离子液体包裹金纳米粒子修饰玻碳电极的制备及其对胆固醇的检测的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种离子液体包裹金纳米粒子修饰玻碳电极的制备及其对胆固醇的检测。首先，在离子液体两相体系中用硼氢化钠原位还原氯金酸得到离子液体包裹的金纳米粒子，然后将胆固醇氧化酶（ChOx）直接固定在离子液体包裹金纳米粒子复合物材料上，最后将合成的复合材料滴涂到玻碳电极表面呈修饰的玻碳电极。修饰的玻碳电极对胆固醇有好的电化学响应，可用于直接检测胆固醇，本发明制备的玻碳电极检测胆固醇具有线性范围宽，检测限低的特点。
【专利说明】离子液体包裹金纳米粒子修饰玻碳电极的制备及其对胆固醇的检测
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种离子液体包裹金纳米粒子修饰玻碳电极的制备及其对胆固醇的检测。
[0002]【背景技术】
金纳米粒子由于能够高效的负载酶和保持酶的生物活性，从而在电化学传感领域得到广泛的关注。许多文献报道，粒径小的金纳米粒子能够加速酶催化氧化还原反应中产生的电子转移到电极表面，然而，当金纳米粒子表面没有保护剂或者表面钝化时，金纳米粒子由于高的表面能而容易发生团聚，导致金纳米粒子的催化活性降低，本发明用离子液体稳定金纳米粒子，得到粒径小且分散性好的金纳米粒子。
[0003]离子液体可以作为优异的溶剂用于固定和稳定金属纳米粒子，而且可以提供一个良好的环境用于准可逆的催化过程。酶在离子液体中的催化活性和稳定性比一些有机溶剂高，而且高疏水性的离子液体有益于酶的活性和稳定性。
[0004]血液中高含量的胆固醇会引起许多疾病，因此，快速、精确、可靠的检测胆固醇有着重大的意义。现有的胆固醇传感器大多是基于酶的生物传感器，而且集中于研究有效的固定酶在固体电极表面，并且能够实现胆固醇氧化酶和电极表面的直接电子转移。但是，支持介质差的相容环境和酶的氧化还原活性位点深埋在蛋白质里，限制了制备的酶传感器的分析效率。因此，研制一种新的基质用于有效的负载酶，而且能够保持酶的生物活性的酶传感器具有很重要的意义。
[0005]
【发明内容】
基于上述，本发明的目的在于提供一种离子液体包裹金纳米粒子修饰玻碳电极的制备方法；
本发明另一目的在于用制备的离子液体包裹金纳米粒子修饰玻碳电极来检测胆固醇的方法。
[0006]本发明的目的是这样实现的:
一种离子液体包裹金纳米粒子修饰的玻碳电极制备方法，其步骤是:
a.将[BMM][PF6]和HAuC14水溶液等体积混合，加入0.01mol/L的柠檬酸三钠，之后搅拌3 min。慢慢逐滴滴加5 mmol/L的硼氢化钠到混合溶液中,搅拌15 min,静置20 min得到分层的离子液体包裹的金纳米粒子溶胶和水溶液，将水吸出，用蒸馏水洗涤溶胶三次，以除去剩余的柠檬酸三钠；
将胆固醇氧化酶分散到离子液体包裹的金纳米粒子溶胶中，水温控制在25°C?40°C，以免酶失活，超声30min，直到分散均匀，呈稳定的黄黑色分散液，4°C冰箱储存；
b.将玻碳电极依次用0.3 μ m、0.05 μ m的三氧化二铝悬浊液抛光成镜面，再依次经体积分数为95 %的乙醇、二次蒸馏水超声清洗后，得到处理后的玻碳电极；将玻碳电极插入含有ImM铁氰化钾探针分子的0.1M氯化钾电解质溶液中，并采用以玻碳电极为工作电极、钼为对电极、饱和的甘汞电极为参比电极的三电极体系进行循环伏安扫描，对裸玻碳电极进行表征；再将电极取出用二次蒸馏水冲洗并吹干，备用；
C.在上述处理好的裸玻碳电极上滴涂步骤a得到的储备液，从而制得胆固醇氧化酶离子液体包裹的金纳米粒子修饰的玻碳电极(ChOx-1L-AuNPs/GCE)。
[0007]制备离子液体包裹金纳米粒子修饰玻碳电极对胆固醇的检测方法，其步骤是:
a.以胆固醇氧化酶-离子液体包裹的金纳米粒子修饰的玻碳电极(ChOx-1L-AuNPs/GCE)为工作电极、钼柱为对电极、饱和的甘汞电极为参比电极，组成三电极体系，并将其共同浸入含有 0，0.1, 0.4, 0.6, 3.0, 5.0, 8.0, 10.0, 20.0, 30.0 和 50.0 μ M 的胆固醇的0.2Μ pH为7.0的磷酸盐缓冲溶液中进行差示脉冲扫描，得到不同浓度胆固醇的差示脉冲伏安曲线图；
e.采用 origin 软件作图，绘制 ChOx-1L-AuNPs/GCE 在浓度为 0，0.1, 0.4，0.6，3.0，5.0，8.0，10.0, 20.0, 30.0和50.0 μ M胆固醇中的差示脉冲伏安曲线和胆固醇的
还原峰电流和其浓度与峰电流的比的线性关系图。
[0008]本发明优点和产生的有益效果是:
1、本发明用离子液体和水溶液两相体系制备了粒径小，分散性好的离子液体包裹的金纳米粒子，而且制备的离子液体包裹的金纳米粒子对疏水性的分子(二茂铁)有良好的电化学响应。同时离子液体包裹的金纳米粒子能够有效的固定胆固醇氧化酶在固体电极表面，而且能够保持酶的生物活性，实现胆固醇氧化酶和电极表面的直接电子转移。这主要是由于结合了疏水性离子液体和金纳米粒子各自的优点，提高了离子液体包裹金纳米粒子的导电性。
[0009]表I为本发明与现有的胆固醇传感器对胆固醇检测性能的比较:
Electrode Linear range (μ M) Detection limit (μ Μ) Electrochemicallymeasured species
全氟磺酸/胆固醇氧化酶/钼纳米-氧化锌/玻碳电极0.5-15 — H202 胆固醇氧化酶/钾掺杂的多壁碳纳米管/玻碳电极 0.05 - 16 0.005 ChOx 二茂铁氧化石墨烯/胆固醇氧化酶/玻碳电极0.5 -46.5 0.1 ChOx 胆固醇氧化酶-功能化石墨烯/石墨电极50 - 350 5.0 ChOx 全氟磺酸/胆固醇氧化酶/金纳米粒子-多壁碳纳米管/玻碳电极10 -500 4.3 ChOx 离子液体胆固醇氧化酶/普鲁士蓝/玻碳电极10 - 400.00 4.4 PB 胆固醇氧化酶离子液体包裹的金纳米粒子/玻碳电极0.1 - 50 0.033 ChOx 从表I可以看出，本发明与现有的修饰电极检测胆固醇相比，无论是在线性范围还是 检测限都有更好的检测效果。
[0010]本发明将胆固醇氧化酶分散到离子液体包裹的金纳米粒子溶胶中，将水温控制在25°C?40°C，超过40°C酶会失去活性，小于25°C胆固醇氧化酶不能均匀的分散在离子液体中，并且离子液体的粘度降低，金纳米粒子会发生团聚，因此离子液体不能很好的包裹金纳米粒子，影响胆固醇氧化酶的分散效果。
[0011 ] 与传统的修饰电极相比，离子液体包裹金纳米粒子修饰电极能够有效的固定胆固醇氧化酶，而且酶的活性高，稳定性好，可以实现直接的电子转移。离子液体包裹金纳米粒子构筑的修饰玻碳电极对胆固醇的检测具有灵敏度高、重现性好等优点，同时该修饰玻碳电极制备过程简单，能够成为良好的候选材料用于构建相应的酶电极，从而为诊断胆固醇弓I起的疾病提供了 一个方便，且选择性高的方法。
[0012]【专利附图】
【附图说明】
图1为疏水性离子液体相的紫外吸收光谱。图中a.滴加硼氢化钠之前疏水性离子液体[BMIM] [PF6]相b.滴加硼氢化钠之后疏水性离子液体相的紫外吸收光谱。插入的图:左图未加NaBH4离子液体相的颜色，右图加NaBH4离子液体相的颜色。
[0013]图2 (A)疏水性离子液体包裹金纳米粒子溶胶的低倍透射电镜图，(B)疏水性离子液体包裹金纳米粒子溶胶的高倍透射电镜图。
[0014]图3不同修饰(玻碳)电极在含有0.5 mM 二茂铁的溶液中的电化学循环伏安图。
[0015]图 4 为 ChOx-1L-capped AuNPs/GCE 对 0，0.1, 0.4, 0.6, 3.0, 5.0, 8.0,10.0, 20.0, 30.0和50.0 μ M浓度的胆固醇检测DPV图。
[0016]图5胆固醇浓度与电流的关系图，插图为胆固醇的还原峰电流与其浓度和峰电流的比值线性关系图。
[0017]【具体实施方式】
为了更清楚的说明本发明的内容，下面结合附图对本发明的技术方案再作进一步的说明: 本发明实施过程中所使用的仪器和药品:
CHI 660C电化学工作站(上海辰华仪器公司)用于进行循环伏安的实验，石英管加热式自动双重纯水蒸馏器(1810Β，上海亚太技术玻璃公司)用于蒸二次蒸馏水。紫外可见分光光度计(1102，上海天美科学仪器有限公司)和透射电子显微镜(JEOL JSM-6700F,日本光学公司)用于表征金纳米粒子，电子天平(北京赛多利斯仪器有限公司)用于称量药品。超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。三氧化二铝打磨粉(0.30 μ m，0.05 μ m，上海辰华仪器试剂公司)用于处理玻碳电极。饱和甘汞参比电极，钼对电极，离子液体(兰州化学物理研究所);胆固醇氧化酶(上海源叶生物技术有限公司);磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钾、硝酸银、硝酸钾(西安化学试剂厂)；高纯氮气(纯度为99.999% (02 < 0.001%))。实验过程中使用的水均为二次蒸馏水，实验所用的试剂均为分析纯。
[0018]下面结合附图对本发明的技术方案再作进一步的说明:
一种离子液体包裹金纳米粒子修饰的玻碳电极用于胆固醇检测的制备方法，包括以下步骤:
a.将2 mL [BMIM] [PF6]和 2 mL HAuC14水溶液等体积混合，加入 200 μ L 0.01 mol/L的柠檬酸三钠，之后搅拌3 min。慢慢逐滴滴加400 yL 5 mmol/L的硼氢化钠到混合溶液中，搅拌15 min，静置20 min得到分层的离子液体包裹的金纳米粒子溶胶和水溶液，将水吸出，用蒸馏水洗涤溶胶三次，以除去剩余的柠檬酸三钠；
将5 mg胆固醇氧化酶分散到200 UL离子液体包裹的金纳米粒子溶胶中，水温控制在30°C，以免酶失活，超声30min，直到看到均匀，稳定的黄黑色分散液，4°C冰箱储存；
b.将玻碳电极依次用0.3 μ m、0.05 μ m的三氧化二铝悬浊液抛光成镜面，再依次经体积分数为95 %的乙醇、二次蒸馏水超声清洗后，得到处理后的玻碳电极；插入含有I mM铁氰化钾探针分子的0.1 M氯化钾电解质溶液中，并采用以玻碳电极为工作电极、钼为对电极、饱和的甘汞电极为参比电极的三电极体系进行循环伏安扫描，对裸玻碳电极进行表征；再将电极取出用二次蒸馏水冲洗并吹干，备用。
[0019]在上述处理好的裸玻碳电极上滴涂4 μ L步骤a得到的储备液，从而制得胆固醇氧化酶离子液体包裹的金纳米粒子修饰的玻碳电极(ChOx-1L-AuNPs/GCE)。
[0020]下面，本发明对合成的离子液体包裹金纳米粒子进行表征及修饰电极对胆固醇进行检测:
本发明采用紫外分光光度计和透射电子显微镜表征离子液体包裹的金纳米粒子；在电化学工作站的技术选项中选择循环伏安技术和差示脉冲伏安技术，饱和甘汞电极为参比电极，钼柱为对电极，直径3mm的修饰玻碳电极为工作电极。循环伏安技术的电位窗设置为-0.6V-0.2V。
[0021]图1为疏水性离子液体相的紫外吸收光谱。图中:a.滴加硼氢化钠之前疏水性离子液体[BMIM][PF6]相b.滴加硼氢化钠之后疏水性离子液体相的紫外吸收光谱。对比图1中曲线(a，b)可以明显看到在540nm波长处有强烈的吸收峰，其为金纳米粒子在离子液体中的特征吸收峰。同时，由插图观察到滴加硼氢化钠之前离子液体相的颜色为黄色，加硼氢化钠之后的溶胶颜色为蓝黑色，说明离子液体中有金纳米粒子生成。
[0022]图2为疏水性离子液体包裹的金纳米粒子溶胶的透射电镜图，其中图(A)为疏水性离子液体包裹的金纳米粒子溶胶的低倍透射电镜图，从图中可以清晰的看到金纳米粒子的直径约为15nm，而且金纳米颗粒为非常规则的小圆球。这是由于离子液体和金纳米颗粒之间的相互作用使得金纳米颗粒在离子液体中有高的分散性和稳定性。图(B)为疏水性离子液体包裹的金纳米粒子溶胶的高倍透射电镜图，可以进一步说明合成的金纳米颗粒晶格间距为2.35nm,对应于金的111面。
[0023]图3不同修饰(玻碳)电极在含有0.5 mM 二茂铁的溶液中的电化学循环伏安图。裸的玻碳电极对二茂铁的信号响应为a曲线所示；在裸玻碳电极表面上滴涂4μ L的[ΒΜΙΜ][PF6]后，IL/GCE对二茂铁的信号响应为b曲线所示，其氧化还原峰电流为3.5 μ A，相比a曲线二茂铁的氧化还原峰对称性变好，峰电位差减小，而且氧化还原峰电流明显增大，其原因为导电性的离子液体滴涂到电极表面加速了电子转移；但当在裸玻碳电极表面滴涂4yL的IL- capped AuNPs后，峰电流信号相比b曲线增大到5.5 μ A (如c曲线所示),说明金纳米粒子的存在可以明显的提高修饰电极的导电性，还说明IL-capped AuNPs复合物对疏水性的分析物有更好的化学响应。
[0024]图 4 为 ChOx-1L-capped AuNPs/GCE 对 0，0.1, 0.4，0.6，3.0, 5.0, 8.0,10.0, 20.0, 30.0和50.0 μ M浓度的胆固醇检测DPV图。氧气存在的条件下，胆固醇氧化酶在电极表面发生直接电化学反应及其用于胆固醇检测，化学反应式如下:
化学反应(I)为，胆固醇氧化酶的氧化还原反应，其在修饰电极表面发生了直接电子转移，出现了一对氧化还原峰。随着胆固醇的逐渐加入，ChOx(FAD)和溶液中的胆固醇发生反应，如化学式(3)所示，导致ChOx (FAD)的浓度降低，还原峰电流逐渐减小，说明胆固醇氧化酶对胆固醇有电化学响应。图4说明胆固醇氧化酶的还原峰电流越小，则修饰玻碳电极对胆固醇检测越灵敏。
[0025]图5胆固醇浓度与电流的关系，插图为胆固醇的还原峰电流与其浓度和峰电流的比值线性关系图。由图5可以看出，对胆固醇检测的线性范围为IX l(T7to 5X10-5 mol/L,检出限为3.3 X 10_8mOl/L。相对于表I所列的现有电极，
本发明制备的离子液体包裹金纳米粒子修饰的玻碳电极用于胆固醇检测线性范围宽，检出限低。
【权利要求】
1.一种离子液体包裹金纳米粒子修饰玻碳电极的制备方法，其步骤是: a.将[BMM][PF6]和HAuCl4水溶液等体积混合，加入0.01mol/L的柠檬酸三钠，之后搅拌3 min,慢慢逐滴滴加5 mmol/L的硼氢化钠到混合溶液中,搅拌15 min,静置20 min得到分层的离子液体包裹的金纳米粒子溶胶和水溶液，将水吸出，用蒸馏水洗涤溶胶三次，以除去剩余的柠檬酸三钠； 将胆固醇氧化酶分散到离子液体包裹的金纳米粒子溶胶中，水温控制在25°C?40°C，以免酶失活，超声30min，直到分散均匀，呈稳定的黄黑色分散液，4°C冰箱储存； b.将玻碳电极依次用0.3 μ m、0.05 μ m的三氧化二铝悬浊液抛光成镜面，再依次经体积分数为95 %的乙醇、二次蒸馏水超声清洗后，得到处理后的玻碳电极；将玻碳电极插入含有ImM铁氰化钾探针分子的0.1M氯化钾电解质溶液中，并采用以玻碳电极为工作电极、钼为对电极、饱和的甘汞电极为参比电极的三电极体系进行循环伏安扫描，对裸玻碳电极进行表征；再将电极取出用二次蒸馏水冲洗并吹干，备用； c.在上述处理好的裸玻碳电极上滴涂步骤a得到的储备液，从而制得胆固醇氧化酶离子液体包裹的金纳米粒子修饰的玻碳电极。
2.用权利要求1制备离子液体包裹金纳米粒子修饰玻碳电极对胆固醇的检测方法，其步骤是: a.以胆固醇氧化酶-离子液体包裹的金纳米粒子修饰的玻碳电极为工作电极、钼柱为对电极、饱和的甘汞电极为参比电极组成三电极体系，并将其共同浸入含有0，0.1，0.4，`0.6, 3.0, 5.0, 8.0, 10.0, 20.0, 30.0 和 50.0 μ M 的胆固醇的 0.2M pH 为 7.0 的磷酸盐缓冲溶液中进行差示脉冲扫描，得到不同浓度胆固醇的差示脉冲伏安曲线图； b.采用 origin 软件作图，绘制 ChOx-1L-AuNPs/GCE 在浓度为 0，0.1, 0.4，0.6，`3.0，5.0，8.0，10.0, 20.0, 30.0和50.0 μ M胆固醇中的差示脉冲伏安曲线和胆固醇的还原峰电流和其浓度与峰电流的比的线性关系图。
【文档编号】G01N27/48GK103940874SQ201410123445
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2014年3月31日 优先权日:2014年3月31日
【发明者】刘秀辉, 董明君, 刘盼盼, 李嘉伟, 卢小泉 申请人:西北师范大学