筛选体外血浆中h7n9生物标记物的方法及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种筛选体外血浆中H7N9生物标记物的方法及其应用。1）制备多例H7N9患者的血浆样本，2）检测血浆样本的细胞因子及趋化因子，获得细胞因子及趋化因子的数据，3）比较H1N1患者、健康对照血浆中的细胞因子及趋化因子，分析处理数据，获得H7N9生物标记物，4）从步骤3）所述的H7N9生物标记物中确定死亡风险的生物标记物。本发明从免疫分子角度对H7N9患者的细胞因子及趋化因子进行检测分析，从而建立有效的H7N9免疫分子图谱，并将其用于体外评估H7N9患者死亡风险。该方法的灵敏度及特异性均优于传统的检测方法。
【专利说明】筛选体外血浆中H7N9生物标记物的方法及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物检测【技术领域】，尤其涉及新的免疫标志物-H7N9患者血浆细胞因子及趋化因子，可在体外检测H7N9患者死亡的风险。
【背景技术】
[0002]人禽流感病毒依据禽甲型流感病毒外膜血凝素(H)和神经氨酸酶(N)蛋白抗原性不同，目前已发现并确定为17个H亚型(H1?H17)和10个N亚型(NI?N10)。上述H亚型和N亚型相互组合形成了上百种不同HxNx亚型的禽甲型流感病毒，禽类特别是水禽一般是这些流感病毒的自然宿主，且主要在禽类中存在和传播流行。
[0003]2013年以前H7N9亚型流感病毒仅在禽类中发现，在荷兰、日本及美国等地曾发生过禽间暴发疫情，但未发现过人感染情况。2013年3月底，新型的H7N9亚型禽流感病毒在上海和安徽两地率先发现。从2013年4月至2014年3月7日，全国人感染H7N9禽流感确诊病例总计384例，其中死亡100例。之前报道的111例患者中，76.6%的患者收住ICU治疗，其中有70%的患者发展为急性呼吸窘迫综合征。患者平均年龄为61岁，65岁以上患者比例达42.3%，31.5%患者为女性。尽管进行了综合的治疗，患者死亡率仍高达27%。
[0004]H7N9感染者外周血中存在高细胞因子血症。据报道H5N1感染患者的血中也存在高细胞因子血症。然而，尚无预测疾病严重程度及预后的生物标志物报道。重症H7N9感染者死亡率高，尽管迫切需要预测潜在致命禽流感感染的疾病进展及预后的生物标志物，但是目前尚无公开的报道。
[0005]液相芯片，也称为微球体悬浮芯片，是基于xMAP技术的生物芯片技术平台，它是在不同荧光编码的微球上进行抗原-抗体、酶-底物、配体-受体的结合反应及核酸杂交反应，通过红、绿两束激光分别检测微球编码和报告荧光来达到定性和定量的目的，一个反应孔内可以完成多达100种不同的生物学反应，是继基因芯片、蛋白芯片之后的新一代高通量分子检测技术平台。
【发明内容】
[0006]为了克服现有技术的不足，本发明的目的是提供筛选体外血浆中H7N9生物标记物的方法及其应用。本发明建立了一套有效的方法，用于在分离的血浆中体外检测H7N9患者细胞因子及趋化因子水平用以评估H7N9患者死亡的风险，即通过测定H7N9患者、HlNl患者及健康对照组的细胞因子及趋化因子，进行差异分析，寻找新的免疫标志物，从而对H7N9患者进行更全面的早期筛查和检测。
[0007]本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下所述。
[0008]一种筛选体外血浆中H7N9生物标记物的方法，包括下列步骤:
O制备多例H7N9患者的血浆样本，
2)检测血浆样本的细胞因子及趋化因子，获得细胞因子及趋化因子的数据，
3)比较HlNl患者、健康对照血浆中的细胞因子及趋化因子，分析处理数据，获得H7N9生物标记物，
4)从步骤3)所述的H7N9生物标记物中确定死亡风险的生物标记物 步骤2)所述的检测采用液相芯片技术。
[0009]步骤3)所述的分析处理数据采用SPSS软件进行处理。
[0010]步骤3)所述的H7N9生物标记物为至少包括以下生物标记物中多种的组合，所述的生物标记物选自 MIF、SCF、MCP-U HGF, SCGF-beta、IL-18、IP-1O 及 IFN- Y。
[0011]一种H7N9疾病的严重程度的评估方法、监测疾病进展或评价治疗的方法，通过定量或定性比较患者与正常对照的H7N9生物标记物得知疾病严重程度，或者监测疾病进展，或者评价治疗。
[0012]所述的H7N9生物标记物为至少包括以下生物标记物中多种的组合，所述的生物标记物选自 MIF、SCF、MCP-1、HGF、SCGF-beta、IL-18、IP-10 及 IFN-Y。
[0013]一种评估H7N9疾病严重程度的试剂盒，主要在于定量检测H7N9生物标记物。
[0014]所述的H7N9生物标记物为至少包括以下生物标记物中多种的组合，所述的生物标记物选自 MIF、SCF、MCP-1、HGF、SCGF-beta、IL-18、IP-10 及 IFN-Y。
[0015]本发明的有益效果是:由于本发明应用液相芯片技术，从免疫分子角度对H7N9患者的细胞因子及趋化因子进行检测分析，从而建立有效的H7N9免疫分子图谱，并将其用于体外评估H7N9患者死亡风险。该方法的灵敏度及特异性均优于传统的检测方法。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明。
[0017]图1 (A)是比较6例健康对照组、21例HlNl患者细胞因子/趋化因子水平；
图1 (B)是比较6例健康对照组、21例HlNl患者与46例H7N9患者细胞因子/趋化因子水平；
其中，图1 (A)和图1 (B)中，
a:对照组与HlNl患者发病第I周组比较，
b:对照组与HlNl患者发病第2周组比较，
c:对照组与HlNl患者发病15天后组比较，
d: HlNl患者发病第I周组与发病第2周组比较，
e: HlNl患者发病第I周组与发病15天后组比较，
f: HlNl患者发病第2周组与发病15天后组比较，
g:对照组与H7N9患者发病第I周组比较，
h:对照组与H7N9患者发病第2周组比较，
i:对照组与H7N9患者发病15天后组比较，
j: H7N9患者发病第I周组与发病第2周组比较比较，
k: H7N9患者发病第I周组与发病15天后组比较，
I: H7N9患者发病第2周组与发病15天后组比较， m: HlNl患者发病第I周组与H7N9患者发病第I周组比较， n: HlNl患者发病第2周组与Η7Ν9患者发病第2周组比较，
O: HlNl患者发病15天后组与Η7Ν9患者发病15天后组比较；图2是与H7N9感染者CT值高度相关的细胞因子/趋化因子；
图3是与H7N9感染者APACHE II评分高度相关的细胞因子/趋化因子；
图4是与H7N9患者预后相关的细胞因子/趋化因子；
图5是H7N9患者发病第二周血浆MIF的ROC曲线；
图6是H7N9患者发病第二周血浆SCF的ROC曲线；
图7是H7N9患者发病第二周血浆MCP-1的ROC曲线表；
图8是H7N9患者发病第二 周血浆HGF的ROC曲线表；
图9是H7N9患者发病第二周血浆SCGF-beta的ROC曲线表；
图10是H7N9患者发病第二周血浆IP-10的ROC曲线表；
图11是H7N9患者发病第二周血浆IL-18的ROC曲线表；
图12是H7N9患者发病第二周血浆IFN-gamma的ROC曲线表；
图13是H7N9患者发病第二周CRP的ROC曲线表；
图14是H7N9患者发病第二周Pa02/Fi02的ROC曲线。
【具体实施方式】
[0018]本发明的具体方案由以下实施例给出:
H7N9患者血浆免疫因子的测定
(一)实验样本
1、H7N9患者46例，发病2周内的患者35例，血浆样本80份。平均年龄61岁，其中男性22人。
[0019]2，HlNl患者21例，平均年龄53.9岁，其中男性14人。
[0020]3、对照样本6人，均取自健康志愿者。
[0021](二)实验材料
I，试剂 Bio-Plex Pro Human Cytokine Array 27-Plex Group 1、21_Plex GroupII，滤纸，Iml排枪，200ul排枪，Iml无菌枪头，200ul无菌枪头，IOul无菌枪头2，仪器Luminex200，水平震荡仪，磁力架，1.5mlEP管，2mlEP管。
[0022](三)实验步骤
1、病例的米集
H7N9患者的确诊根据流行病学接触史、临床表现及实验室检查结果，可作出人感染H7N9禽流感的诊断。在流行病学史不详的情况下，根据临床表现、辅助检查和实验室检测结果，特别是从患者呼吸道分泌物标本中分离出H7N9禽流感病毒，或H7N9禽流感病毒核酸检测阳性，或动态检测双份血清H7N9禽流感病毒特异性抗体水平呈4倍或以上升高，可作出人感染H7N9禽流感的诊断
HlNl患者确诊:出现流感样临床表现，同时有以下一种或几种实验室检测结果:(I)甲型HlNl流感病毒核酸检测阳性(可采用real-time RT-PCR和RT-PCR方法)；(2)分离到甲型HlNl流感病毒；(3)双份血清甲型HlNl流感病毒的特异性抗体水平4倍或4倍以上升高。
[0023]2、血浆的制备:
患者及对照组于清晨空腹取外周血3ml置于EDTA抗凝的一次性玻璃采血管内，4° C3000转离心lOmin，分离得到的血浆_80°C冰箱保存。
[0024]3、液相芯片处理
值得指出的是，本发明以液相芯片为例对细胞因子及趋化因子进行检测，对于本领域技术人员来说其它高通量的方法也足于胜任检测分析任务。
[0025]根据说明书配置标准品、coupledbeads、detection antibodies 以及Streptavidin-PEo detection antibodies 用前 15 分钟配置，Streptavidin-PE 用前 10 分
钟配置。
[0026]I)每孔加入IOOul wash buffer润板,弃上清,板底用滤纸吸干。
[0027]2)每孔加入 50ul coupled beads,洗板 2 次。
[0028]3)加入标准品、样本。封口避光后将孔板置于振荡器上室温下孵育30分钟。
[0029]4)用 wash buffer 洗板 3 次。每孔加入 25ul detection antibody,封口避光后将孔板置于振荡器上室温下孵育30分钟。
[0030]5)将孔板置于磁力架上,弃去上清,板底用滤纸吸干,用wash buffer洗板3次。每孔加入50ul str印tavidin-PE，封口避光后将孔板置于振荡器上室温下孵育10分钟。
[0031]6)将孔板置于磁力架上,弃去上清,板底用滤纸吸干,用wash buffer洗板3次。每孔加入125 μ I assay buffer,封口避光，1，100 rpm振荡器震荡30秒。Luminex上机检测及其数据分析。
[0032]4、芯片检测及数据的采集
利用χΡΟΝΕΝΤ 3.1 software进行初始数据分析。利用SPSS16.0进行统计分析。
[0033]5、数据分析
1)H7N9患者相关免疫因子模型的建立
根据距离发病时间的不同将46份H7N9患者血浆样本、21份HlNl患者血浆样本分为发病第一周样本(H1N1样本10份，H7N9样本24份)，发病第二周样本(H1N1样本7份，H7N9样本11份)，发病15天以后的血浆样本(H1N1样本4份，H7N9样本11份)。健康对照血浆6例。建立免疫因子的H7N9患者血浆差异模型。利用Mann-Whitney U检验检测不同组的细胞因子及趋化因子间差异的显著性。Spearman’s rank correlation coefficientanalysis用于免疫因子与病毒载量及疾病严重程度的相关性分析。Benjamini & Hochbergmethod用于控制多重检验的假阳性率。ROC曲线用于预测分析。设定双侧检验显著性水平为 Ρ〈0.05
2)Η7Ν9患者相关免疫因子预测致命预后模型的建立
收集患者采血当天的CRP及APACHE II，计算CRP及APACHE II对Η7Ν9患者疾病严重程度及死亡预测的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值，评价该模型的有效性。
[0034]6、实验结果
I)Η7Ν9患者相关免疫因子模型的数据分析:采用SPSS16.0对46例Η7Ν9患者、21例HlNl患者及6例健康志愿者免疫因子进行比较和统计学分析，结果显示所检测的Η7Ν9禽流感患者外周血48种细胞因子及趋化因子中有34种在发病I周组较健康对照组表达有显著差异(Ρ〈0.05)，水平显著升高。Η7Ν9禽流感患者发病第I周组有28种细胞因子及趋化因子水平显著高于发病同期的HlNl患者。以上升高的细胞因子包括Thl型细胞因子(如IP-10、IL-2、IFN-Y、TNF-a 和 IL-1 β 等)、Th2 型细胞因子(IL-4、IL-6、IL-10 和 IL-13)及TH17型细胞因子(IL-17)，H7N9禽流感患者发病第2周组有类似的变化趋势。这些均表明H7N9禽流感患者存在显著的细胞因子风暴。如图1 (A)、l (B)所示。
[0035]2) H7N9患者相关免疫因子与患者病毒载量的相关性分析:采用SPSS16.0进行 Spearman’s rank correlation coefficient analysis,石开究发现 IP-10, MIG, MIF,HGF及IL-18在患者发病第一周、第二周与患者的病毒载量正相关；SCF，beta_NGF及SCGF-beta在患者发病第二周与患者的病毒载量正相关。研究结果表明H7N9病毒诱导了高细胞因子血症，如图2所示。
[0036]3)H7N9患者相关免疫因子与患者疾病严重程度的相关性分析:采用SPSS16.0进行 Spearman’s rank correlation coefficient analysis,石开究发现 SCF、HGF、MIF、IL-18、IP-10及MIG在患者发病第一周、第二周与患者的APACHE II评分正相关，SCGF-beta在患者发病第二周与患者的APACHE II评分正相关。研究结果表明H7N9病毒诱导的高细胞因子血症与疾病的严重程度正相关，如图3所不。
[0037]4) H7N9患者相关免疫因子与患者致命预后的相关性分析:根据患者的死亡与否，将患者分为好转组及死亡组，通过Mann-Whitney U检验发现死亡患者发病第二周相关免疫因子HGF, SCF, IL-18, IP-10, MIF及SCGF-beta水平较好转组发病第二周显著升高，如图4所示。
[0038]5) H7N9患者相关免疫因子预测患者致命的预后:采用SPSS16.0计算所有显著升高的相关免疫因子以及Pa02/Fi02 ratios及CRP的ROC曲线的曲线下面积。研究发现MIF，SCF, MCP-1, HGF, SCGF-beta, IP-10, IL-18 及 IFN-Y 较其他免疫因子 ROC 的曲线下面积更高，且 MIF、SCF、MCP-1、HGF 及 SCGF-beta 较 Pa02/Fi02 ratios 及 CRP 的曲线下面积更高，更能预测患者致命的预后，如图5-图14所示。
【权利要求】
1.一种筛选体外血浆中H7N9生物标记物的方法，其特征在于，包括下列步骤: O制备多例H7N9患者的血浆样本， 2)检测血浆样本的细胞因子及趋化因子，获得细胞因子及趋化因子的数据， 3)比较HlNl患者、健康对照血浆中的细胞因子及趋化因子，分析处理数据，获得H7N9生物标记物， 4)从步骤3)所述的H7N9生物标记物中确定死亡风险的生物标记物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)所述的检测采用液相芯片技术。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)所述的分析处理数据采用SPSS软件进行处理。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)所述的H7N9生物标记物为至少包括以下生物标记物中多种的组合，所述的生物标记物选自MIF、SCF, MCP-U HGF、SCGF-beta、IL-18、IP-1O 及 IFN- Y。
5.—种H7N9疾病的严重程度的评估方法、监测疾病进展或评价治疗的方法，其特征在于，通过定量或定性比较患者与正常对照的H7N9生物标记物得知疾病严重程度，或者监测疾病进展，或者评价治疗。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的H7N9生物标记物为至少包括以下生物标记物中多种的组合，所述的生物标记物选自MIF、SCF、MCP-1、HGF、SCGF-beta、IL-18、IP-1O 及 IFN- Y。
7.一种评估H7N9疾病严重程度的试剂盒，其特征在于，主要在于定量检测H7N9生物标记物。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的H7N9生物标记物为至少包括以下生物标记物中多种的组合，所述的生物标记物选自MIF、SCF、MCP-1、HGF、SCGF-beta、IL-18、IP-1O 及 IFN- Y。
【文档编号】G01N33/53GK103954748SQ201410127951
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2014年4月1日 优先权日:2014年4月1日
【发明者】李兰娟, 郭静, 陈瑜 申请人:浙江大学