一种基于倏逝波照明的轴向高精度定位方法及装置制造方法
【专利摘要】本发明公开了一种基于倏逝波照明的轴向高精度定位方法，包括以下步骤：1)准直后的照明光束经长焦距透镜聚焦，再通过物镜照射到样品表面发生全反射产生倏逝波，激发荧光；2)收集的荧光经聚焦透镜后分为两路光束，一路光束由聚前探测器接收，另一路光束由聚后探测器接收，得到样品表层的焦前图和焦后图；3)控制样品轴向移动，得到样品不同深度下的焦前图和焦后图；4)对步骤3)中的焦前图和焦后图进行差分处理，将深度与差分结果进行拟合，得到深度和差分结果的标定曲线；5)利用样品表层的焦前图和焦后图的差分结果和标定曲线，实现样品表层各区域的轴向定位。本发明还公开了一种基于倏逝波照明的轴向高精度定位装置。
【专利说明】—种基于倏逝波照明的轴向高精度定位方法及装置
【技术领域】
[0001]本发明属于全内反射荧光显微和共聚焦显微结合的领域，尤其涉及一种基于倏逝波照明的轴向高精度定位方法及装置。
【背景技术】
[0002]目前要实现样品的轴向的高精度定位，必须通过三维扫描的方法得到三维重构结果才可对样品内各部分进行轴向定位，该方法耗时且操作步骤较为复杂。本发明提出了一种无轴向扫描的高精度轴向定位方法及装置，采用全内反射显微镜的宽场照明以及共聚焦显微镜的点扫描接收方法，通过离焦差分探测的方法实现对倏逝波激发的样品表面薄层内进行轴向高精度定位。
[0003]其中全内反射荧光显微镜是通过光在样品表面发生全内反射时产生的倏逝波照明样本，仅激发样品表面薄层范围内的荧光基团，从而提高了显微成像在纵轴上的空间分辨率，而在薄层内部则无法对样品各部分实现轴向定位。
[0004]共聚焦显微镜可通过对样品的三维扫描实现对样品的三维重构，从而得到样品的轴向信息，对样品进行高精度的轴向定位。本方法采用全内反射荧光显微镜的照明方式和共聚焦显微镜的荧光接收方法，将宽场照明方式与点扫描接收方法相结合，通过离焦差分探测的方法，无需轴向扫描，仅通过横向扫描即可实现样品表面薄层内的轴向高精度定位。
【发明内容】
[0005]本发明提供了一种基于倏逝波照明的轴向高精度定位方法及装置，相对于其他轴向定位方法，该装置是基于全内反射荧光显微镜，照明方式简单，只激发样品的表面薄层，大大降低了背景噪声；在探测部分，基于点扫描接收的方式提出了一种离焦差分探测的方法，省去了三维扫描的方式，仅通过二维扫描即可实现在样品薄层内(亚微米级)的纳米级轴向高精度跟踪定位。
[0006]一种基于倏逝波照明的轴向高精度定位方法，包括以下步骤:
[0007]I)准直后的照明光束经长焦距透镜聚焦，再通过物镜照射到样品表面发生全反射产生倏逝波，激发样品表层发出荧光；
[0008]2)收集的荧光经聚焦透镜后分为两路光束，一路光束由位于聚焦点前的探测器接收，另一路光束由位于聚焦点后的探测器接收，得到样品表层的焦前图和焦后图；
[0009]3)控制样品轴向移动，重复步骤I)和步骤2)中的操作，得到样品不同深度下的焦前图和焦后图；
[0010]4)对步骤3)中的焦前图和焦后图进行差分处理，将深度与差分结果进行拟合，得到深度和差分结果的标定曲线；
[0011]5)对样品表层的焦前图和焦后图进行差分处理，根据所述的标定曲线，实现样品表层各区域的轴向定位。
[0012]在步骤2)中，采用扫描振镜对样品不同部分发出的光进行扫描接收。[0013]在步骤I)中，准直后的照明光束经长焦距透镜聚焦在显微物镜的后焦平面上，使得透过显微物镜的照明光束为平行出射光，且入射样品表面的角度大于临界角。
[0014]本发明还提供了一种基于倏逝波照明的轴向高精度定位装置，包括:
[0015]沿光路依次布置的激光器、准直透镜、长焦距透镜、显微物镜和纳米平移台，该纳米平移台上放置有样品；
[0016]沿接收荧光光路依次布置的第一扫描振镜、会聚透镜、分光器，以及分别位于会聚透镜的聚焦点前和聚焦点后的第一光电探测器和第二光电探测器；
[0017]和用于控制纳米平移台和数据处理的计算机。
[0018]其中，所述长焦距透镜和显微物镜之间依次设有第一反射镜、二色镜和第二反射镜，用于改变长焦距透镜出射光路的方向，使整个装置的结构更加紧凑。
[0019]同时，所述的准直透镜和长焦距透镜之间设有第二扫描振镜。
[0020]同时，还包括分别与第一光电探测器和第二光电探测器相适应的第一探测小孔、第二探测小孔。
[0021]在本发明中:激光器为光纤激光器，用于发出激光，实现对荧光样品的照明激发；准直透镜用于对光纤激光器发出的发散光进行准直；长焦距透镜，与准直透镜一起构成一个4f系统，用于将平行光束聚焦于物镜的后焦平面；显微物镜，使聚焦于物镜后焦平面的激发光束平行出射以一定角度入射于样品表面；纳米平移台，用于控制样品纳米级的轴向移动；扫描振镜，通过控制扫描振镜使得样品表层上的横向位置上的不同点发出的光被探测器接收，实现对样品表层的二维扫描；会聚透镜，用来会聚接收到的荧光；第一探测小孔、第二探测小孔，分别置于会聚透镜的焦前与焦后，滤除其他横向位置的点发出的光；第一光电探测器、第二光电探测器，分别接收第一探测小孔、第二探测小孔接收到的光强信息；计算机，用于控制纳米平移台的轴向移动，处理两个探测器的信号。
[0022]针对上述的轴向高精度定位装置，具体过程如下:
[0023](I)光纤激光器的发光点置于准直透镜的前焦平面上发出照明光束，经过准直透镜准直后，平行光束经长焦距透镜聚焦，途中经两个反射镜和一个二色镜反射，聚焦于长焦距透镜的等效后焦平面上。准直透镜后焦面与长焦距透镜的前焦面重合，此时准直透镜的前焦平面与长焦距透镜的等效后焦平面共轭。通过调节光纤头在第一物镜的前焦平面的位置即可调节光束在长焦距透镜的等效后焦平面上的聚焦位置。再将物镜的后焦平面调至与长焦距透镜的等效后焦平面重合，聚焦光束经过显微物镜后即可平行出射。改变光纤头在准直透镜前焦面的位置，等效于调节平行出射光照明样品的入射角。将样品置于物镜的前焦平面，将照明光的入射角调至大于临界角，使得平行照明光在样品表面发生全反射产生倏逝波，对荧光样品的表面薄层进行激发。
[0024](2)荧光样品被倏逝场激发发出荧光，在接收光路部分设置扫描振镜对样品不同部分的点光源发出的光进行扫描接收。置于物镜前焦平面的样品上的某一点发出的光经过物镜接收形成平行光再经反射镜反射和二色镜透射后进入扫描振镜。通过扫描振镜后被聚焦透镜收集，再经分光镜(PBS)分成两路光束，分别将两个小孔置于两路光束的聚焦点前与点后，用两个探测器分别探测两个小孔接收到的光强。将两个探测器探测到的光信号转换为电信号并传给计算机，通过控制扫描振镜对样品表面进行二维扫描，得到两张样品表层的离焦图像，分别是焦前二维扫描图和焦后二维扫描图。[0025](3)要通过焦前图和焦后图的差分结果得到样品内发光点的深度信息，首先需要对深度和差分结果进行标定。首先选定一个很小的发光区域，通过控制与样品相连的纳米平移台实现发光点轴向纳米量级的移动，通过两个探测器得到对应于样品处于不同轴向位置时即不同深度发光区域的焦前图和焦后图，再将深度与焦前图和焦后图的差分结果进行拟合，从而得到深度和差分结果的标定曲线。
[0026](4)标定完成后，将纳米平移台恢复原位，通过计算机对样品表层扫描得出的二维焦前图和焦后图进行差分处理，再根据标定曲线，得到样品表层各个区域的纳米级的轴向定位。
[0027]本发明原理如下:
[0028]本发明在照明装置部分，采用通用的全内反射显微镜的倏逝波照明方法，通过长焦距透镜将经过准直后的激光光束聚焦在显微物镜的后焦平面上，光束通过物镜后以一定角度平行光照射样品表面，通过调节光源位置来控制光束的入射角度以保证入射光在样品表面发生全反射。调节样品的被激发薄层处于物镜的焦平面附近。在接收装置部分，采用与共聚焦相同的点扫描的接收方式。通过振镜扫描的方式将样品表面的各点扫描成像。在探测部分，将接收到的光束通过分光镜分为两部分分别进入两个探测小孔，其中一个探测小孔放置在聚焦透镜的后焦点前，另一个探测小孔放置在聚焦透镜的后焦点后，通过焦前探测到的光强减去焦后的探测到的光强度判断样品被激发薄层内的发光点的轴向位置。通过这种方法可以在通用的全内反射的基础上，略去轴向扫描的步骤，仅通过二维扫描即可实现轴向高精度定位。
[0029]与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果:
[0030](I)实现了轴向无扫描的高精度轴向定位。
[0031](2)装置结构简单，数据处理方便。
【专利附图】
【附图说明】
[0032]图1为基于普通全内反射的倏逝波照明的轴向高精度定位装置示意图；
[0033]图2为基于动态环形全内反射倏逝波照明的轴向高精度定位装置示意图；
[0034]图3为样品被激发表层示意图，其中区域I代表置于聚焦透镜焦平面后面的小孔所能接收到的发光区域，区域2代表由倏逝波激发的样品表层，区域2代表置于聚焦透镜焦平面前面的小孔所能接收到的发光区域；
[0035]图4中I1U2分别为焦前、焦后小孔探测的光强与样品内发光点的轴向深度的关系曲线，I3为差分结果与发光点轴向深度的关系曲线；
[0036]图5(a)为实施案例二中显微物镜后焦面上聚焦点的扫描环示意图；图5(b)为实施案例二中显微物镜部分装置放大示意图。
【具体实施方式】
[0037]下面结合实施例和附图来详细说明本发明，但本发明并不限于此。
[0038]实施例1
[0039]如图1所示，一种基于普通全内反射显微照明方式的三维高精度跟踪定位装置，包括光纤激光器I，准直透镜2,长焦距透镜3,第一反射镜4, 二色镜5,第二反射镜6,显微物镜7，样品8，纳米平移台9，扫描振镜10，聚焦透镜11，分光器12，第一探测小孔13，第一光电探测器14，第二探测小孔15，第二光电探测器16，计算机17。
[0040]采用图1所示的装置实现针对荧光样品，本实施例基于倏逝波照明的轴向高精度定位方法，其过程如下:
[0041](I)光纤激光器I发出照明光，经过准直透镜2准直后，经长焦距透镜3会聚；
[0042](2)长焦距透镜的前焦面与准直透镜2的后焦面重合，光束经长焦距透镜3会聚后，分别经第一反射镜4、二色镜5和第二反射镜6反射后聚焦于平面C的一点，平面C为长焦距透镜3的等效后焦平面。由物像关系可得，准直透镜2的前焦平面A与长焦距透镜3的后焦平面B (等效后焦平面C)共轭。通过调节光纤激光器光纤头在准直透镜前焦面(平面A)的位置可以改变光束聚焦点在长焦距透镜等效后焦平面(平面C)的位置。
[0043](3)调节显微物镜7的后焦平面与长焦距透镜3的等效后焦平面(平面C)重合，聚焦于平面C的光束经显微物镜后以与光轴具有一定夹角的平行光束出射照射样品8。通过调节光纤头在平面A的位置来控制照明光入射于样品表面的角度，使其超过临界角在样品表面发生全反射产生倏逝波激发荧光样品。
[0044](4)位于物镜前焦平面的样品被激发出荧光，被显微物镜7收集，经第二反射镜6反射，再经二色镜透射进入扫描振镜后，经聚焦透镜11会聚后，被分光器12分光。两束光分别被置于焦前和 焦后的两个探测小孔接收，图中Um为聚焦透镜11的焦平面。
[0045](5)如图3所示，发光点位于不同的深度，焦前和焦后的探测小孔接收到的光强度不同。置于焦前的探测小孔接收的是如图3中区域I大小的爱里斑区域发出的光，置于焦后的探测小孔接收的是图3中如区域3大小的爱里斑区域发出的光，位于不同轴向深度的发光点发出的光分别被焦前和焦后探测小孔接收到的光强1:、I2与其轴向深度的关系曲线如图4所示，通过差分I2-11可以得到曲线13。可得在一定深度范围内差分结果I3与轴向深度成一一对应的关系，发光点位于不同的深度，其得到的差分结果是不同的。要想通过差分探测的结果得到其发光点的轴向位置，首先需要对差分结果I3和发光点深度进行标定。
[0046](6)首先选定一个很小的发光区域，通过纳米平移台控制其相对深度，并测出其相应的I3，得到I3和深度h的很多对离散点，再对离散点进行拟合，得到一条I3_h的拟合曲线。
[0047](7)标定完后，对样品表层进行二维扫描，测出各点的I3，即可获得样品表层各个发光点的深度。
[0048]实施例2.[0049]如图2所示，一种基于动态环形全内反射照明方式的三维超分辨显微装置，包括光纤激光器I，准直透镜2,扫描振镜18,长焦距透镜3,第一反射镜4, 二色镜5,第二反射镜6，显微物镜7，样品8，纳米平移台9，扫描振镜10，聚焦透镜11，分光器12，第一探测小孔13，第一光电探测器14，第二探测小孔15，第二光电探测器16，计算机17。
[0050]采用图2所示的装置实现针对荧光样品的一种基于动态环形全内反射倏逝波照明的轴向高精度定位方法，其过程如下:
[0051](I)光纤激光器I发出照明光，经过准直透镜2准直后，进入扫描振镜18，经扫描振镜18出射的平光经长焦距透镜3会聚在其后焦面上；
[0052](2)长焦距透镜3为一个长焦距透镜，光束经长焦距透镜3会聚后，分别经第一反射镜4、二色镜5和第二反射镜6反射后聚焦于平面A的一点，平面A为长焦距透镜4的等效后焦平面。
[0053](3)调节显微物镜7的后焦平面与长焦距透镜3的等效后焦平面(平面A)重合，聚焦于平面A的光束经显微物镜后以与光轴具有一定夹角的平行光束出射照射样品8。
[0054](4)通过控制扫描振镜18来控制光束在平面A中的聚焦位置，使光束聚焦点在平面A内形成一定半径的环形扫描如图5(a)所示，且要求该环形扫描的半径满足
[0055]r/f ≥ arctan Θ c = η样品/n 油
[0056]如图5(b)所示，其中r为平面A内环形扫描的半径，f为显微物镜的焦距，Θ。光束能够发生全反射的临界角，n#s为样品的折射率，ηΛ显微物镜浸油的折射率。
[0057]光束通过显微物镜后以一定角度照射样品表面。通过控制振镜来控制聚焦点在平面A内环形扫描的半径从而使光束经过显微物镜7后以超过临界角的入射角照射于样品表面发生全内反射。则样品表面被具有同一入射角、不同方位角的光束循环照明。
[0058](4)位于物镜前焦平面的样品被激发出荧光，被显微物镜7收集，经第二反射镜6反射，再经二色镜5透射进入扫描振镜10后，经聚焦透镜11会聚后，被分光器分光。两束光分别被置于焦前和焦后的两个探测小孔接收。
[0059](5)通过扫描振镜10的二维扫描得到焦前图和焦后图，再通过如实施例一相同的方法对有样品中每个发光部分的进行轴向高精度定位。
【权利要求】
1.一种基于倏逝波照明的轴向高精度定位方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)准直后的照明光束经长焦距透镜聚焦，再通过物镜照射到样品表面发生全反射产生倏逝波，激发样品表层发出荧光； 2)收集的荧光经聚焦透镜后分为两路光束，一路光束由位于聚焦点前的探测器接收，另一路光束由位于聚焦点后的探测器接收，得到样品表层的焦前图和焦后图； 3)控制样品轴向移动，重复步骤I)和步骤2)中的操作，得到样品不同深度下的焦前图和焦后图； 4)对步骤3)中的焦前图和焦后图进行差分处理，将深度与差分结果进行拟合，得到深度和差分结果的标定曲线； 5)对样品表层的焦前图和焦后图进行差分处理，根据所述的标定曲线，实现样品表层各区域的轴向定位。
2.如权利要求1所述的基于倏逝波照明的轴向高精度定位方法，其特征在于，在步骤2)中，采用扫描振镜对样品不同部分发出的光进行扫描接收。
3.如权利要求1所述的基于倏逝波照明的轴向高精度定位方法，其特征在于，在步骤I)中，准直后的照明光束经长焦距透镜聚焦在显微物镜的后焦平面上，使得透过显微物镜的照明光束为平行出射光。
4.如权利要求3所述的基于倏逝波照明的轴向高精度定位方法，其特征在于，照明光束入射样品表面的角度大于临界角。
5.一种基于倏逝波照明的轴向高精度定位装置，其特征在于，包括: 沿光路依次布置的激光器、准直透镜、长焦距透镜、显微物镜和纳米平移台，该纳米平移台上放置有样品； 沿接收荧光光路依次布置的第一扫描振镜、会聚透镜、分光器，以及分别位于会聚透镜的聚焦点前和聚焦点后的第一光电探测器和第二光电探测器； 和用于控制纳米平移台和数据处理的计算机。
6.如权利要求5所述的基于倏逝波照明的轴向高精度定位装置，其特征在于，所述长焦距透镜和显微物镜之间依次设有第一反射镜、二色镜和第二反射镜。
7.如权利要求5所述的基于倏逝波照明的轴向高精度定位装置，其特征在于，所述的准直透镜和长焦距透镜之间设有第二扫描振镜。
8.如权利要求5所述的基于倏逝波照明的轴向高精度定位装置，其特征在于，还包括分别与第一光电探测器和第二光电探测器相适应的第一探测小孔、第二探测小孔。
【文档编号】G01N21/01GK103954598SQ201410185352
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2014年4月30日 优先权日:2014年4月30日
【发明者】匡翠方, 方月, 刘旭 申请人:浙江大学