一种检测青蒿素的分子印迹传感器的制备方法及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种检测青蒿素的分子印迹传感器的制备方法，其特征是：首先将玻碳电极用纳米多孔碳修饰，溶胶-凝胶印迹技术、纳米铂粒子、层层自组装法和电聚合法相结合，在纳米多孔碳修饰玻碳电极表面成功地研制了一种具有特异选择性的印迹电化学传感器，本发明制备的青蒿素分子印迹传感器的响应大大提高。该印迹传感器对青蒿素表现出较高的亲和性和选择性。该青蒿素分子印迹传感器与电化学工作站连接构成能够专一模板分子识别传感器。本发明制得的传感器成本低、灵敏度高、特异性好、检测快速，可反复使用。
【专利说明】—种检测青蒿素的分子印迹传感器的制备方法及应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及的是一种分子印迹传感器的制备方法及快速检测应用【技术领域】，特别涉及一种青蒿素分子印迹传感器的制备方法，具体是基于分子印迹特异性识别作用，用于检测药品中的青蒿素技术。
【背景技术】
[0002]青蒿素是从黄花蒿中分离出来的含过氧桥的新型倍半萜内酯，具有抗疟、抗菌、解热、增强免疫等药理活性，且毒性低，无副作用，是世界卫生组织推荐的治疗疟疾的首选药物。青蒿素有效成分的检测和提纯对于药品的质量十分重要，在有效成分含量很低的天然药物中提取分离方面，具有独特优势超临界CO2萃取，具有价格低、无毒、可循环使用、时间短；常温提取，青蒿素不发生热分解等化学变化。但超临界萃取的青蒿素粗品含量较低，需提纯才能达到药用要求。胡淼等(华西药学杂志，2005，20(4)，283?285)以超临界萃取的青蒿素粗提取物为原料，经硅胶柱层析提纯，青蒿素含量从15%提高到70%。由于天然药品的基质比较复杂，给检测带来了困难，因此，找到一种选择性好、灵敏度高、操作简便使用的检测青蒿素的方法十分重要。
[0003]分子印迹技术是当前开发具有分子识别功能的高选择性材料的主要方法之一，它是通过在模板分子周围形成一个高度交联的刚性高分子，除去模板分子后在分子印迹聚合物的网络结构中留下具有结合能力的识别位点，对模板分子表现出高选择识别性能的一种技术。这项技术以其构效预定性和特异识别性越来越受到人们的关注，已经成功用于固相萃取或微固相萃取，亲和色谱或毛细管电泳及传感器等领域。
[0004]传统检测青蒿素的方法主要有高效液相色谱、液相色谱-质谱法、紫外分光光度法及化学发光法等，色谱法的准确度受到一定限制、而且仪器比较贵需要专业人员操作，也限制了其应用。
[0005]依据此技术制备的分子印迹传感器，应用于药物分析、环境保护及生命科学研究中起着十分重要的作用。将功能分子以适当方式修饰到电极上，制备选择性好、灵敏度高、有一定使用寿命可再生的电化学传感器成为分析科学工作者努力探索的课题。但是传统的印迹方法所制备的印迹膜厚度难以控制，高交联度使得电子传递速度和响应慢、检测下限高而且再生和可逆性差，影响分子印迹技术在电化学传感器中的应用。因此，建立一种灵敏、快速、简便、特异性高、重复性好经济使用的检测方法，对研究人员、生产企业、质控人员、进出口商检、政府管理部门等的迫切需要的，对食品、药品、环境安全中的青蒿素含量准确定量测定十分必要，对于青蒿素生产和药理研究也具有重要的意义。
[0006]
【发明内容】
[0007]本发明的目的是将分子印迹与电化学传感器相结合，提供了一种青蒿素分子印迹传感器的制备方法，主要是以青蒿素为模板，在玻碳电极表面通过Y -巯丙基三乙氧基硅烷、3-氨丙基三乙氧基硅烷、纳米多孔碳球及钼纳米粒子之间的电化学作用而制备的分子印迹传感器。
[0008]仪器与试剂
CHI660B电化学工作站(上海辰华仪器公司)，实验采用三电极体系:钼丝电极为辅助电极，Ag/AgCl为参比电极(SCE )，玻碳电极(GCE )为工作电极；KQ_250E型超声波清洗器(坤峰超声仪器有限公司)。
[0009]纳米多孔碳(孔径2 50nm) ; Y _疏丙基二乙氧基硅烷、3-氣丙基二乙氧基硅烷；2-乙氧基乙醚，N，N-二甲基甲酰胺(DMF);氯钼酸；青蒿素；磷酸缓冲溶液。
[0010]本发明的目的通过如下技术方案实现。
[0011]一种检测青蒿素的分子印迹传感器的制备方法，特征在于该方法具有以下工艺步骤:
(1)纳米多孔碳修饰玻碳电极制备:将玻碳电极依次用0.3 μ m、0.05 μ mAl203粉末进行表面抛光，然后用高纯水超声清洗，用氮气吹干，在玻碳电极表面滴加5~10yL纳米多孔碳的N，N-二甲基甲酰胺分散液(0.5g/L)，置于红外灯下，挥发干溶剂后，即得纳米多孔碳修饰玻碳电极；
(2)氧化纳米多孔碳的制备:在反应器中，按如下组成质量百分浓度加入35飞5%浓硝酸，0.5~3%纳米多孔碳，0.5~2%硝酸钠，1.0-5%高锰酸钾，超声分散2(T30min，再加入32飞0%去离子水，各组分含量之和为百分之百，然后在7(T80°C搅拌反应16~20 h，冷却至室温，过滤，用去离子水反复洗涤至滤液为中性，真空干燥，得到氧化纳米多孔碳；
(3)印迹溶胶的制备:在反应器中，按如下组成质量百分浓度加入，Y-巯丙基三乙氧基硅烷:6~20%，3-氨丙基三乙氧基硅烷:0.6~4.0%, 2-乙氧基乙醚:55~78%，0.1 mol/LHCl:8~19%，去离子水:0.5~3.0%，氯钼酸:0.05~1.0%，搅拌I~2 h，再加入青蒿素:0.05~1.0%，各组分含量之和为百分之百，继续搅拌2(T30min，即得印迹溶胶；
(4)青蒿素分子印迹传感器的制备方法:取步骤(3)的印迹溶胶于小烧杯中，将步骤
(I)制备的纳米多孔碳修饰玻碳电极放入其中，在-0.4(T0.2V电位范围内，扫描速率为50mV/s，采用循环伏安法扫描20-30圈至扫描曲线稳定，再将该电极用去离子水反复浸泡，洗脱模板分子，即得检测青蒿素的分子印迹传感器。
[0012]本发明的优点及效果是:
本发明将溶胶-凝胶印迹技术、纳米钼粒子、层层自组装法和电聚合法相结合，在纳米多孔碳修饰玻碳电极表面成功地研制了一种具有特异选择性的印迹电化学传感器。通过与无纳米多孔碳修饰的分子印迹电极那个的响应进行比较，本发明制备的青蒿素分子印迹传感器的响应大大提高。该印迹传感器对青蒿素表现出较高的亲和性和选择性，响应电流与青蒿素的浓度在2.0X10_71.0X10_5mOl/L范围内呈良好的线性关系，检测限为1.29X10_8mol/L将本发明制备的青蒿素分子印迹传感器成功用于药品、食品中青蒿素的检测中，回收率在95.33^105.2%之间，因此本发明制备的分子印迹传感器可广泛应用于化工、生物医药、食品、环保检测等相关领域。
【具体实施方式】
[0013]实施例1 (1)纳米多孔碳修饰玻碳电极制备:将玻碳电极依次用0.3 μ m、0.05 μ mAl203粉末进行表面抛光，然后用高纯水超声清洗，，用氮气吹干，在玻碳电极表面滴加8μ L纳米多孔碳的N, N-二甲基甲酰胺分散液(0.5g/L)，置于红外灯下，挥发干溶剂后，即得纳米多孔碳修饰玻碳电极；
(2)氧化纳米多孔碳的制备:在反应器中，分别加入35mL浓硝酸，1.0g纳米多孔碳，1.0g硝酸钠，3.0g高锰酸钾，超声分散25min，再加入50mL去离子水，然后在75°C搅拌反应18 h，冷却至室温，过滤，用去离子水反复洗涤至滤液为中性，真空干燥，得到氧化纳米多孔碳;
(3)印迹溶胶的制备:在烧杯中，分别加入IOmLY-巯丙基三乙氧基硅烧，1.0mL3-氨丙基三乙氧基娃烧，60mL 2-乙氧基乙醚，IOmL0.1 mol/LHCl, 2.0mL去离子水,0.5g氯钼酸，搅拌1.5 h,再加入0.5g青蒿素,继续搅拌25min,即得印迹溶胶；
(4)检测青蒿素的分子印迹传感器的制备方法:取印迹溶胶于小烧杯中，将纳米多孔碳修饰玻碳电极放入其中，在-0.4(T0.2V电位范围内，扫描速率为50mV/s，采用循环伏安法扫描25圈至扫描曲线稳定，再将该电极用去离子水反复浸泡，洗脱模板分子，即得检测青蒿素的分子印迹传感器。
[0014]实施例2
(1)纳米多孔碳修饰玻碳电极制备:将玻碳电极依次用0.3 μ m、0.05 μ mAl203粉末进行表面抛光，然后用高纯水超声清洗，，用氮气吹干，在玻碳电极表面滴加5μ L纳米多孔碳的N, N-二甲基甲酰胺分散液(0.5g/L)，置于红外灯下，挥发干溶剂后，即得纳米多孔碳修饰玻碳电极；
(2)氧化纳米多孔碳的制备:在反应器中，分别加入ISmL浓硝酸，1.0g纳米多孔碳，
0.5g硝酸钠，2.0g高锰酸钾，超声分散20min，再加入25mL去离子水，然后在70°C搅拌反应20 h，冷却至室温，过滤，用去离子水反复洗涤至滤液为中性，真空干燥，得到氧化纳米多孔碳;
(3)印迹溶胶的制备:在烧杯中，分别加入2.0mL Y-巯丙基三乙氧基硅烷，0.2mL3-氨丙基三乙氧基娃烧，15mL 2-乙氧基乙醚,3.0mL0.1 mol/LHCl, 1.0mL去离子水,0.1g氯钼酸，搅拌I h，再加入0.1g青蒿素，继续搅拌20min，即得印迹溶胶；
(4)检测青蒿素的分子印迹传感器的制备方法:取印迹溶胶于小烧杯中，将纳米多孔碳修饰玻碳电极放入其中，在-0.4(T0.2V电位范围内，扫描速率为50mV/s，采用循环伏安法扫描20圈至扫描曲线稳定，再将该电极用去离子水反复浸泡，洗脱模板分子，即得检测青蒿素的分子印迹传感器。
[0015]实施例3
(1)纳米多孔碳修饰玻碳电极制备:将玻碳电极依次用0.3 μ m、0.05 μ mAl203粉末进行表面抛光，然后用高纯水超声清洗，，用氮气吹干，在玻碳电极表面滴加10 μ L纳米多孔碳的N，N-二甲基甲酰胺分散液(0.5g/L)，置于红外灯下，挥发干溶剂后，即得纳米多孔碳修饰玻碳电极；
(2)氧化纳米多孔碳的制备:在反应器中，分别加入22mL浓硝酸，0.5g纳米多孔碳，
1.0g硝酸钠，1.0g高锰酸钾，超声分散20min，再加入18mL去离子水，然后在80°C搅拌反应16 h，冷却至室温，过滤，用去离子水反复洗涤至滤液为中性，真空干燥，得到氧化纳米多孔碳;
(3) 印迹溶胶的制备:在烧杯中，分别加入4.0mL Y-巯丙基三乙氧基硅烷，0.5mL3-氨丙基三乙氧基硅烷，15mL 2-乙氧基乙醚,2.0mL0.1 mol/LHCl, 0.5mL去离子水,0.05g氯钼酸，搅拌2 h，再加入0.05g青蒿素，继续搅拌30min，即得印迹溶胶；
(4)检测青蒿素的分子印迹传感器的制备方法:取印迹溶胶于小烧杯中，将纳米多孔碳修饰玻碳电极放入其中，在-0.4(T0.2V电位范围内，扫描速率为50mV/s，采用循环伏安法扫描30圈至扫描曲线稳定，再将该电极用去离子水反复浸泡，洗脱模板分子，即得检测青蒿素的分子印迹传感器。
[0016]实施例4
(1)纳米多孔碳修饰玻碳电极制备:将玻碳电极依次用0.3 μ m、0.05 μ mAl203粉末进行表面抛光，然后用高纯水超声清洗，，用氮气吹干，在玻碳电极表面滴加6μ L纳米多孔碳的N, N-二甲基甲酰胺分散液(0.5g/L)，置于红外灯下，挥发干溶剂后，即得纳米多孔碳修饰玻碳电极；
(2)氧化纳米多孔碳的制备:在反应器中，分别加入IOmL浓硝酸，1.0g纳米多孔碳，
0.8g硝酸钠，2.2g高锰酸钾，超声分散20min，再加入22mL去离子水，然后在75°C搅拌反应16 h，冷却至室温，过滤，用去离子水反复洗涤至滤液为中性，真空干燥，得到氧化纳米多孔碳;
(3)印迹溶胶的制备:在烧杯中，分别加入20mLY -巯丙基三乙氧基硅烷，2.0mL3-氨丙基三乙氧基硅烷，IOOmL 2-乙氧基乙醚，17mL0.1 mol/LHCl, 1.0mL去离子水,0.1g氯钼酸，搅拌2 h，再加入0.1g青蒿素，继续搅拌25min，即得印迹溶胶；
(4)检测青蒿素的分子印迹传感器的制备方法:取印迹溶胶于小烧杯中，将纳米多孔碳修饰玻碳电极放入其中，在-0.4(T0.2V电位范围内，扫描速率为50mV/s，采用循环伏安法扫描25圈至扫描曲线稳定，再将该电极用去离子水反复浸泡，洗脱模板分子，即得检测青蒿素的分子印迹传感器。
[0017]实施例5
将上述实施例f 4所制备的青蒿素分子印迹传感器，用于青蒿素的检测，步骤如下:
(1)标准溶液配制:配制一组包括空白标样在内的不同浓度的青蒿素标准溶液，底液为PH 6.5的磷酸盐缓冲溶液；
(2)工作曲线绘制:将Ag/AgCl为参比电极，钼丝电极为辅助电极，本发明制备的电极为工作电极组成三电极系统，连接CHI660B电化学工作站，在K3 [Fe (CN)6]溶液中，采用循环伏安法在-0.40-0.2V电位范围内进行检测，空白标样的响应电流记为10，含有不同浓度的青蒿素标准溶液的响应电流即为Zi，响应电流降低的差值为Zl I=10-1i,/! /与青蒿素标准溶液的质量浓度c之间呈线性关系，绘制Zl I~c工作曲线；
(3)青蒿素的检测:用待测样品代替步骤(1)中的青蒿素标准溶液，按照步骤(2)的方法进行检测，根据响应电流降低的差值Zl J和工作曲线，得到待测样品中青蒿素的含量；
所述K3[Fe (CN)6]溶液的浓度为4mmol/L ；
所述pH 6.5的磷酸盐缓冲溶液的浓度在60~70 mmol/L。
[0018]青蒿素的浓度在2.0 X 10^8.0 X l(T5mol/L范围内呈良好的线性关系，检测限为1.29X10_8mol/L将本发明制备的青蒿素分子印迹传感器成功用于药品、食品中青蒿素的检 测中，回收率在95.33?105.2%之间。
【权利要求】
1.一种检测青蒿素的分子印迹传感器的制备方法，其特征是:在于该方法具有以下工艺步骤: (1)纳米多孔碳修饰玻碳电极制备:将玻碳电极依次用0.3 μ m、0.05 μ mAl203粉末进行表面抛光，然后用高纯水超声清洗，用氮气吹干，在玻碳电极表面滴加5~10μ L纳米多孔碳的N，N-二甲基甲酰胺分散液(0.5g/L)，置于红外灯下，挥发干溶剂后，即得纳米多孔碳修饰玻碳电极； (2)氧化纳米多孔碳的制备:在反应器中，按如下组成质量百分浓度加入35飞5%浓硝酸，0.5~3%纳米多孔碳，0.5~2%硝酸钠，1.0-5%高锰酸钾，超声分散2(T30min，再加入32飞0%去离子水，各组分含量之和为百分之百，然后在7(T80°C搅拌反应16~20 h，冷却至室温，过滤，用去离子水反复洗涤至滤液为中性 ，真空干燥，得到氧化纳米多孔碳； (3)印迹溶胶的制备:在反应器中，按如下组成质量百分浓度加入，Y-巯丙基三乙氧基硅烷:6~20%，3-氨丙基三乙氧基硅烷:0.6~4.0%, 2-乙氧基乙醚:55~78%，0.1 mol/LHCl:8~19%，去离子水:0.5~3.0%，氯钼酸:0.05~1.0%，搅拌I~2 h，再加入青蒿素:0.05~1.0%，各组分含量之和为百分之百，继续搅拌2(T30min，即得印迹溶胶； (4)检测青蒿素的分子印迹传感器的制备方法:取印迹溶胶于小烧杯中，将纳米多孔碳修饰玻碳电极放入其中，在-0.4(T0.2V电位范围内，扫描速率为50mV/s，采用循环伏安法扫描20-30圈至扫描曲线稳定，再将该电极用去离子水反复浸泡，洗脱模板分子，即得检测青蒿素的分子印迹传感器。
2.根据权利要求1所述的一种检测青蒿素的分子印迹传感器的制备方法，其特征是:步骤(3)中所述的3-氨丙基三乙氧基硅烷与Y-巯丙基三乙氧基硅烷的摩尔比为1:9~11。
3.根据权利要求1中所述的一种检测青蒿素的分子印迹传感器的制备方法，其特征是:步骤(3)中所述的青蒿素与氯钼酸的摩尔比为1:广2。
4.根据权利要求1中所述的一种检测青蒿素的分子印迹传感器的制备方法，其特征是:所制备的检测青蒿素的分子印迹传感器应用于青蒿素的检测，其检测步骤如下: (1)标准溶液配制:配制一组包括空白标样在内的不同浓度的青蒿素标准溶液，底液为PH 6.5的磷酸盐缓冲溶液； (2)工作曲线绘制:将Ag/AgCl为参比电极，钼丝电极为辅助电极，本发明制备的电极为工作电极组成三电极系统，连接CHI660B电化学工作站，在K3[Fe (CN)6]溶液中，采用循环伏安法在-0.40-0.2V电位范围内进行检测，空白标样的响应电流记为10，含有不同浓度的青蒿素标准溶液的响应电流即为Zi，响应电流降低的差值为Zl I=10-1i,/! /与青蒿素标准溶液的质量浓度c之间呈线性关系，绘制Zl I~c工作曲线； (3)青蒿素的检测:用待测样品代替步骤(1)中的青蒿素标准溶液，按照步骤(2)的方法进行检测，根据响应电流降低的差值Zl J和工作曲线，得到待测样品中青蒿素的含量。
【文档编号】G01N27/30GK103940891SQ201410186340
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2014年5月6日 优先权日:2014年5月6日
【发明者】李慧芝, 李志英, 李燕 申请人:济南大学