髓过氧化物酶抗体(MPO-Ab)定量测定试剂盒及其检测方法
【专利摘要】本发明属于临床免疫学检测【技术领域】,公开了一种髓过氧化物酶抗体(MPO-Ab)定量测定试剂盒,包括磁分离试剂、酶标记试剂、校准品、清洗浓缩液、底物溶液以及稳定剂。本发明还公开了上述试剂盒的制备方法。本发明还公开了上述试剂盒的检测方法。本发明制备的试剂盒精确度、灵敏度以及稳定性较好,并且成本低廉,操作简单,具备广阔的应用前景。
【专利说明】髓过氧化物酶抗体(MPO-Ab)定量测定试剂盒及其检测方 法
【技术领域】
[0001] 本发明属于临床免疫学检测【技术领域】,具体涉及一种髓过氧化物酶抗体(MPO-Ab) 定量测定试剂盒及其检测方法。
[0002]
【背景技术】
[0003] 血管炎是一组以血管的炎症与坏死为主要病理改变的炎性疾病,包括血管壁及血 管周围有炎细胞浸润,并伴有血管损伤,包括纤维素沉积、胶原纤维变性、内皮细胞及肌细 胞坏死,又称脉管炎。临床表现因受累血管的类型、大小、部位及病理特点不同而表现各异。 其常累及全身多个系统(例如皮肤、肾脏、肺、神经系统等),引起多系统、多脏器的功能障 碍,但也可局限于某一脏器。致病因素直接作用于血管壁的为原发性血管炎,在血管炎症基 础上产生一定的临床症状和体征者为血管炎疾病;由邻近组织炎症病变波及血管壁致病的 为继发性血管炎。
[0004] 髓过氧化物酶(MP0)又称过氧化物酶,是一种重要的含铁溶酶体,存在于髓系细 胞(主要是中性粒细胞和单核细胞)的嗜苯胺蓝颗粒中,是髓细胞的特异性标志;它也是抗 中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)的主要靶抗原,是嗜中性粒细胞杀灭吞噬微生物的重要物质, 抗MP0抗体属于ANCA的一种,主要针对中性粒细胞和单核粒细胞的细胞浆成分。64%的新 月体性肾小球肾炎可检测出抗MP0抗体,显微镜下多血管炎患者阳性率为60% ;变应性肉 芽肿性血管炎患者可检测出抗MP0抗体;韦格纳肉芽肿患者阳性率为24%,许多体内和体 外的研究数据都提示抗MP0抗体与血管炎的致病机制有关。
[0005] 临床检测髓过氧化物酶抗体的常见方法包括放射免疫分析法以及间接免疫荧光 法等。但这些方法都存在着不足之处。放射免疫分析法是利用同位素标记的与未标记的抗 原,同抗体发生竞争性抑制反应,是一种在无须采用生物测定方法的情况下用于检测抗原 的实验室测定方法。该法极其敏感而又极其特异,但其却需要具备尖端复杂的设备,且成本 也不低。同时,还需要特殊的预防措施,因为其要用到放射性物质。因此,如今放射免疫分 析法在很大程度上已经被ELISA所取代。间接免疫荧光法的基本原理是用特异性的抗体与 载玻片中的抗原结合后形成抗原抗体复合物,继用荧光抗体与抗原抗体复合物结合,形成 抗原抗体荧光复合物。该方法在分析结果时无法根据分子量的大小区分非特异性识别;操 作相对复杂,需要价格较昂贵的荧光显微镜,只能进行定性检测,不能进行定量测定。
[0006]
【发明内容】
[0007] 为了克服现有技术的不足,本发明提供了一种具备较佳的准确度、精密度和稳定 性的试剂盒。本发明是通过如下技术方案来实现的: 一种髓过氧化物酶抗体(MPO-Ab)定量测定试剂盒,包括磁分离试剂、酶标记试剂、校 准品、清洗浓缩液、底物溶液以及稳定剂; 所述磁分离试剂的制备步骤如下: 一、配制磁微粒缓冲液,以配制1L为例: 1) 、量取800mL纯化水于容器中,称取Tris12.lg和NaCl8. 5g加入容器中,充分搅拌 至完全溶解; 2) 、称取BSA5g,量取新生牛血清50mL以及Proclin300 0. 2mL至容器中,充分搅拌至 完全溶解; 3) 、用4M的HC1调pH,控制pH在7. 9-8. 1之间; 4) 、最后用纯化水定容至1L,2-8°C保存待用。
[0008] 二、制备磁分离试剂: 1) 、取100mg含羧基(C00H)活性基团的磁微粒,用0? 025mol/L,pH4. 5-5的MES缓冲 液10mL混悬; 2) 、加入0. 5-lmL浓度为10mg/mL的EDC水溶液,室温混悬30-60min; 3) 、磁分离,吸去上清,用0. 025mol/L,pH4. 5-5MES缓冲液10mL重悬; 4) 、加入 0? 02-0.lmg的MP0 抗原,室温混悬 120-240min; 5) 、磁分离,吸去上清,用磁微粒缓冲液重悬到lmg/mL,完成磁分离试剂的制备。
[0009] 所述酶标记试剂的制备步骤如下: 一、配制酶标记试剂稀释液,以配制1L为例: 1) 、量取800mL纯化水于容器中,称取H印es6. 06g、NaCl8. 5g加入容器中,充分搅拌 至完全溶解; 2) 、称取BSA5g,Zncl20.1g、Proclin-300 0.2mL和MgCl20.1g于容器中中,充分搅拌 至完全溶解; 3) 、用4M的HC1调pH,控制pH在7. 5-8. 0之间; 4) 、最后用纯化水定容至1L,2-8°C保存待用。
[0010] 二、碱性磷酸酶(ALP)与MP0抗体的偶联 1) 、取lmgMP0抗体,加入10mg/mL的偶联剂2-IT溶液2-4iiL,室温静置20min,加入 0.lm〇L/L的甘氨酸溶液10yL,室温静置5min;用G-25凝胶柱除盐,收集活化后的抗体, 2-8 °C保存备用; 2) 、取1. 5mg的ALP溶液,加入5mg/mL的SMCC溶液10-20iiL,室温静置30min,用G-25 凝胶柱除盐,收集活化后的ALP,2-8°C保存备用; 3) 、将上述活化的MP0抗体与活化的ALP混合,2-8 °C条件下静置12-24h,用 Superdex200凝胶纯化柱纯化偶联物,获得MP0抗体-ALP连接物浓溶液,2-8°C保存备用。
[0011] 4)、将MP0抗体-ALP连接物浓溶液用酶标记物稀释液稀释到0. 02-0. 1yg/mL,完 成酶标记试剂的制备。
[0012] 上述校准品的制备步骤如下: 一、配制校准品稀释液: 1) 、量取600mL纯化水于容器中,称取200mL新生牛血清加入容器中,充分搅拌混合均 匀; 2) 、称取磷酸氢二钾3. 4g、磷酸二氢钾0. 36g、Proclin300 0. 02mL加入容器中,充分 搅拌至完全溶解; 3) 、用4M的HC1调pH,控制pH在7. 0-7. 5之间; 4) 、最后用纯化水定容至1L,2-8°C保存待用。
[0013] 二、配制校准品:用校准品稀释液将MP0抗体分别配制为0、5、20、50、150、300U/mL 共6个浓度点。
[0014] 所述清洗浓缩液的制备步骤如下:以配制1L为例: 1) 、量取800mL纯化水于容器中,称取Tris12.lg和NaCl8. 5g于容器中,充分搅拌至 完全溶解; 2) 、称取Tween-20 5g、TritonX-100 (聚乙二醇辛基苯基醚)5g,充分搅拌,直至完 全混勻; 3) 、用4M的HC1调pH,控制pH在7. 5-8. 0之间; 4) 、最后定容1000mL,2-8°C保存。
[0015] 所述底物溶液的制备步骤如下:以配制1L为例: 1) 、称取NaCl8.87g、Tris3.72g、Na2S03 0 . 00 3g和Proclin-300 0.4ml于 1L烧杯中; 2) 、用量筒量取600ml纯化水于1L烧杯中,充分搅拌,直至完全溶解,调pH,控制其范围 在7. 5 - 8. 0之间; 3) 、加入250mlLumi-Phos530后,用纯化水定容至1000ml,混匀后即得。 所述稳定剂的制备步骤如下:以配制1L为例: 1) 、称取乙二胺四乙酸二钠2. 3g和氯化镁1. 4g于1L烧杯中; 2) 、用量筒量取900ml纯化水于1L烧杯中,充分搅拌,直至完全溶解,调pH,控制其范围 在7. 2 - 7. 8之间; 3) 、加入50ml甘油后,用纯化水定容至1000ml,混匀后即得。
[0016] 本发明的主要创新之处主要在于: 1、本发明试剂盒提供了一种接近均相的反应体系,与该试剂盒现有间接法ELISA技术 相比,本发明试剂盒具有更高的检测灵敏度和线性范围,并且样本不需要稀释,反应过程只 需要一步清洗,在出结果时间上大大缩短,实验操作简便可靠,并达到了较佳的性能参数。 并且竞争法相对间接法试剂工作浓度要低很多,大大降低了试剂成本。
[0017] 2、本发明公开了一种测定MP0抗体的新技术,使得反应过程更加快速可靠,实验 数据灵敏有效,在提高产品性能的同时,并且大大降低了产品成本; 3、试剂盒中的磁分离试剂,酶标记物,校准品、清洗液浓缩液等组份均是该反应体系下 的最优配方,给该试剂盒的使用效期及检测性能提供了有力保障。
[0018] 4、本发明试剂盒的精确度、灵敏度以及稳定性均优于市场同类产品,并且成本低 廉,操作简单,应用前景广阔。
[0019]
【具体实施方式】
[0020] 以下将采用具体的实施例来对本发明作进一步的解释,但是不应当看作是对本 发明创新精神的限制。
[0021] 实施例1、磁分离试剂的制备: 一、磁微粒缓冲液配制过程,以配制1L为例: 1、 量取800mL纯化水于容器中,称取Trisl2.lg和NaCl8. 5g加入容器中,充分搅拌至 完全溶解; 2、 称取BSA5g,量取新生牛血清50mL,Proclin300 0. 2mL至容器中,充分搅拌至完全 溶解; 3、 用4M的HC1调pH,控制pH在7. 9-8. 1之间; 4、 最后用纯化水定容至1L,2-8°C保存待用。
[0022] 二、磁分离试剂的制备过程 1、 取含羧基(C00H)活性集团的磁微粒,每克(g)磁微粒(干重)羧基含量不低于0. 3毫 摩尔(mmoL),具有超顺磁性,直径在0. 5-2ym之间; 2、MP0抗原:可以为天然抗原或重组抗原,纯度应超过95% ; 3、 2_吗啉乙磺酸(MES)、碳二亚胺(EDC)、Tris、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(Ifepes)应达到化 学纯; 4、 取 100mg磁微粒,用 0. 025mol/L,pH4. 5-5 的MES缓冲液 10mL混悬; 5、 加入0. 5-lmL新鲜配制的浓度为10mg/mL的EDC水溶液,室温混悬30-60min; 6、 磁分离,吸去上清,用0. 025mol/L,pH4. 5-5MES缓冲液10mL重悬; 7、 加入0? 02-0.lmg的MP0抗原,室温混悬120-240min; 8、 磁分离,吸去上清,用磁微粒缓冲液重悬到lmg/mL,完成磁分离试剂的制备。
[0023] 实施例2、酶标记试剂的制备: 一、酶标记试剂稀释液配制过程,以配制1L为例: 1、 量取800mL纯化水于容器中,称取H印es6. 06g、NaCl8. 5g加入容器中,充分搅拌至 完全溶解; 2、 称取BSA5g,Zncl20.1g、Proclin-300 0.2mL和MgCl20.1g于容器中中,充分搅拌 至完全溶解; 3、 用4MHC1调pH,控制pH在7. 5-8. 0之间; 4、 最后用纯化水定容至1L,2-8°C保存待用。
[0024] 二、碱性磷酸酶(ALP)与MP0抗体的偶联 1、MP0抗体,购自北京久峰润达生物技术有限公司,纯度超过95% ; 2、 碱性磷酸酶纯度应超过95%,比活性应超过1000U/mg,浓度超过5mg/mL; 3、 取lmgMP0抗体,加入10mg/mL的偶联剂2-IT(2-亚胺四氢噻吩)溶液2-4iiL,室 温静置20min,加入0.lm〇L/L的甘氨酸溶液10yL,室温静置5min;用G-25凝胶柱除盐,收 集活化后抗体,2-8°C保存备用; 4、 取1. 5mg的ALP溶液,加入5mg/mL的SMCC溶液10-20iiL,室温静置30min,用G-25 凝胶柱除盐,收集活化后ALP,2-8°C保存备用; 5、 将上述活化的MP0抗体与活化的ALP混合,2-8 °C条件下静置12-24h,用 Superdex200凝胶纯化柱纯化偶联物,获得连接物浓溶液,2-8°C保存备用。
[0025] 6、将MP0抗体-ALP连接物浓溶液用酶标记物稀释液稀释到0. 02-0. 1iig/mL,完成 酶标记试剂的制备。
[0026] 实施例3、校准品的制备: 一、校准品稀释液的配制: 1、 量取600mL纯化水于容器中,称取200mL新生牛血清加入容器中,充分搅拌混合均 匀; 2、 称取磷酸氢二钾3. 4g、磷酸二氢钾0. 36g、Proclin300 0. 02mL加入容器中,充分搅 拌至完全溶解; 3、 用4M的HC1调pH,控制pH在7. 0-7. 5之间; 4、 最后用纯化水定容至1L,2-8°C保存待用。
[0027] 二、校准品的配制: 1、用校准品稀释液将MP0抗体分别配制为0、5、20、50、150、300U/mL共6个浓度点。
[0028] 实施例4 :清洗浓缩液的制备: 清洗浓缩液配制过程,以配制1L为例: 1、 量取800mL纯化水于容器中,称取Tris12.lg和NaCl8.5g于容器中,充分搅拌至 完全溶解; 2、 称取Tween-20 5g、TritonX-100 (聚乙二醇辛基苯基醚)5g,充分搅拌,直至完 全混勻; 3、 用4M的HC1调pH,控制pH在7. 5-8. 0之间; 4、 最后定容1000mL,2-8°C保存。
[0029] 实施例5:底物溶液的制备: 底物溶液配制步骤,配制1L: 1、 称取NaCl8.87g、Tris3.72g、Na2S03 0 . 00 3g和Proclin-300 0.4ml于 1L烧杯中; 2、 用量筒量取600ml纯化水于1L烧杯中,充分搅拌,直至完全溶解,调PH,控制其范围 在7. 5 - 8. 0之间; 3、 加入250mlLumi-Phos530后,用纯化水定容至1000ml,混匀后即得。 实施例6稳定剂的制备: 1、 称取乙二胺四乙酸二钠2. 3g和氯化镁1. 4g于1L烧杯中; 2、 用量筒量取900ml纯化水于1L烧杯中,充分搅拌,直至完全溶解,调pH,控制其范围 在7. 2 - 7. 8之间; 3、 加入50ml甘油后,用纯化水定容至1000ml,混匀后即得。 实施例7 本发明试剂盒的测试方法如下: 1、 检测管内依次加入20iiL样本(或标准品)、50iiL磁分离试剂、50iiL酶标记试剂以 及稳定剂2iiL,混合均匀,37 ±0. 5°C条件下反应10min; 2、 检测管放至磁分离器上,静置2分钟;倒出上清液; 3、 清洗浓缩液用纯化水稀释15倍后(即为清洗液)使用,加300yL清洗液至检测管中, 置混匀器上振荡混匀30s。
[0030] 4、再重复步骤2、3、2两遍。
[0031] 5、加150iiL底物溶液至检测管中混匀后进行检测。
[0032]实施例8 本发明实施例1-6制备的试剂盒的分析性能评价: (1)灵敏度评价 检测"0"浓度样本,重复检测20次,计算相对发光强度(RLU)的平均值(M)和标准差 (SD),并计算M-2SD值,根据零浓度校准品和相邻校准品之间的浓度-RLU进行两点回归拟 合得出一次方程,将M-2SD值带入上述方程中,求出对应的浓度值,即为最低检测限。本方 法的灵敏度不大于0. 5U/mL。其中,A点发光值参见表1 :
【权利要求】
1. 一种髓过氧化物酶抗体(MPO-Ab)定量测定试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括磁 分离试剂、酶标记试剂、校准品、清洗浓缩液、底物溶液以及稳定剂。
2. 如权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述磁分离试剂的制备步骤如下: 一、 配制磁微粒缓冲液,以配制1L为例: 1) 、量取800mL纯化水于容器中,称取Tris 12. lg和NaCl 8. 5g加入容器中,充分搅拌 至完全溶解; 2) 、称取BSA 5g,量取新生牛血清50mL以及Proclin300 0. 2mL至容器中,充分搅拌至 完全溶解; 3) 、调pH,控制pH在7.9-8. 1之间; 4) 、最后用纯化水定容至1L,2-8°C保存待用; 二、 制备磁分离试剂: 1) 、取100mg含羧基活性基团的磁微粒,用0? 025mol/L,pH4. 5-5的MES缓冲液10mL 混悬; 2) 、加入0. 5-lmL浓度为10mg/mL的EDC水溶液,室温混悬30-60min ; 3) 、磁分离,吸去上清,用0. 025mol/L,pH4. 5-5 MES缓冲液10mL重悬; 4) 、加入 0? 02-0. lmg 的 MP0 抗原,室温混悬 120-240min ; 5) 、磁分离,吸去上清,用磁微粒缓冲液重悬到lmg/mL,完成磁分离试剂的制备。
3. 如权利要求1-2任其一所述的试剂盒,其特征在于,所述酶标记试剂的制备步骤如 下: 一、 配制酶标记试剂稀释液,以配制1L为例: 1) 、量取800mL纯化水于容器中,称取H印es 6. 06g、NaCl 8. 5g加入容器中,充分搅拌 至完全溶解; 2) 、称取 BSA 5g,Zncl20.1g、Proclin-300 0.2mL 和 MgCl20.1g 于容器中,充分搅拌至 完全溶解; 3) 、调pH,控制pH在7.5-8. 0之间; 4) 、最后用纯化水定容至1L,2-8°C保存待用; 二、 碱性磷酸酶(ALP)与MP0抗体的偶联 1) 、取lmg MP0抗体,加入10mg/mL的偶联剂2-IT溶液2-4iiL,室温静置20min,加入 0. lm〇L/L的甘氨酸溶液10 y L,室温静置5min ;用G-25凝胶柱除盐,收集活化后的抗体, 2-8 °C保存备用; 2) 、取1. 5mg的ALP,加入5mg/mL的SMCC溶液10-20 ii L,室温静置30min,用G-25凝胶 柱除盐,收集活化后的ALP,2-8°C保存备用; 3) 、将上述活化的MP0抗体与活化的ALP混合,2-8 °C条件下静置12-24h,用 Superdex200凝胶纯化柱纯化偶联物,获得MP0抗体-ALP连接物浓溶液,2-8°C保存备用; 4) 、将MP0抗体-ALP连接物浓溶液用酶标记物稀释液稀释到0. 02-0. 1 y g/mL,完成酶 标记试剂的制备。
4. 如权利要求1-3任其一所述的试剂盒,其特征在于,所述校准品的制备步骤如下: 一、配制校准品稀释液: 1 )、量取600mL纯化水于容器中,称取200mL新生牛血清加入容器中,充分搅拌混合均 匀; 2) 、称取磷酸氢二钾3. 4g、磷酸二氢钾0. 36g、Proclin300 0. 02 mL加入容器中,充分 搅拌至完全溶解; 3) 、调pH,控制pH在7. 0-7. 5之间; 4) 、最后用纯化水定容至1L,2-8°C保存待用; 二、配制校准品:用校准品稀释液将MPO抗体分别配制为0、5、20、50、150、300U/mL共6 个浓度点。
5. 如权利要求1-4任其一所述的试剂盒,其特征在于,所述清洗浓缩液的制备步骤如 下:以配制1L为例: 1) 、量取800mL纯化水于容器中,称取Tris 12. lg和NaCl 8. 5g于容器中,充分搅拌至 完全溶解; 2) 、称取Tween-20 5g以及Triton X-100 5g,充分搅拌,直至完全混匀; 3) 、调pH,控制pH在7.5-8. 0之间; 4) 、最后定容1000mL,2-8°C保存。
6. 如权利要求1-5任其一所述的试剂盒,其特征在于,所述底物溶液的制备步骤如下: 以配制1L为例: 1) 、称取 NaCl 8.87g、Tris 3.72g、Na2S03 0 . 00 3g 和 Proclin-300 0.4ml 于 1L烧杯中; 2) 、用量筒量取600ml纯化水于1L烧杯中,充分搅拌,直至完全溶解,调pH,控制其范围 在7. 5 - 8. 0之间; 3) 、加入250ml Lumi-Phos 530后,用纯化水定容至1000ml,混匀后即得。
7. 如权利要求1-6任其一所述的试剂盒,其特征在于,所述稳定剂的制备步骤如下: 以配制1L为例: 1) 、称取乙二胺四乙酸二钠2. 3g和氯化镁1. 4g于1L烧杯中; 2) 、用量筒量取900ml纯化水于1L烧杯中,充分搅拌,直至完全溶解,调pH,控制其范围 在7. 2 - 7. 8之间; 3) 、加入50ml甘油后,用纯化水定容至1000ml,混匀后即得。
【文档编号】G01N33/535GK104459107SQ201410136534
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年4月5日 优先权日:2014年4月5日
【发明者】于大为, 杨晓勇 申请人:北京中航赛维生物科技有限公司