胞得到的前方散射光信号的波形以及侧方突光信号的波形。纵轴不出光的强度。前方散射光强度的波形的宽度表示示出细胞的宽度的数值(细胞的大小C)，侧方荧光强度的波形的宽度表示示出细胞核的宽度的数值(细胞核的大小N)。如斜线所示，通过侧方荧光强度的波形和规定的基线决定的区域的面积表示细胞的DNA量。
[0083]图5 (b)是示意地示出子宫颈部的上皮细胞的放大剖面的图。如图5 (b)所示，在子宫颈部中，从基底膜侧，依次形成了由基底细胞形成的层(基底层)、由副基底细胞形成的层(副基底层)、由中层细胞形成的层(中层)、以及由表层细胞形成的层(表层)。基底膜附近的基底细胞分化为副基底细胞、副基底细胞分化为中层细胞、中层细胞分化为表层细胞。
[0084]在达到癌的过程中，基底细胞获得异常形成而成为异型细胞。异型细胞获得增殖能力，成为从基底层侧占据表层侧。因此，在达到癌的初始阶段中，在子宫颈部的上皮细胞中，在基底层、副基底层、以及中层中存在的细胞中，存在大量癌化细胞。相逆地，在达到癌的初始阶段中，在子宫颈部的上皮细胞的表层侧存在的细胞中，癌化细胞极其少。
[0085]可知在上皮细胞中，随着从表层侧的层朝向基底膜侧的层，细胞的大小依次变小，但细胞核的大小依次变大。因此，细胞核的大小(N)相对细胞的大小(C)的比例(以下称为“N/C比”)也随着从表层侧的层朝向基底膜侧的层依次变大。因此，N/C比与细胞的大小C成为例如图5 (c)所示那样的关系。另外，能够从被验者提取的子宫颈部的上皮细胞是副基底细胞、中层细胞、以及表层细胞，前癌病变如上述那样在基底细胞侧早期出现。
[0086]图6 (a)是示出细胞周期中的DNA量与细胞数的关系的图。如图6 (a)所示，细胞依照一定的循环(细胞周期)，经由DNA复制、染色体的分配、核分裂、细胞质分裂等事件，成为2个细胞而返回到出发点。关于细胞周期，能够根据其阶段，分成Gl期(用于进入到S期的准备和检验的时期)、S期(DNA合成期)、G2期(用于进入到M期的准备和检验的时期)、以及M期(分裂期)这4期，如果对该4期加上细胞的增殖停止的GO期(停止期)，则细胞处于5个期中的某一个阶段。
[0087]在细胞依照细胞周期增殖时，细胞内的核的染色体也增加，所以通过测定细胞的DNA量，能够推测该细胞处于细胞周期的哪个状态。在正常的细胞的情况下，如图6 (b)所示，G0/G1期中的DNA量是恒定的值(2C)，接着在S期中DNA量逐渐增加，之后如果进入到G2期，则成为恒定的值(4C)，该值在M期中也被维持。此处，C表示每个单倍体的染色体组DNA含量。即，2C表示每个单倍体的染色体组DNA含量的2倍的DNA量、4C表示每个单倍体的染色体组DNA含量的4倍的DNA量。细胞周期的GO期或者Gl期的正常细胞的DNA量成为2C。于是，如果针对正常的细胞制作了 DNA量的直方图，则成为图6 (a)所示那样的直方图。最高的峰值对应于处于DNA量最少的G0/G1期的细胞，接下来高的峰值对应于处于DNA量最多的G2/M期的细胞，它们之间对应于处于S期的细胞。
[0088]在正常的细胞的情况下，处于S期和G2/M期的状态的细胞的数量相比于处于GO/Gl期的细胞的数量极其少。但是，在癌化细胞的情况下，处于S期和G2/M期的状态的细胞的数量比正常的细胞更多。另外，在癌化细胞的情况下，细胞的染色体的数量也变多，所以DNA量也变多。
[0089]因此，在本实施方式中，在癌化的判定中，使用着眼于N/C比和DNA量的判定方法。
[0090]具体而言，抽出N/C比大的细胞。接下来，抽出这样抽出的细胞群中的、DNA量多的细胞和DNA量少的细胞，从而有效地抽出是癌化细胞的可能性高的细胞(第I细胞)和是癌化细胞的可能性低的细胞(第2细胞)。一般，如果组织的癌化发展，则第I细胞的数量增力口，第2细胞的数量减少。因此，两个细胞数的比在组织是正常的情况和癌化了的情况下大幅不同。根据该比，进行癌化的判定。这样，如果使用增减倾向相互相逆的2个细胞数的比，则即使测定试样中包含的测定对象细胞比较少，也能够得到可靠性高的判定结果。
[0091]具体而言，数据处理装置3的控制部33制作表示图7所示那样的N/C比与细胞的大小(细胞宽)的关系的分布图，在该分布图中抽出细胞的大小处于规定的范围(例如1 μ m以上50 μ m以下的范围)、并且N/C比处于规定的范围(例如0.2以上I以下的范围)的细胞的测定数据而作为分析对象。由此，能够从分析对象去除癌化细胞少的表层中存在的表层细胞。另外，也可以在进行上述抽出之前，进行分离白血球和上皮细胞的测定数据的处理、分离单一上皮细胞和凝集上皮细胞的测定数据的处理等。另外，也可以不考虑细胞的大小，而仅使用N/C比的范围来抽出细胞的测定数据。
[0092]接下来，数据处理装置3的控制部33针对所抽出的细胞的测定数据，制作图8所示的直方图。在该直方图中，横轴表示DNA量,纵轴表示细胞数。
[0093]接下来，数据处理装置3的控制部33在图8的直方图中，取得DNA量是正常细胞的S期以上的细胞数NI (具有处于大于b且c以下的范围内的DNA量的细胞数)、即如图6(a)所示具有超过细胞周期处于GO期或者Gl期的正常细胞的DNA量的DNA量的细胞的数量。进而，控制部33取得DNA量是正常细胞的2C的细胞的数量N2 (具有处于a以上b以下的范围的DNA量的细胞数)、即具有细胞周期处于GO期或者Gl期的正常细胞的DNA量的细胞的数量。
[0094]接下来，数据处理装置3的控制部33取得将DNA量是S期以上的细胞的数量NI除以DNA量是2C的细胞的数量N2而得到的值(两个细胞数N1、N2的比(N1/N2))。然后，控制部33通过将两个细胞数N1、N2的比与规定的阈值进行比较，来判定癌化。即，如果NI/N2的值是规定的阈值以上，则将癌化的判定设为阳性，如果N1/N2的值小于规定的阈值，则将癌化的判定设为阴性。
[0095]之后，数据处理装置3的控制部33将与癌化有关的信息显示于显示部32、或者输出到外部。例如，在癌化的判定是阳性的情况下，在显示部32中，显示需要再检查的意思，在癌化的判定是阴性的情况下，在显示部32中，显示不需要再检查的意思。
[0096][关于温度调整部10中的温度调整条件]
[0097]如上所述，测定装置2的温度调整部10在将生物体试样送到主检测部22或者副检测部13之前，将保存液的温度调整为规定的温度。在主检测部22以及副检测部13中取得的光学信号由于保存液的温度的差异而产生偏差，其结果，有无法正确地进行使用了光学信号的癌化的判定可能性。例如，如果在侧方荧光信号、前方散射光信号中产生了偏差，则在细胞核的大小N、细胞的大小C中也产生偏差，有对图7所示的分布图的制作造成恶劣影响的可能性。另外，如果在侧方荧光信号中产生了偏差，则在细胞的DNA量中也产生偏差，有无法正确地制作图8所示的直方图，而对癌化的判定造成恶劣影响的可能性。特别，侧方荧光信号的强度根据DNA的染色的程度而变化，所以保存液的温度的差异对DNA的染色的程度造成影响。
[0098]本
【发明者】通过以下的实验验证了通过将保存有生物体试样的保存液调整为规定的温度范围，能够抑制光学信号的偏差。同时，求出为了抑制光学信号的偏差而有效的调整温度以及调整时间。另外，还验证了使保存液的醇浓度变化了时的温度调整的效果。以下，详细说明该实验。另外，以下的实验I以及实验2是与子宫颈部中的上皮细胞有关的实验，实验3是与口腔粘膜中的上皮细胞(以下还称为“口腔细胞”)有关的实验。
[0099]< 实验 1>
[0100]以下，示出实验I中的概要。
[0101]1.材料
[0102](生物体试样)在作为生物体试样的培养细胞中，使用了从AmericanType CultureCollect1n公司(ATCC公司)获得的Hela细胞。
[0103](染色液)使用了将SIGMA公司的PI(碘化丙啶)用乙二醇稀释了的染色液。
[0104](RNA去除剂)使用了将SIGMA公司的RNaseA用Tris盐酸水溶液(pH7.51mM)稀释了的RNA去除剂。
[0105](保存液)通过实验内容，使用了以下的4个模式的保存液。
[0106]保存液1:甲醇40vol%、醋酸0.8vol%的水溶液
[0107]保存液2:乙醇40vol%、醋酸0.8vol%的水溶液
[0108]保存液3:甲醇25~80vol%、醋酸0.8vol%的水溶液
[0109]保存液4:乙醇25~80vol%、醋酸0.8vol%的水溶液
[0110](稀释液)使用了Tris盐酸水溶液(pH7.51mM)。
[0111]2.条件
[0112](保存条件)将保存了培养细胞的保存液在4°C或者30°C下静置24个小时。在临床现场中包含细胞的保存液被保存至检查，对于保存温度一般设想4°C~30°C。本实验中的保存液的静置是根据一般设想的保存温度的下限(4°C)或者上限(30°C)的温度进行的。
[0113](温度调整条件)在如上所述静置之后，按照以下的3个模式中的某一个调整了保存液的温度。
[0114]?模式1:在30°C~50°C的范围内选择的多个调整温度中的某一个温度下加热10分钟
[0115].模式2:在调整温度37°C下加热10分钟
[0116]?模式3:在调整温度37°C下在3~20分钟的范围中选择的多个时间中的某个时间加热
[0117]3.实验步骤
[0118]在将在保存液中保存了 24小时的培养细胞在微管内加热到上述调整温度之后，进行离心分离(10000rpm、l分钟)，通过吸引器去除上层清液。之后，对残存液(30 μ L)加入Iml的稀释液，再次进行离心分离(10000rpm、l分钟)，通过吸引器去除上层清液。之后，对残存液(30 μ L)，加入染色液、RNA去除剂、以及稀释液来调制测定试样，在上述温度调整条件(模式I?3中的某一个)下静置。之后，使测定试样流入到流式细胞仪中而取得光学信号(侧方荧光信号、前方散射光信号)。然后，比较使用4°C保存的保存液而取得的光学信号、和使用30°C保存的保存液而取得的光学信号，求出其偏差。
[0119]〔实验结果〕
[0120](实验1-1)
[0121]在本实验中，在针对保存有细胞的保存液I (基于甲醇)在30°C?50°C的范围内调整了温度的情况、和未进行温度调整的情况(不加热、即4°C或者30°C的状态)下，求出荧光量的偏差。另外，荧光量是侧方荧光信号波形的面积。该荧光量与细胞的DNA量相关，DNA量越多，荧光量越多。在本实验以及以下说明的其他实验中，求出图8中的2C表示峰值时的荧光量(值X)的偏差。
[0122]其结果，如图9所示，在未加热的情况下，使用4°C保存的保存液而取得的荧光量、与使用30°C保存的保存液而取得的荧光量的比例(将荧光量大的一方除以小的一方而求出的比例(百分率))成为约105%。可以说该比例越大，荧光量的偏差越大。
[0123]相对于此，在30°C?50°C的范围内选择6个温度(30°C、35 V、37°C、40 V、45°C、50°C)来进行了 10分钟的温度调整时，不论在哪一个情况下，使用4°C保存的保存液而取得的荧光量、与使用30°C保存的保存液而取得的荧光量的比例比未加热的情况都小。S卩，通过在30°C?50°C的范围内调整温度，保存温度的差异所致的荧光量的偏差被抑制。特别，在30°C?45°C的范围内荧光量的比例变小，在35°C?40°C的范围内荧光量的比例进一步变小。另外，可知在37°C的温度调整内，荧光量的比例成为101%以下，得到最高的效果。因此，在上述实施方式中的温度调整部10中将保存液的调整温度设为37°C。另外，在以下说明的实验1-2?2-3中，也将调整温度设定为考虑为效果最高的37°C。
[0124](实验1-2)
[0125]在本实验中，在针对保存有细胞的保存液2 (基于乙醇)在37°C下进行了 10分钟的温度调整的情况、和未进行温度调整的情况下，调查了荧光量的偏差。
[0126]其结果，如图10所示，使用4°C保存的保存液而取得的荧光量、与使用30°C保存的保存液而取得的荧光量的比例成为约102%，比未加热的情况的比例(108%?109%)更小。因此，可知能够通过温度调整抑制保存温度的差异所致的荧光量的偏差。另外，通过本实验可知，不论成为保存液的基础的醇的种类如何，能够得到温度调整的效果。
[0127](实验1-3)
[0128]在本实验中，在针对保存有细胞的保存液I在37°C下进行了 10分钟的温度调整的情况、和未进行温度调整的情况下，调查了根据前方散射光信号求出的细胞径(细胞的大小C、参照图5 (a))的偏差。
[0129]其结果,可知如图11所示,使用4°C保存的保存液而取得的细胞径、与使用30°C保存的保存液而取得的细胞径的比例成为约102%，比未加热的情况的比例(105%?106%)更小，能够通过温度调整抑制保存温度的差异所致的细胞径的偏差。
[0130](实验1-4)
[0131]在本实验中，在针对保存有细胞的保存液I在37°C下进行了 10分钟的温度调整的情况、和未进行温度调整的情况下，调查了根据侧方荧光信号求出的细胞核径(细胞核的大小N、参照图5 (a))的偏差。
[0132]其结果，如图12所示，使用4°C保存的保存液而取得的细胞核径、与使用30°C保存的保存液而取得的细胞核径的比例成为100.0%?100.4%，比未加热的情况的比例(101.6%?102.0%)更小。因此，可知能够通过温度调整抑制保存温度的差异所致的细胞核径的偏差。
[0133]另外，根据实验1-3和实验1-4的结果可知，能够通过保存液的温度调整，抑制N/C比的偏差。
[0134](实验1-5)
[0135]在本实验中，在使用变更了甲醇浓度的多个保存液3在37°C下进行了 10分钟的温度调整的情况、和未进行温度调整的情况下，调查了荧光量的偏差。
[0136]其结果，如图13所示，在任意一个甲醇浓度下，使用4°C保存的保存液而取得的荧光量、与使用30°C保存的保存液而取得的荧光量的比例都比未加热的情况更小。通过本实验的结果，可知无论甲醇浓度如何，都能够得到温度调整的效果。
[0137](实验1-6)
[0138]在本实验中，在使用变更了乙醇浓度的多个保存液4在37°C下进行了 10分钟的温度调整的情况、和未进行温度调整的情况下，调查了荧光量的偏差。
[0139]其结果，如图14所示，在任意一个乙醇浓度下，使用4°C保存的保存液而取得的荧光量、与使用30°C保存的保存液而取得的荧光量的比例都比未加热的情况更小。通过本实验，可知无论乙醇浓度如何，都能够得到温度调整的效果。
[0140](实验1-7)
[0141]在本实验中，在针对保存有细胞的保存液I在37°C下使时间变化(3?20分钟)而进行了温度调整的情况、和未进行温度调整的情况(温度调整时间O分钟)下，调查了荧光量的偏差。
[0142]其结果，如图15 (a)所示，不论在哪一个温度调整时间中，使用4°C保存的保存液而取得的荧光量、与使用30°C保存的保存液而取得的荧光量的比例都比未加热的情况更小。因此，可知能够通过温度调整抑制保存温度的差异所致的荧光量的偏差。另外，图15
(b)示出保存液的温度相对温度调整时间的变化，由此，可知如果温度调整时间经过3分钟，则保存液升温至大致作为调整温度的37°C，荧光量的偏差也被抑制。另外，通过本实验可知，在温度调整时间是10分钟时，荧光量的偏差最小。因此，在上述实施方式中的温度调整部10中将保存液的温度调整时间设为10分钟。
[0143]〈实验2>
[0144]以下，示出实验2中的概要。
[0145]1.材料
[0146](生物体试样)作为生物体试样，从3名子宫颈癌患者的子宫颈部提取包括上皮细胞的临床检体，分别设为临床检体I?3。
[0147](染色液)与实验I相同
[0148](RNA去除剂)与实验I相同
[0149](保存液)与实验I的保存液I相同
[0150](稀释液)与实验I相同
[0151]2.条件
[0152](保存条件)将保存有临床检体的保存液在4°C或者30°C下静置7天。
[0153](温度调整条件)在如上所述静置之后，将各保存液在调整温度37°C下加热10分钟。
[0154]3.实验步骤
[0155]使用在保存液中保存的临床检体按照与实验I同样的步骤调制试样，在上述温度调整条件下静置。之后，使测定试样流入到流式细胞仪而取得光学信号(侧方荧光信号、前方散射光信号)。然后，比较使用4°C保存的保存液而取得的光学信号、和使用30°C保存的保存液而取得的光学信号，求出其偏差。
[0156]〔实验结果〕
[0157]在本实验中，在针对保存有临床检体I?3的保存液分别在37°C下进行了 10分钟的温度调整的情况、和未进行温度调整的情况下，调查了荧光量的偏差。
[0158]其结果，如图16所示，使用4°C保存的保存液而取得的荧光量、与使用30°C保存的保存液而取得的荧光量的比例在临床检体I中成为104.0%、在临床检体2中成为102.1%、在临床检体3中成为104.4%，分别比未加热的情况的比例(同108.2%、106.5%、106.7%)更小。因此，可知不论是从哪一个子宫颈癌患者提取的临床检体，都能够通过温度调整抑制保存温度的差异所致的荧光量的偏差。
[0159]〈实验3>
[0160]以下，示出与口腔细胞有关的实验3的概要。
[0161]1.材料
[0162](生物体试样)按照以下的步骤提取口腔内的细胞。
[0163]使唾液充分包含于棉棒中，将该棉棒抵接到口腔内而摩擦10秒钟(在右颊、左颊分别使用一根即合计两根棉棒)。在摩擦之后，迅速地，将棉棒放入在5.0mL容量的容器内收容的保存液2.2mL中并旋转，从而将细胞洗掉。然后，逐次将440 μ L分注到1.5mL容量的微管中。
[0164](染色液)与实验I相同
[0165](RNA去除剂)与实验I相同
[0166](保存液)甲醇40vol%、醋酸0.8vol%的水溶液
[0167]2.条件
[0168](保存条件)将保存有口腔细胞的保存液在4°C或者30°C下静置24小时。
[0169](温度调整条件)在如上所述静置之后，在调整温度37°C下加热10分钟。
[0170]3.实验步骤
[0171]按照与实验I同样的步骤调整测定试样，使该测定试样流入到流式细胞仪中，使测定试样流入到流式细胞仪中而取得光学信号(侧方荧光信号、前方散射光信号)。然后，比较使用4°C保存的保存液而取得的光学信号、和使用30°C保存的保存液而取得的光学信号，求出其偏差。
[0172]〔实验结果〕
[0173](实验3-1)
[0174]在本实验中，在针对保存有口腔细胞的保存液在37°C下进行了 10分钟的温度调整的情况、和未进行温度调整的情况下，调查了荧光量的偏差。
[0175]其结果，如图17所示，使用4°C保存的保存液而取得的荧光量、与使用30°C保存的保存液而取得的荧光量的比例成为103%?104%，比未加热的情况的比例(105%?106%)更小。因此，可知能够通过温度调整抑制保存温度的差异所致的荧光量的偏差。
[0176](实验3-2)
[0177]在本实验中，在将保存有口腔细胞的保存液在37°C下进行了 10分钟的温度调整的情况、和未进行温度调整的情况下，调查了根据前方散射光信号求出的细胞径(细胞的大小C、参照图5 (a))的偏差。
[0178]其结果，如图18所示，使用4°C保存的保存液而取得的细胞径、与使用30°C保存的保存液而取得的细胞径的比例成为约102%，比未加热的情况的比例(105%?106%)更小。因此，可知能够通过温度调整抑制保存温度的差异所致的细胞径的偏差。
[0179](实验3-3)
[0180]在本实验中，在针对保存有口腔细胞的保存液在37°C下进行了 10分钟的温度调整的情况、和未进行温度调整的情况下，调查了根据侧方荧光信号求出的细胞核径(细胞核的大小N、参照图5 (a))的偏差。
[0181]其结果，如图19所示，使用4°C保存的保存液而取得的细胞核径、与使用30°C保存的保存液而取得的细胞核径的比例成为100.0%?100.5%，比未加热的情况的比例(101.0%?101.5%)更小。因此，可知能够通过温度调整抑制保存温度的差异所致的细胞核径的偏差。
[0182]根据以上的实验3的各结果，在口腔粘膜的上皮细胞中也与子宫颈部的上皮细胞同样地，通过以规定的温度调整保存液，能够抑制保存液的温度的差异所致的光学信号的偏差，其结果，能够正确地取得DNA量、细胞的大小、细胞核的大小等细胞信息。
[0183]本发明不限于上述实施方式，能够在权利要求书所示的发明的范围内，适当地变更。
[0184]例如，关于上述实施方式的细胞分析装置，将子宫颈部的上皮细胞作为分析对象，但也可以通过上述实验3所验证的，将口腔粘膜的上皮细胞作为分析对象。另外，也可以将膀胱、咽喉等其他上皮细胞、进而内脏器官的上皮细胞作为分析对象。
[0185]在上述实施方式中，N/C比被计算为表示根据侧方荧光强度的波形的宽度得到的细胞核的宽度的数值(细胞核的大小N)、与表示根据前方散射光强度的波形的宽度得到的细胞的宽度的数值(细胞的大小C)之比。但是，不限于此，N/C比也可以被计算为细胞核的面积与细胞的面积之比。在上述实施方式中，根据前方散射光强度的波形的宽度得到表示细胞的宽度的数值(细胞的大小C)。由此，即使在规定的方向上具有长长的形状的细胞流过流式单元时，也能够高精度地表示细胞的大小。
[0186]如上所述，在本发明的实施方式中，关于保存液，只要是保存有细胞的液体，则没有特别限制，但保存液优选包含醇。在本发明的实施方式中，作为保存液中包含的醇，没有特别限制，但可以举出甲醇或者乙醇。另外，在本发明的实施方式中，作为保存液中的醇浓度，如实验1-5、以及实验1-6所示，没有特别限制。但是，在小于25vol%的醇浓度的情况下，细胞易于破坏，所以根据保存细胞的观点，优选为25vol%以上。另外，在超过60%的醇浓度的情况下，细胞易于凝集，所以在通过使用了流式细胞仪的流式细胞法测定细胞的情况下，更优选为60vol%以下。根据以上，作为保存液中的醇浓度，优选为25vol%以上60vol%以下。
[0187]在上述实施方式中，温度调整部10是与细胞分析装置I的测定装置2 —体地设置的，但也可以构成为与测定装置2不同的独立的部件。
[0188]另外，在上述实施方式中，叙述了作为光学信息，针对流式单元中流过的测定试样中的各细胞，取得前方散射光信号(FSC)、侧方散射光信号(SSC)、以及侧方荧光信号(SFL)的结构，但本发明不限于此。例如，在上述实施方式中，为了取得表示细胞的DNA量的值，使用了侧方荧光信号，但无需是侧方，也可以使用以不同的角度取得的荧光信号(例如，前方荧光信号)。另外，也可以主检测部22还具备摄像部，作为光学信息，针对流式单元中流过的测定试样中的各细胞，取得摄像信号。在该情况下，例如，摄像部具备由脉冲激光器构成的光源和照相机，将来自脉冲激光器的激光经由透镜系入射到流式单元43，进而透射物镜以及分色镜而在照相机中成像。脉冲激光器能够在规定的定时发光而通过照相机进行摄像。
【权利要求】
1.一种细胞分析方法，其特征在于，包括: 温度调整工序，将保存有细胞的保存液调整为规定的温度；以及测定工序，对在所述温度调整工序中调整了温度的保存液中保存的细胞照射光来取得光学信息。
2.根据权利要求1所述的细胞分析方法，其特征在于， 还包括通过将通过所述温度调整工序调整了温度的保存液置换为稀释液，来调制测定试样的测定试样调制工序。
3.根据权利要求1所述的细胞分析方法，其特征在于， 所述光学信息包括散射光信息。
4.根据权利要求3所述的细胞分析方法，其特征在于， 还包括根据在所述测定工序中得到的光学信息，取得细胞信息的信息取得工序， 所述信息取得工序包括根据所述散射光信息，取得与细胞的大小有关的信息作为所述细胞信息的工序。
5.根据权利要求2所述的细胞分析方法，其特征在于， 在所述测定试样调制工序中，还使用染色试剂来调制所述测定试样。
6.根据权利要求5所述的细胞分析方法，其特征在于， 所述染色试剂包含核酸染色色素。
7.根据权利要求5所述的细胞分析方法，其特征在于， 在所述测定试样调制工序中，将所述测定试样调整为规定的温度。
8.根据权利要求5所述的细胞分析方法，其特征在于， 所述光学信息包括荧光信息。
9.根据权利要求8所述的细胞分析方法，其特征在于， 还包括根据在所述测定工序中得到的光学信息，取得细胞信息的信息取得工序，所述信息取得工序包括根据所述荧光信息，取得与DNA量以及细胞核的大小中的至少一方有关的信息作为所述细胞信息的工序。
10.根据权利要求1所述的细胞分析方法，其特征在于， 还包括根据在所述测定工序中得到的光学信息，取得细胞信息的信息取得工序， 所述信息取得工序包括取得与细胞的癌化有关的信息作为所述细胞信息的工序。
11.根据权利要求1所述的细胞分析方法，其特征在于， 所述保存液包含醇。
12.根据权利要求1至11中的任意一项所述的细胞分析方法，其特征在于， 在所述温度调整工序中，将保存有细胞的保存液调整为30°C~45°C的温度。
13.一种细胞分析装置，其特征在于，具备: 温度调整部，将保存有细胞的保存液调整为规定的温度； 测定试样调制部，通过将由所述温度调整部调整了温度的保存液置换为稀释液，调制测定试样；以及 测定部，对由所述测定试样调制部调制的测定试样中包含的细胞照射光来取得光学信肩、O
14.根据权利要求13所述的细胞分析装置，其特征在于，所述光学信息包括散射光信息。
15.根据权利要求14所述的细胞分析装置，其特征在于， 还具备根据由所述测定部取得的光学信息，取得细胞信息的信息处理部， 所述信息处理部根据所述散射光信息，取得与细胞的大小有关的信息作为所述细胞信肩、O
16.根据权利要求13所述的细胞分析装置，其特征在于， 所述测定试样调制部还使用包含核酸染色色素的染色试剂，来调制所述测定试样。
17.根据权利要求16所述的细胞分析装置，其特征在于， 所述测定试样调制部将所述测定试样调整为规定的温度。
18.根据权利要求16所述的细胞分析装置，其特征在于， 所述光学信息包括荧光信息。
19.根据权利要求18所述的细胞分析装置，其特征在于， 还具备根据由所述测 定部取得的光学信息，取得细胞信息的信息处理部， 所述信息处理部根据所述荧光信息，取得与DNA量以及细胞核的大小中的至少一方有关的信息作为所述细胞信息。
20.根据权利要求13至19中的任意一项所述的细胞分析装置，其特征在于， 还具备根据由所述测定部取得的光学信息，取得细胞信息的信息处理部， 所述信息处理部取得与细胞的癌化有关的信息作为所述细胞信息。
【文档编号】G01N21/49GK104075982SQ201410122889
【公开日】2014年10月1日 申请日期:2014年3月28日 优先权日:2013年3月29日
【发明者】森田将且, 尾黑昌彦, 横山光士, 山本由佳 申请人:希森美康株式会社
【专利摘要】本发明提供细胞分析方法。该方法包括：温度调整工序，将保存有细胞的保存液调整为规定的温度；以及测定工序，对在所述温度调整工序中调整了温度的保存液中保存的细胞照射光来取得光学信息。
【专利说明】细胞分析方法以及装置
【技术领域】
[0001]本发明涉及分析从生物体提取的细胞的细胞分析方法以及装置。
【背景技术】
[0002]以往，已知自动地分析细胞的DNA量，并根据该DNA量提供与细胞的癌化有关的信息的分析装置。
[0003]例如，在US2009/091746中，公开了对从被验者提取的细胞实施PI染色等处理来调制测定试样，使所调制的测定试样流入到流式单元，对在该流式单元中流过的测定试样照射光，从而针对各个细胞取得荧光信号、散射光信号，解析各信号的波形，从而抽出反映了 DNA量、核的大小、细胞的大小等的特征参数，使用该特征参数来判别细胞的癌化/异型化的细胞分析装置。
[0004]另外，在US2013/217110中，记载了将收容保存有细胞的包含醇的保存液的生物体容器设置到细胞分析装置，在该装置内将生物体容器内的保存液置换为稀释液之后进行PI染色处理等，调制用于流入到流式单元的测定试样。
【发明内容】
[0005]本发明的保护范围仅由权利要求书限定，并且不受任何
【发明内容】
中的内容的影响。
[0006]在US2013/217110中，将所分析的细胞保存到包含醇的保存液中。这样，在保存液中保存细胞的情况下，保存有细胞的保存液的保存温度根据医院、检查设施而不同，有时在室温下保存，也有时冷藏保存。另外，在将细胞从医院输送到检查中心等的情况下，有时保存温度根据输送环境而变动。这样，保存液的保存温度根据保存条件、输送条件等而不同。
[0007]本申请的
【发明者】得知在将保存有细胞的保存液供给到US2013/217110记载那样的细胞分析装置来分析了细胞时，根据保存液的保存温度的差异，在所测定的光学信息(荧光信息、散射光信息)中产生偏差。
[0008]本发明的目的在于提供一种能够抑制保存有细胞的保存液的保存温度的差异所引起的光学信息的偏差的细胞分析方法以及装置。
[0009]本申请的
【发明者】针对保存有细胞的保存液的保存温度与用细胞分析装置取得的光学信息的关系进行了潜心研究的结果，发现通过将对细胞分析装置供给的保存有细胞的保存液调整为规定的温度，能够抑制在对细胞分析装置供给了该保存液中保存的细胞时取得的光学信息的偏差，完成了本发明。
[0010]S卩，本发明的细胞分析方法包括:包括:温度调整工序，将保存有细胞的保存液调整为规定的温度；以及测定工序，对在所述温度调整工序中调整了温度的保存液中保存的细胞照射光来取得光学信息。
[0011]根据本发明的细胞分析方法，通过包括将保存液调整为规定的温度的工序，无论保存液的保存温度如何，都能够适当地抑制在测定工序中取得的光学信息的偏差。因此，即使在使用了该光学信息的之后的处理中，也能够得到排除了保存液的保存温度的影响的正确的结果。
[0012]本发明的细胞分析装置具备:温度调整部，将保存有细胞的保存液调整为规定的温度；测定试样调制部，通过将由所述温度调整部调整了温度的保存液置换为稀释液，调制测定试样；以及测定部，对由所述测定试样调制部调制的测定试样中包含的细胞照射光来取得光学信息。
[0013]如上所述，通过具备将保存液调整为规定的温度的温度调整部，无论对细胞分析装置供给的保存液的保存温度如何，都能够适当地抑制由测定部取得的光学信息的偏差。因此，即使在使用了该光学信息的之后的处理中，也能够得到未受到所述保存温度的影响的正确的结果。
[0014]根据本发明，能够抑制保存有细胞的保存液的保存温度的差异所引起的光学信息的偏差。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1是示出本发明的一个实施方式的细胞分析装置的整体结构的立体图。
[0016]图2是示意地示出细胞分析装置中的测定装置的内部结构的说明图。
[0017]图3是示出流式细胞仪的结构的说明图。
[0018]图4是示出细胞分析装置的动作步骤的流程图。
[0019]图5 Ca)是说明在主测定中得到的前方散射光信号(FSC)和侧方荧光信号(SFL)的图、(b)是示意地示出子宫颈部的上皮细胞的放大剖面的图、(C)是示出N/C比与细胞的大小的关系的图形。
[0020]图6 (a)是示出细胞周期中的DNA量与细胞数的关系的说明图、(b)是示出针对每个细胞周期变化的DNA量的图。
[0021]图7是示出N/C比与细胞宽(细胞的大小)的关系的分布图。
[0022]图8是示出DNA量与细胞数的关系的直方图。
[0023]图9是示出与子宫颈部的上皮细胞有关的实验1-1的结果的图形。
[0024]图10是示出与子宫颈部的上皮细胞有关的实验1-2的结果的图形。
[0025]图11是示出与子宫颈部的上皮细胞有关的实验1-3的结果的图形。
[0026]图12是示出与子宫颈部的上皮细胞有关的实验1-4的结果的图形。
[0027]图13是示出与子宫颈部的上皮细胞有关的实验1-5的结果的图形。
[0028]图14是示出与子宫颈部的上皮细胞有关的实验1-6的结果的图形。
[0029]图15是示出与子宫颈部的上皮细胞有关的实验1-7的结果的图形。
[0030]图16是示出与子宫颈部的上皮细胞有关的实验2的结果的图形。
[0031]图17是示出与口腔粘膜的上皮细胞有关的实验3-1的结果的图形。
[0032]图18是示出与口腔粘膜的上皮细胞有关的实验3-2的结果的图形。
[0033]图19是示出与口腔粘膜的上皮细胞有关的实验3-3的结果的图形。
[0034]【符号说明】
[0035]1:细胞分析装置；2:测定装置；2a:检体设置部；3:数据处理装置(信息处理部)；10:温度调整部；13:副检测部(测定部)；14:辨别/置换部；19:第I试剂添加部(测定试样调制部)；20:第2试剂添加部(测定试样调制部)；22:主检测部(测定部)；23:容器清洗部
【具体实施方式】
[0036]下面参考【专利附图】
【附图说明】本发明的优选实施方式。
[0037]图1是示出本发明的一个实施方式的细胞分析装置的整体结构的立体图。
[0038]本实施方式的细胞分析装置I使包含从患者(被验者)提取的细胞(生物体试样)的测定试样流入到流式单元中，对在流式单元中流过的测定试样照射激光，检测来自测定试样的光(前方散射光、侧方散射光、侧方荧光)并分析其光信号，从而判定是否包括癌化或者处于其过程的细胞(以下将它们还总称为“癌化细胞”)。更具体而言，细胞分析装置I被用于使用从患者提取的子宫颈部的上皮细胞来筛查子宫颈癌。
[0039]如图1所示，细胞分析装置I具备:测定装置2，进行从患者提取的生物体试样的测定等；以及数据处理装置3，与该测定装置2连接，进行测定结果的分析以及显示(输出)等。在测定装置2的前表面，设置了用于设置多个保存有从患者提取的生物体试样(细胞)的、收容以甲醇为主成分的保存液的试样容器4 (参照图2)的检体设置部2a。数据处理装置3具备输入部31、显示部32、以及控制部33。
[0040][测定装置2的结构]
[0041]图2是示意地示出细胞分析装置中的测定装置的内部结构的说明图。
[0042]如图2所示，检体设置部2a将设置了多个试样容器4的架子4a依次搬送至利用检体移液管部11的试样的吸引位置。
[0043]检体移液管部11将试样容器4内的试样移送到温度调整部10。另外，检体移液管部11将温度调整部10内的试样移送到第I分散部12。进而，检体移液管部11将第I分散部12内的试样移送到副检测部13和辨别/置换部14。另外，检体移液管部11将在辨别/置换部14中浓缩了的浓缩液供给到测定试样容器5。检体移液管部11构成为能够向温度调整部10、第I分散部12的试样收容部12a、副检测部13的试样取入部13a、辨别/置换部
14、以及定位到试样交换部Ilb的测定试样容器5的上方位置移动。
[0044]检体移液管部11构成为具有进行试样的吸引以及吐出的移液管Ila,能够通过未图示的检体定量部(驱动定量缸、定量缸内的活塞的马达等)对试样进行定量而将规定量的试样供给到上述各部。
[0045]温度调整部10将从检体设置部2a的试样容器4移送的保存液调整为规定的温度。具体而言，温度调整部10构成为具备设置温度调整用的试样容器的试样设置部10a，通过对该试样设置部IOa内的试样容器进行加热来调整其内部的保存液的温度。
[0046]第I分散部12对试样执行用于使在试样中包含的凝集细胞分散的第I分散处理。具体而言，第I分散处理是对凝集细胞赋予剪切力而使其分散的剪切力赋予处理。第I分散部12构成为包括能够收容试样的试样收容部12a，针对对试样收容部12a供给的试样中的凝集细胞机械性地赋予剪切力。
[0047]副检测部13在利用主检测部22的主测定之前进行试样的浓度测定。副检测部13采用与后述主检测部22大致相同的结构的流式细胞仪40 (参照图3 (a))。
[0048]辨别/置换部14是接受通过第I分散部12实施了第I分散处理之后的试样，将在试样中包含的以甲醇为主成分的保存液用稀释液置换(稀释)。具体而言，利用使液体通过但不使细胞通过的过滤器，将试样中包含的以甲醇为主成分的保存液去除规定的程度，添加缓冲液。由此，保存液中的甲醇所致的向后述DNA的染色的影响变小，所以能够良好地对测定对象细胞的DNA进行染色。进而，辨别/置换部14辨别试样中包含的测定对象细胞(从被验者提取的子宫颈部的上皮细胞)、和其以外的细胞(红血球、白血球、细菌等)以及夹杂物。进而，辨别/置换部14为了得到在利用主检测部22的测定所需的细胞测定数，进行试样中含有的测定对象细胞的浓缩。为了处理的高效化，设置了 2个辨别/置换部14。
[0049]容器移送部15通过剪刀状的夹持部15a夹持设置于反应部18的测定试样容器5，移送到试样交换部lib、第2分散部16、液体去除部17、以及反应部18。容器移送部15构成为使夹持部15a沿着规定的圆周状轨迹移动。另外，容器移送部15构成为能够使夹持部15a在上下方向上移动。试样交换部lib、第2分散部16、液体去除部17、以及反应部18配置于该圆周状轨迹上。由此，能够通过容器移送部15的夹持部15a夹持设置于反应部18的测定试样容器5，移送到圆周状轨迹上的各部。
[0050]第2分散部16针对通过第I分散部12执行了第I分散处理的试样，执行与第I分散处理不同的第2分散处理。具体而言，第2分散部16构成为执行利用第I分散部12的第I分散处理，对在辨别/置换部14中浓缩了(提高了测定对象细胞的浓度)的试样赋予超声波振动。通过第2分散部16,在第I分散处理之后残存的凝集细胞被分散为单一细胞。
[0051]液体去除部17在通过第2分散部16执行了第2分散处理之后，将测定试样容器5的外表面上附着的液分去除(去水)。第2分散处理是在测定试样容器5浸溃到液体中的状态下执行的。液体去除部17构成为通过对测定试样容器5的外表面供给空气流，去除在测定试样容器5的外表面上附着的水滴。由此，在将测定试样容器5设置到反应部18等各部时，液体向各部的附着被防止。
[0052]反应部18促进测定试样容器5内的试样、和由第I试剂添加部19以及第2试剂添加部20添加的试剂的反应。反应部18具备构成为能够通过未图示的驱动部旋转的圆形的旋转平台18a。在旋转平台18a的外周缘部中，设置了用于设置测定试样容器5的多个保持部18b。在该保持部18b中，设置测定试样容器5。构成为通过旋转平台18a的旋转得到的保持部18b的轨迹、和容器移送部15的夹持部15a的圆周状轨迹在规定位置交叉，容器移送部15在该交叉位置将测定试样容器5设置到保持部18b中。反应部18将设置于保持部18b中的测定试样容器5加热到规定温度(约37°C)，促进试样和试剂的反应。
[0053]第I试剂添加部19和第2试剂添加部20向设置于保持部18b中的测定试样容器5内供给试剂。第I试剂添加部19和第2试剂添加部20设置于旋转平台18a的周缘部附近的位置，分别具有能够移动至在旋转平台18a中设置的测定试样容器5的上方的位置P1、P2的供给部19a、20a。由此，在通过旋转平台18a向位置P1、P2搬送了测定试样容器5时，能够从供给部19a、20a向测定试样容器5内添加规定量的试剂。
[0054]由第I试剂添加部19添加的试剂是用于对细胞进行RNA去除处理的RNase。由第2试剂添加部20添加的试剂是用于对细胞进行DNA染色处理的染色液。通过RNA去除处理，细胞中的RNA被分解，能够仅测定细胞核的DNA。DNA染色处理是通过作为包含色素的荧光染色液的碘化丙啶(PI)进行的。通过DNA染色处理，对细胞内的核选择性地实施染色。由此，能够检测来自核的荧光。另外，本发明中的“测定试样调制部”是指，在经过温度调整部10之后直至到达主检测部22的期间进行生物体试样的调制的部位，在本实施方式的情况下，包括分散部12、16、辨别/置换部14、反应部18、试剂添加部19、20。
[0055]试样吸引部21吸引设置于保持部18b中的测定试样容器5内的试样(测定试样)，并将所吸引的测定试样移送到主检测部22。试样吸引部21设置于旋转平台18a的周缘部附近的位置，具有能够移动至设置于旋转平台18a上的测定试样容器5的上方的位置P3的移液管21a。由此，试样吸引部21在通过旋转平台18a向位置P3搬送了测定试样容器5时，能够吸引测定试样容器5内的测定试样。另外，试样吸引部21构成为经由未图示的流路，连接到主检测部22的流式单元43 (参照图3 (a))，能够将由移液管21a吸引的测定试样供给到主检测部22的流式单元43。
[0056]主检测部22具备用于检测来自测定试样的光(前方散射光、侧方散射光、侧方荧光)的流式细胞仪40，将基于各光的信号(光学信号)输出到后级的电路。在后面，参照图3(a)、(b)来说明流式细胞仪40。
[0057]容器清洗部23对通过试样吸引部21将测定试样供给到主检测部22之后的测定试样容器5的内部进行清洗。容器清洗部23构成为通过向在旋转平台18a的保持部18b中保持的测定试样容器5内吐出清洗液，对测定试样容器5的内部进行清洗。由此，在之后的测定处理中使用了相同的测定试样容器5的情况下，能够抑制与其他试样的污染。
[0058]图3 Ca)是示出主检测部22的流式细胞仪40的结构的图。如图3所示，从半导体激光器41出射的激光通过包括多个透镜的透镜系42被聚光到在流式单元43中流过的测定试样。对流式单元43，如上所述，供给通过试样吸引部21的移液管21a吸引了的试样。
[0059]透镜系42具有如图3 (b)所示从半导体激光器41侧(图3 (a)、(b)的左侧)依次配置的准直透镜42a、柱面透镜系(平凸柱面透镜42b+两个凹柱面透镜42c)、以及会聚透镜系(会聚透镜42d+会聚透镜42e)。
[0060]聚光透镜44将测定试样中的细胞的前方散射光聚光到由光电二极管45构成的散射光检测器。侧方光用的聚光透镜46对测定对象细胞以及该细胞中的核的侧方散射光和侧方荧光进行聚光，导入到分色镜47。分色镜47使侧方散射光向光电倍增管(光电子倍增管)48反射，并且使侧方荧光向光电倍增管(光电子倍增管)49的一方透射。这样，侧方散射光被聚光到光电倍增管48，侧方荧光被聚光到光电倍增管49。这些光反映了测定试样中的细胞以及核的特征。
[0061]光电二极管45和光电倍增管48、49将所受光的光信号变换为电信号，分别输出前方散射光信号(FSC)、侧方散射光信号(SSC)、以及侧方荧光信号(SFL)。这些输出信号通过未图示的前置放大器放大，被输出到测定装置2的控制部24(参照图2)。该控制部24具有处理从光电二极管45以及光电倍增管48、49输出的光学信号的功能、控制主检测部22以及副检测部13的动作的功能、控制进行试样的调制的各部2a、10?12、14?21、23的动作的功能、在与数据处理装置3之间进行各种信息的发送接收的功能等。
[0062]控制部24包括微处理器等运算部、由ROM、RAM等构成的存储部。在存储部中，储存用于控制各检测部22、13、进行试样调制的各部2a、10?12、14?21、23的动作的控制程序、各种数据。将由测定装置2的控制部24处理的各信号FSC、SSC、SFL经由通信部发送到数据处理装置3。
[0063]主检测部22如上所述具备图3 Ca)所示的流式细胞仪40，从测定试样，输出前方散射光信号(FSC)、侧方散射光信号(SSC)、以及侧方荧光信号(SFL)。控制部24针对来自主检测部22的输出信号执行必要的信号处理。
[0064]另外，副检测部13采用与主检测部22大致相同的结构的流式细胞仪40，所以关于结构，省略说明。副检测部13在利用主检测部22的主测定之前进行试样的浓度测定。在本实施方式中，副检测部13构成为取得前方散射光信号(FSC),输出用于根据前方散射光信号对与上皮细胞相应的大小的细胞的数量进行计数的信号。从副检测部13输出的前方散射信号FSC被输入到控制部24并被处理。
[0065][数据处理装置的结构]
[0066]如图1所示，数据处理装置3由例如笔记本PC、桌面PC等个人计算机构成，包括输入部31、显示部32、以及控制部33。控制部33具备CPU、由ROM、RAM及硬盘等构成的存储部、CD-ROM驱动器等读出装置、以及各种输入输出接口等。在控制部33的存储部中，除了操作系统以及应用程序等各种程序以外，还安装了实施向图2所示的测定装置2的控制部24的动作命令发送、由测定装置2进行的测定结果的接收以及分析处理、以及所处理的分析结果的显示等的操作程序。另外，数据处理装置3与测定装置2的控制部24可通信地连接，能够在测定装置2与数据处理装置3之间进行数据的发送接收。
[0067]数据处理装置3的CPU通过执行在存储部中安装的程序，根据各信号FSC、SSC、SFL,取得前方散射光强度、侧方荧光强度等特征参数，根据这些特征参数，制作用于分析细胞、核的频度分布数据。然后，数据处理装置3的CPU根据该频度分布数据，进行测定试样中的粒子的辨别处理，判定癌化。
[0068][由细胞分析装置I实施的分析步骤]
[0069]在通过细胞分析装置I分析时，由操作者将收容有生物体试样(细胞)、和以甲醇为主成分的保存液的试样容器4设置到检体设置部2a (参照图2)，开始利用细胞分析装置I的分析。以下，参照图4，说明利用细胞分析装置I的分析的步骤。
[0070]如果开始了测定，则首先通过温度调整部10，进行保存液的温度调整。具体而言，通过检体移液管部11吸引设置于检体设置部2a中的试样容器4内的试样，供给到设置于试样设置部IOa中的试样容器。然后，以使试样容器中的保存液成为规定的温度的方式，调整温度(步骤SI)。温度调整部10中的调整温度成为与设置细胞分析装置I的室内的温度(设置环境温度)大致相同或者比其高的高温。设置细胞分析装置I的室内的温度通常是22°C?25°C程度(最大30°C程度)，相对于此，本实施方式的温度调整部10构成为将保存液加热到约37°C的温度。另外，温度调整部10构成为对保存液加热10分钟。另外，关于为了抑制保存温度的差异所致的光学信息的偏差而调整了温度的保存液的温度，只要是25°C?50°C的范围，则没有特别限制。根据进一步抑制保存温度的差异所致的光学信息的偏差的观点，优选为30°C?45°C的范围，更优选为35°C?45°C的范围，进一步优选为35°C?40°C的范围。
[0071]通过这样的温度调整部10中的保存液的温度调整，无论对细胞分析装置I供给之前的保存液的保存温度如何，都能够将保存液调整为大致恒定的温度，促进保存液中的细胞的醇固定，使细胞稳定化。由此，能够抑制之后在主检测部22、副检测部13中测定的光学信号(光学信息)的温度所致的偏差。另外，通过实验验证了由于保存液的保存温度的差异而在光学信号中产生偏差、以及能够通过保存液的温度调整抑制该光学信号的偏差。关于该实验的详细，将后述。另外，以能够有效地抑制光学信号的偏差的方式，根据所述实验的结果，使本实施方式的由温度调整部10实施的保存液的调整温度、调整时间适当化。
[0072]接下来，针对由温度调整部10调整了温度的保存液中保存的生物体试样，通过第I分散部12进行试样中的凝集细胞的分散处理(第I分散处理)(步骤S2)。具体而言，通过检体移液管部11吸引在温度调整部10的试样设置部1a中设置的试样容器内的试样，供给到试样收容部12a内。通过第I分散部12分散对试样收容部12a供给的试样。
[0073]如果第I分散处理结束，则通过检体移液管部11，将已分散的试样供给到副检测部13的试样取入部13a，向与图3 (a)的流式单元43同样的副检测部13的流式单元，流入规定量的已分散的试样。在副检测部13中，通过流式细胞法，进行在试样中包含的上皮细胞的数量的检测(预测定)(步骤S3)。在本实施方式中，根据上皮细胞的细胞数、和对副检测部13供给的试样的体积，计算该试样的浓度。
[0074]接下来，根据所计算的浓度，通过控制部24，决定用于调制在主测定中使用的测定试样的试样的吸引量(步骤S4)。即，根据预测定中使用的试样的浓度(每单位体积的细胞的数量)、和为了主测定中的癌细胞检测而所需的上皮细胞的细胞数，运算为了进行主测定而所需的试样的液量。在本实施方式中,对主检测部22的流式单元43供给的上皮细胞的数量是规定的数量(A)。在该情况下，对辨别/置换部14供给的试样中的上皮细胞的数量需要是比所述规定的数量(A)更多的数量(B)。因此，以将比所述规定的数量(A)多的数量
(B)的上皮细胞供给到辨别/置换部14的方式，运算步骤S4中的试样的液量。
[0075]接下来，针对所运算的液量的试样，执行辨别/置换处理(步骤S5)。S卩，通过控制部24驱动检体移液管部11，从第I分散部12的试样收容部12a，将第I分散处理后的试样吸引所运算的液量。通过将所吸引的试样供给到辨别/置换部14，开始辨别/置换处理。
[0076]接下来，通过第2分散部16进行试样中的凝集细胞的分散处理(第2分散处理)(步骤S6)。具体而言，容器移送部15将在反应部18的保持部18b中设置的测定试样容器5夹持并取出，定位到试样交换部lib。然后，将从辨别/置换部14通过检体移液管部11吸引了的试样供给到定位于试样交换部Ilb的测定试样容器5。之后，将该测定试样容器5通过容器移送部15移送到第2分散部16，执行第2分散处理。
[0077]如果将包括第2分散处理之后的试样的测定试样容器5设置到反应部18的保持部18b，则通过第I试剂添加部19添加试剂(包括RNase。以下将该试剂还称为RNA去除剂)，通过反应部18加热，而进行测定试样容器5内的测定对象细胞的RNA去除处理(步骤S7)。在RNA去除处理之后，通过第2试剂添加部20添加试剂(染色液)，通过反应部18加热，而进行测定试样容器5内的测定对象细胞的DNA染色处理(步骤S8)。在本实施方式中，通过预测定，在主测定中必要的有意义细胞数在某种程度上被保持为恒定，所以关于对细胞进行染色时的染色的程度，每当测定时不易产生偏差。另外，在本实施方式中，在温度调整工序(步骤SI)中保存液的温度被调整为大致恒定，从而保存液中的细胞中包含的染色质的变性被促进，从而细胞稳定化，染色的程度不易产生偏差。
[0078]接下来，通过试样吸引部21吸引已DNA染色处理的测定试样。将所吸引的测定试样送到主检测部22的流式单元43 (参照图3 (a))，进行针对测定试样中的细胞的主测定(步骤S9)。
[0079]在主测定之后，将所得到的测定数据从测定装置2的控制部24发送到数据处理装置3 (步骤S10)。具体而言，将针对测定试样中的各细胞得到的前方散射光信号(FSC)、侧方散射光信号(SSC)、以及侧方荧光信号(SFL)发送到数据处理装置3。数据处理装置3的控制部33 (CPU)始终判定是否从测定装置2接收到测定数据。如果从测定装置2接收到测定数据，则通过数据处理装置3的控制部33，根据该测定数据进行分析处理(步骤S11)。另外，关于步骤Sll的分析处理的详细，在后面参照图7以及图8来说明。
[0080][癌化信息的取得步骤]
[0081]接下来，说明本实施方式中的癌化信息的取得步骤。
[0082]图5 Ca)是说明在主测定(图4的步骤S9)中得到的前方散射光信号(FSC)和侧方荧光信号(SFL)的图。图5 (a)示出包含细胞核的细胞的示意图、和从该细胞得到的前方散射光信号的波形以及侧方突光信号的波形。纵轴不出光的强度。前方散射光强度的波形的宽度表示示出细胞的宽度的数值(细胞的大小C)，侧方荧光强度的波形的宽度表示示出细胞核的宽度的数值(细胞核的大小N)。如斜线所示，通过侧方荧光强度的波形和规定的基线决定的区域的面积表示细胞的DNA量。
[0083]图5 (b)是示意地示出子宫颈部的上皮细胞的放大剖面的图。如图5 (b)所示，在子宫颈部中，从基底膜侧，依次形成了由基底细胞形成的层(基底层)、由副基底细胞形成的层(副基底层)、由中层细胞形成的层(中层)、以及由表层细胞形成的层(表层)。基底膜附近的基底细胞分化为副基底细胞、副基底细胞分化为中层细胞、中层细胞分化为表层细胞。
[0084]在达到癌的过程中，基底细胞获得异常形成而成为异型细胞。异型细胞获得增殖能力，成为从基底层侧占据表层侧。因此，在达到癌的初始阶段中，在子宫颈部的上皮细胞中，在基底层、副基底层、以及中层中存在的细胞中，存在大量癌化细胞。相逆地，在达到癌的初始阶段中，在子宫颈部的上皮细胞的表层侧存在的细胞中，癌化细胞极其少。
[0085]可知在上皮细胞中，随着从表层侧的层朝向基底膜侧的层，细胞的大小依次变小，但细胞核的大小依次变大。因此，细胞核的大小(N)相对细胞的大小(C)的比例(以下称为“N/C比”)也随着从表层侧的层朝向基底膜侧的层依次变大。因此，N/C比与细胞的大小C成为例如图5 (c)所示那样的关系。另外，能够从被验者提取的子宫颈部的上皮细胞是副基底细胞、中层细胞、以及表层细胞，前癌病变如上述那样在基底细胞侧早期出现。
[0086]图6 (a)是示出细胞周期中的DNA量与细胞数的关系的图。如图6 (a)所示，细胞依照一定的循环(细胞周期)，经由DNA复制、染色体的分配、核分裂、细胞质分裂等事件，成为2个细胞而返回到出发点。关于细胞周期，能够根据其阶段，分成Gl期(用于进入到S期的准备和检验的时期)、S期(DNA合成期)、G2期(用于进入到M期的准备和检验的时期)、以及M期(分裂期)这4期，如果对该4期加上细胞的增殖停止的GO期(停止期)，则细胞处于5个期中的某一个阶段。
[0087]在细胞依照细胞周期增殖时，细胞内的核的染色体也增加，所以通过测定细胞的DNA量，能够推测该细胞处于细胞周期的哪个状态。在正常的细胞的情况下，如图6 (b)所示，G0/G1期中的DNA量是恒定的值(2C)，接着在S期中DNA量逐渐增加，之后如果进入到G2期，则成为恒定的值(4C)，该值在M期中也被维持。此处，C表示每个单倍体的染色体组DNA含量。即，2C表示每个单倍体的染色体组DNA含量的2倍的DNA量、4C表示每个单倍体的染色体组DNA含量的4倍的DNA量。细胞周期的GO期或者Gl期的正常细胞的DNA量成为2C。于是，如果针对正常的细胞制作了 DNA量的直方图，则成为图6 (a)所示那样的直方图。最高的峰值对应于处于DNA量最少的G0/G1期的细胞，接下来高的峰值对应于处于DNA量最多的G2/M期的细胞，它们之间对应于处于S期的细胞。
[0088]在正常的细胞的情况下，处于S期和G2/M期的状态的细胞的数量相比于处于GO/Gl期的细胞的数量极其少。但是，在癌化细胞的情况下，处于S期和G2/M期的状态的细胞的数量比正常的细胞更多。另外，在癌化细胞的情况下，细胞的染色体的数量也变多，所以DNA量也变多。
[0089]因此，在本实施方式中，在癌化的判定中，使用着眼于N/C比和DNA量的判定方法。
[0090]具体而言，抽出N/C比大的细胞。接下来，抽出这样抽出的细胞群中的、DNA量多的细胞和DNA量少的细胞，从而有效地抽出是癌化细胞的可能性高的细胞(第I细胞)和是癌化细胞的可能性低的细胞(第2细胞)。一般，如果组织的癌化发展，则第I细胞的数量增力口，第2细胞的数量减少。因此，两个细胞数的比在组织是正常的情况和癌化了的情况下大幅不同。根据该比，进行癌化的判定。这样，如果使用增减倾向相互相逆的2个细胞数的比，则即使测定试样中包含的测定对象细胞比较少，也能够得到可靠性高的判定结果。
[0091]具体而言，数据处理装置3的控制部33制作表示图7所示那样的N/C比与细胞的大小(细胞宽)的关系的分布图，在该分布图中抽出细胞的大小处于规定的范围(例如1 μ m以上50 μ m以下的范围)、并且N/C比处于规定的范围(例如0.2以上I以下的范围)的细胞的测定数据而作为分析对象。由此，能够从分析对象去除癌化细胞少的表层中存在的表层细胞。另外，也可以在进行上述抽出之前，进行分离白血球和上皮细胞的测定数据的处理、分离单一上皮细胞和凝集上皮细胞的测定数据的处理等。另外，也可以不考虑细胞的大小，而仅使用N/C比的范围来抽出细胞的测定数据。
[0092]接下来，数据处理装置3的控制部33针对所抽出的细胞的测定数据，制作图8所示的直方图。在该直方图中，横轴表示DNA量,纵轴表示细胞数。
[0093]接下来，数据处理装置3的控制部33在图8的直方图中，取得DNA量是正常细胞的S期以上的细胞数NI (具有处于大于b且c以下的范围内的DNA量的细胞数)、即如图6(a)所示具有超过细胞周期处于GO期或者Gl期的正常细胞的DNA量的DNA量的细胞的数量。进而，控制部33取得DNA量是正常细胞的2C的细胞的数量N2 (具有处于a以上b以下的范围的DNA量的细胞数)、即具有细胞周期处于GO期或者Gl期的正常细胞的DNA量的细胞的数量。
[0094]接下来，数据处理装置3的控制部33取得将DNA量是S期以上的细胞的数量NI除以DNA量是2C的细胞的数量N2而得到的值(两个细胞数N1、N2的比(N1/N2))。然后，控制部33通过将两个细胞数N1、N2的比与规定的阈值进行比较，来判定癌化。即，如果NI/N2的值是规定的阈值以上，则将癌化的判定设为阳性，如果N1/N2的值小于规定的阈值，则将癌化的判定设为阴性。
[0095]之后，数据处理装置3的控制部33将与癌化有关的信息显示于显示部32、或者输出到外部。例如，在癌化的判定是阳性的情况下，在显示部32中，显示需要再检查的意思，在癌化的判定是阴性的情况下，在显示部32中，显示不需要再检查的意思。
[0096][关于温度调整部10中的温度调整条件]
[0097]如上所述，测定装置2的温度调整部10在将生物体试样送到主检测部22或者副检测部13之前，将保存液的温度调整为规定的温度。在主检测部22以及副检测部13中取得的光学信号由于保存液的温度的差异而产生偏差，其结果，有无法正确地进行使用了光学信号的癌化的判定可能性。例如，如果在侧方荧光信号、前方散射光信号中产生了偏差，则在细胞核的大小N、细胞的大小C中也产生偏差，有对图7所示的分布图的制作造成恶劣影响的可能性。另外，如果在侧方荧光信号中产生了偏差，则在细胞的DNA量中也产生偏差，有无法正确地制作图8所示的直方图，而对癌化的判定造成恶劣影响的可能性。特别，侧方荧光信号的强度根据DNA的染色的程度而变化，所以保存液的温度的差异对DNA的染色的程度造成影响。
[0098]本
【发明者】通过以下的实验验证了通过将保存有生物体试样的保存液调整为规定的温度范围，能够抑制光学信号的偏差。同时，求出为了抑制光学信号的偏差而有效的调整温度以及调整时间。另外，还验证了使保存液的醇浓度变化了时的温度调整的效果。以下，详细说明该实验。另外，以下的实验I以及实验2是与子宫颈部中的上皮细胞有关的实验，实验3是与口腔粘膜中的上皮细胞(以下还称为“口腔细胞”)有关的实验。
[0099]< 实验 1>
[0100]以下，示出实验I中的概要。
[0101]1.材料
[0102](生物体试样)在作为生物体试样的培养细胞中，使用了从AmericanType CultureCollect1n公司(ATCC公司)获得的Hela细胞。
[0103](染色液)使用了将SIGMA公司的PI(碘化丙啶)用乙二醇稀释了的染色液。
[0104](RNA去除剂)使用了将SIGMA公司的RNaseA用Tris盐酸水溶液(pH7.51mM)稀释了的RNA去除剂。
[0105](保存液)通过实验内容，使用了以下的4个模式的保存液。
[0106]保存液1:甲醇40vol%、醋酸0.8vol%的水溶液
[0107]保存液2:乙醇40vol%、醋酸0.8vol%的水溶液
[0108]保存液3:甲醇25~80vol%、醋酸0.8vol%的水溶液
[0109]保存液4:乙醇25~80vol%、醋酸0.8vol%的水溶液
[0110](稀释液)使用了Tris盐酸水溶液(pH7.51mM)。
[0111]2.条件
[0112](保存条件)将保存了培养细胞的保存液在4°C或者30°C下静置24个小时。在临床现场中包含细胞的保存液被保存至检查，对于保存温度一般设想4°C~30°C。本实验中的保存液的静置是根据一般设想的保存温度的下限(4°C)或者上限(30°C)的温度进行的。
[0113](温度调整条件)在如上所述静置之后，按照以下的3个模式中的某一个调整了保存液的温度。
[0114]?模式1:在30°C~50°C的范围内选择的多个调整温度中的某一个温度下加热10分钟
[0115].模式2:在调整温度37°C下加热10分钟
[0116]?模式3:在调整温度37°C下在3~20分钟的范围中选择的多个时间中的某个时间加热
[0117]3.实验步骤
[0118]在将在保存液中保存了 24小时的培养细胞在微管内加热到上述调整温度之后，进行离心分离(10000rpm、l分钟)，通过吸引器去除上层清液。之后，对残存液(30 μ L)加入Iml的稀释液，再次进行离心分离(10000rpm、l分钟)，通过吸引器去除上层清液。之后，对残存液(30 μ L)，加入染色液、RNA去除剂、以及稀释液来调制测定试样，在上述温度调整条件(模式I?3中的某一个)下静置。之后，使测定试样流入到流式细胞仪中而取得光学信号(侧方荧光信号、前方散射光信号)。然后，比较使用4°C保存的保存液而取得的光学信号、和使用30°C保存的保存液而取得的光学信号，求出其偏差。
[0119]〔实验结果〕
[0120](实验1-1)
[0121]在本实验中，在针对保存有细胞的保存液I (基于甲醇)在30°C?50°C的范围内调整了温度的情况、和未进行温度调整的情况(不加热、即4°C或者30°C的状态)下，求出荧光量的偏差。另外，荧光量是侧方荧光信号波形的面积。该荧光量与细胞的DNA量相关，DNA量越多，荧光量越多。在本实验以及以下说明的其他实验中，求出图8中的2C表示峰值时的荧光量(值X)的偏差。
[0122]其结果，如图9所示，在未加热的情况下，使用4°C保存的保存液而取得的荧光量、与使用30°C保存的保存液而取得的荧光量的比例(将荧光量大的一方除以小的一方而求出的比例(百分率))成为约105%。可以说该比例越大，荧光量的偏差越大。
[0123]相对于此，在30°C?50°C的范围内选择6个温度(30°C、35 V、37°C、40 V、45°C、50°C)来进行了 10分钟的温度调整时，不论在哪一个情况下，使用4°C保存的保存液而取得的荧光量、与使用30°C保存的保存液而取得的荧光量的比例比未加热的情况都小。S卩，通过在30°C?50°C的范围内调整温度，保存温度的差异所致的荧光量的偏差被抑制。特别，在30°C?45°C的范围内荧光量的比例变小，在35°C?40°C的范围内荧光量的比例进一步变小。另外，可知在37°C的温度调整内，荧光量的比例成为101%以下，得到最高的效果。因此，在上述实施方式中的温度调整部10中将保存液的调整温度设为37°C。另外，在以下说明的实验1-2?2-3中，也将调整温度设定为考虑为效果最高的37°C。
[0124](实验1-2)
[0125]在本实验中，在针对保存有细胞的保存液2 (基于乙醇)在37°C下进行了 10分钟的温度调整的情况、和未进行温度调整的情况下，调查了荧光量的偏差。
[0126]其结果，如图10所示，使用4°C保存的保存液而取得的荧光量、与使用30°C保存的保存液而取得的荧光量的比例成为约102%，比未加热的情况的比例(108%?109%)更小。因此，可知能够通过温度调整抑制保存温度的差异所致的荧光量的偏差。另外，通过本实验可知，不论成为保存液的基础的醇的种类如何，能够得到温度调整的效果。
[0127](实验1-3)
[0128]在本实验中，在针对保存有细胞的保存液I在37°C下进行了 10分钟的温度调整的情况、和未进行温度调整的情况下，调查了根据前方散射光信号求出的细胞径(细胞的大小C、参照图5 (a))的偏差。
[0129]其结果,可知如图11所示,使用4°C保存的保存液而取得的细胞径、与使用30°C保存的保存液而取得的细胞径的比例成为约102%，比未加热的情况的比例(105%?106%)更小，能够通过温度调整抑制保存温度的差异所致的细胞径的偏差。
[0130](实验1-4)
[0131]在本实验中，在针对保存有细胞的保存液I在37°C下进行了 10分钟的温度调整的情况、和未进行温度调整的情况下，调查了根据侧方荧光信号求出的细胞核径(细胞核的大小N、参照图5 (a))的偏差。
[0132]其结果，如图12所示，使用4°C保存的保存液而取得的细胞核径、与使用30°C保存的保存液而取得的细胞核径的比例成为100.0%?100.4%，比未加热的情况的比例(101.6%?102.0%)更小。因此，可知能够通过温度调整抑制保存温度的差异所致的细胞核径的偏差。
[0133]另外，根据实验1-3和实验1-4的结果可知，能够通过保存液的温度调整，抑制N/C比的偏差。
[0134](实验1-5)
[0135]在本实验中，在使用变更了甲醇浓度的多个保存液3在37°C下进行了 10分钟的温度调整的情况、和未进行温度调整的情况下，调查了荧光量的偏差。
[0136]其结果，如图13所示，在任意一个甲醇浓度下，使用4°C保存的保存液而取得的荧光量、与使用30°C保存的保存液而取得的荧光量的比例都比未加热的情况更小。通过本实验的结果，可知无论甲醇浓度如何，都能够得到温度调整的效果。
[0137](实验1-6)
[0138]在本实验中，在使用变更了乙醇浓度的多个保存液4在37°C下进行了 10分钟的温度调整的情况、和未进行温度调整的情况下，调查了荧光量的偏差。
[0139]其结果，如图14所示，在任意一个乙醇浓度下，使用4°C保存的保存液而取得的荧光量、与使用30°C保存的保存液而取得的荧光量的比例都比未加热的情况更小。通过本实验，可知无论乙醇浓度如何，都能够得到温度调整的效果。
[0140](实验1-7)
[0141]在本实验中，在针对保存有细胞的保存液I在37°C下使时间变化(3?20分钟)而进行了温度调整的情况、和未进行温度调整的情况(温度调整时间O分钟)下，调查了荧光量的偏差。
[0142]其结果，如图15 (a)所示，不论在哪一个温度调整时间中，使用4°C保存的保存液而取得的荧光量、与使用30°C保存的保存液而取得的荧光量的比例都比未加热的情况更小。因此，可知能够通过温度调整抑制保存温度的差异所致的荧光量的偏差。另外，图15
(b)示出保存液的温度相对温度调整时间的变化，由此，可知如果温度调整时间经过3分钟，则保存液升温至大致作为调整温度的37°C，荧光量的偏差也被抑制。另外，通过本实验可知，在温度调整时间是10分钟时，荧光量的偏差最小。因此，在上述实施方式中的温度调整部10中将保存液的温度调整时间设为10分钟。
[0143]〈实验2>
[0144]以下，示出实验2中的概要。
[0145]1.材料
[0146](生物体试样)作为生物体试样，从3名子宫颈癌患者的子宫颈部提取包括上皮细胞的临床检体，分别设为临床检体I?3。
[0147](染色液)与实验I相同
[0148](RNA去除剂)与实验I相同
[0149](保存液)与实验I的保存液I相同
[0150](稀释液)与实验I相同
[0151]2.条件
[0152](保存条件)将保存有临床检体的保存液在4°C或者30°C下静置7天。
[0153](温度调整条件)在如上所述静置之后，将各保存液在调整温度37°C下加热10分钟。
[0154]3.实验步骤
[0155]使用在保存液中保存的临床检体按照与实验I同样的步骤调制试样，在上述温度调整条件下静置。之后，使测定试样流入到流式细胞仪而取得光学信号(侧方荧光信号、前方散射光信号)。然后，比较使用4°C保存的保存液而取得的光学信号、和使用30°C保存的保存液而取得的光学信号，求出其偏差。
[0156]〔实验结果〕
[0157]在本实验中，在针对保存有临床检体I?3的保存液分别在37°C下进行了 10分钟的温度调整的情况、和未进行温度调整的情况下，调查了荧光量的偏差。
[0158]其结果，如图16所示，使用4°C保存的保存液而取得的荧光量、与使用30°C保存的保存液而取得的荧光量的比例在临床检体I中成为104.0%、在临床检体2中成为102.1%、在临床检体3中成为104.4%，分别比未加热的情况的比例(同108.2%、106.5%、106.7%)更小。因此，可知不论是从哪一个子宫颈癌患者提取的临床检体，都能够通过温度调整抑制保存温度的差异所致的荧光量的偏差。
[0159]〈实验3>
[0160]以下，示出与口腔细胞有关的实验3的概要。
[0161]1.材料
[0162](生物体试样)按照以下的步骤提取口腔内的细胞。
[0163]使唾液充分包含于棉棒中，将该棉棒抵接到口腔内而摩擦10秒钟(在右颊、左颊分别使用一根即合计两根棉棒)。在摩擦之后，迅速地，将棉棒放入在5.0mL容量的容器内收容的保存液2.2mL中并旋转，从而将细胞洗掉。然后，逐次将440 μ L分注到1.5mL容量的微管中。
[0164](染色液)与实验I相同
[0165](RNA去除剂)与实验I相同
[0166](保存液)甲醇40vol%、醋酸0.8vol%的水溶液
[0167]2.条件
[0168](保存条件)将保存有口腔细胞的保存液在4°C或者30°C下静置24小时。
[0169](温度调整条件)在如上所述静置之后，在调整温度37°C下加热10分钟。
[0170]3.实验步骤
[0171]按照与实验I同样的步骤调整测定试样，使该测定试样流入到流式细胞仪中，使测定试样流入到流式细胞仪中而取得光学信号(侧方荧光信号、前方散射光信号)。然后，比较使用4°C保存的保存液而取得的光学信号、和使用30°C保存的保存液而取得的光学信号，求出其偏差。
[0172]〔实验结果〕
[0173](实验3-1)
[0174]在本实验中，在针对保存有口腔细胞的保存液在37°C下进行了 10分钟的温度调整的情况、和未进行温度调整的情况下，调查了荧光量的偏差。
[0175]其结果，如图17所示，使用4°C保存的保存液而取得的荧光量、与使用30°C保存的保存液而取得的荧光量的比例成为103%?104%，比未加热的情况的比例(105%?106%)更小。因此，可知能够通过温度调整抑制保存温度的差异所致的荧光量的偏差。
[0176](实验3-2)
[0177]在本实验中，在将保存有口腔细胞的保存液在37°C下进行了 10分钟的温度调整的情况、和未进行温度调整的情况下，调查了根据前方散射光信号求出的细胞径(细胞的大小C、参照图5 (a))的偏差。
[0178]其结果，如图18所示，使用4°C保存的保存液而取得的细胞径、与使用30°C保存的保存液而取得的细胞径的比例成为约102%，比未加热的情况的比例(105%?106%)更小。因此，可知能够通过温度调整抑制保存温度的差异所致的细胞径的偏差。
[0179](实验3-3)
[0180]在本实验中，在针对保存有口腔细胞的保存液在37°C下进行了 10分钟的温度调整的情况、和未进行温度调整的情况下，调查了根据侧方荧光信号求出的细胞核径(细胞核的大小N、参照图5 (a))的偏差。
[0181]其结果，如图19所示，使用4°C保存的保存液而取得的细胞核径、与使用30°C保存的保存液而取得的细胞核径的比例成为100.0%?100.5%，比未加热的情况的比例(101.0%?101.5%)更小。因此，可知能够通过温度调整抑制保存温度的差异所致的细胞核径的偏差。
[0182]根据以上的实验3的各结果，在口腔粘膜的上皮细胞中也与子宫颈部的上皮细胞同样地，通过以规定的温度调整保存液，能够抑制保存液的温度的差异所致的光学信号的偏差，其结果，能够正确地取得DNA量、细胞的大小、细胞核的大小等细胞信息。
[0183]本发明不限于上述实施方式，能够在权利要求书所示的发明的范围内，适当地变更。
[0184]例如，关于上述实施方式的细胞分析装置，将子宫颈部的上皮细胞作为分析对象，但也可以通过上述实验3所验证的，将口腔粘膜的上皮细胞作为分析对象。另外，也可以将膀胱、咽喉等其他上皮细胞、进而内脏器官的上皮细胞作为分析对象。
[0185]在上述实施方式中，N/C比被计算为表示根据侧方荧光强度的波形的宽度得到的细胞核的宽度的数值(细胞核的大小N)、与表示根据前方散射光强度的波形的宽度得到的细胞的宽度的数值(细胞的大小C)之比。但是，不限于此，N/C比也可以被计算为细胞核的面积与细胞的面积之比。在上述实施方式中，根据前方散射光强度的波形的宽度得到表示细胞的宽度的数值(细胞的大小C)。由此，即使在规定的方向上具有长长的形状的细胞流过流式单元时，也能够高精度地表示细胞的大小。
[0186]如上所述，在本发明的实施方式中，关于保存液，只要是保存有细胞的液体，则没有特别限制，但保存液优选包含醇。在本发明的实施方式中，作为保存液中包含的醇，没有特别限制，但可以举出甲醇或者乙醇。另外，在本发明的实施方式中，作为保存液中的醇浓度，如实验1-5、以及实验1-6所示，没有特别限制。但是，在小于25vol%的醇浓度的情况下，细胞易于破坏，所以根据保存细胞的观点，优选为25vol%以上。另外，在超过60%的醇浓度的情况下，细胞易于凝集，所以在通过使用了流式细胞仪的流式细胞法测定细胞的情况下，更优选为60vol%以下。根据以上，作为保存液中的醇浓度，优选为25vol%以上60vol%以下。
[0187]在上述实施方式中，温度调整部10是与细胞分析装置I的测定装置2 —体地设置的，但也可以构成为与测定装置2不同的独立的部件。
[0188]另外，在上述实施方式中，叙述了作为光学信息，针对流式单元中流过的测定试样中的各细胞，取得前方散射光信号(FSC)、侧方散射光信号(SSC)、以及侧方荧光信号(SFL)的结构，但本发明不限于此。例如，在上述实施方式中，为了取得表示细胞的DNA量的值，使用了侧方荧光信号，但无需是侧方，也可以使用以不同的角度取得的荧光信号(例如，前方荧光信号)。另外，也可以主检测部22还具备摄像部，作为光学信息，针对流式单元中流过的测定试样中的各细胞，取得摄像信号。在该情况下，例如，摄像部具备由脉冲激光器构成的光源和照相机，将来自脉冲激光器的激光经由透镜系入射到流式单元43，进而透射物镜以及分色镜而在照相机中成像。脉冲激光器能够在规定的定时发光而通过照相机进行摄像。
【权利要求】
1.一种细胞分析方法，其特征在于，包括: 温度调整工序，将保存有细胞的保存液调整为规定的温度；以及测定工序，对在所述温度调整工序中调整了温度的保存液中保存的细胞照射光来取得光学信息。
2.根据权利要求1所述的细胞分析方法，其特征在于， 还包括通过将通过所述温度调整工序调整了温度的保存液置换为稀释液，来调制测定试样的测定试样调制工序。
3.根据权利要求1所述的细胞分析方法，其特征在于， 所述光学信息包括散射光信息。
4.根据权利要求3所述的细胞分析方法，其特征在于， 还包括根据在所述测定工序中得到的光学信息，取得细胞信息的信息取得工序， 所述信息取得工序包括根据所述散射光信息，取得与细胞的大小有关的信息作为所述细胞信息的工序。
5.根据权利要求2所述的细胞分析方法，其特征在于， 在所述测定试样调制工序中，还使用染色试剂来调制所述测定试样。
6.根据权利要求5所述的细胞分析方法，其特征在于， 所述染色试剂包含核酸染色色素。
7.根据权利要求5所述的细胞分析方法，其特征在于， 在所述测定试样调制工序中，将所述测定试样调整为规定的温度。
8.根据权利要求5所述的细胞分析方法，其特征在于， 所述光学信息包括荧光信息。
9.根据权利要求8所述的细胞分析方法，其特征在于， 还包括根据在所述测定工序中得到的光学信息，取得细胞信息的信息取得工序，所述信息取得工序包括根据所述荧光信息，取得与DNA量以及细胞核的大小中的至少一方有关的信息作为所述细胞信息的工序。
10.根据权利要求1所述的细胞分析方法，其特征在于， 还包括根据在所述测定工序中得到的光学信息，取得细胞信息的信息取得工序， 所述信息取得工序包括取得与细胞的癌化有关的信息作为所述细胞信息的工序。
11.根据权利要求1所述的细胞分析方法，其特征在于， 所述保存液包含醇。
12.根据权利要求1至11中的任意一项所述的细胞分析方法，其特征在于， 在所述温度调整工序中，将保存有细胞的保存液调整为30°C~45°C的温度。
13.一种细胞分析装置，其特征在于，具备: 温度调整部，将保存有细胞的保存液调整为规定的温度； 测定试样调制部，通过将由所述温度调整部调整了温度的保存液置换为稀释液，调制测定试样；以及 测定部，对由所述测定试样调制部调制的测定试样中包含的细胞照射光来取得光学信肩、O
14.根据权利要求13所述的细胞分析装置，其特征在于，所述光学信息包括散射光信息。
15.根据权利要求14所述的细胞分析装置，其特征在于， 还具备根据由所述测定部取得的光学信息，取得细胞信息的信息处理部， 所述信息处理部根据所述散射光信息，取得与细胞的大小有关的信息作为所述细胞信肩、O
16.根据权利要求13所述的细胞分析装置，其特征在于， 所述测定试样调制部还使用包含核酸染色色素的染色试剂，来调制所述测定试样。
17.根据权利要求16所述的细胞分析装置，其特征在于， 所述测定试样调制部将所述测定试样调整为规定的温度。
18.根据权利要求16所述的细胞分析装置，其特征在于， 所述光学信息包括荧光信息。
19.根据权利要求18所述的细胞分析装置，其特征在于， 还具备根据由所述测 定部取得的光学信息，取得细胞信息的信息处理部， 所述信息处理部根据所述荧光信息，取得与DNA量以及细胞核的大小中的至少一方有关的信息作为所述细胞信息。
20.根据权利要求13至19中的任意一项所述的细胞分析装置，其特征在于， 还具备根据由所述测定部取得的光学信息，取得细胞信息的信息处理部， 所述信息处理部取得与细胞的癌化有关的信息作为所述细胞信息。
【文档编号】G01N21/49GK104075982SQ201410122889
【公开日】2014年10月1日 申请日期:2014年3月28日 优先权日:2013年3月29日
【发明者】森田将且, 尾黑昌彦, 横山光士, 山本由佳 申请人:希森美康株式会社
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