生血宝制剂特征图谱及其建立方法
【专利摘要】本发明属于药物质量控制【技术领域】，所公开的生血宝制剂特征图谱的建立方法，包括：取芍药苷对照品溶解于50％-100％(体积)甲醇中以形成芍药苷对照品浓度为0.02mg/ml溶液，摇匀后得到参照物溶液；取设定量的生血宝制剂溶解于0％-100％甲醇、0％-50％乙醇或25-125ml水，称重后通过回流提取或超声处理10-60min，冷却后，再称重量，然后用同种溶剂补重，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液；吸取参照物溶液和供试品溶液注入高效液相色谱仪，按照高效液相色谱法检测，得到生血宝制剂的特征图谱。本发明还公开一种生血宝制剂特征图谱。上述特征图谱实现了对生血宝制剂质量的较全面检测。
【专利说明】生血宝制剂特征图谱及其建立方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及药物质量控制【技术领域】，更为具体地说，涉及生血宝制剂特征图谱的建立方法。本发明还涉及由上述建立方法得到的生血宝制剂特征图谱。
【背景技术】
[0002]生血宝是由我国著名中医药学专家的经验方，经现代工艺制备而成。生血宝主要由制何首乌、女贞子、桑葚、墨旱莲、白芍、黄芪和狗脊这七味药材制成。几十年的临床应用证明生血宝具有养肝肾，益气血之功效，用于恶性肿瘤放化疗所致白细胞减少、神疲乏力、腰膝酸软、头晕耳鸣、心悸、失眠、咽干、食欲不振、食少等症状。
[0003]目前，根据生血宝中药方已制得多种剂型的生血宝制剂。市场上的生血宝制剂主要由颗粒剂、合剂等。通常，生血宝制剂的制备工艺为:将原料药材碎断后加水提取的水提物，按照现有常规的方法制成颗粒剂、片剂、丸剂、胶囊剂、口服液或合剂。生血宝制剂作为中成药，其药效是多种活性成分共同作用的结果。因此，生血宝制剂的多种活性成分含量是否达标是衡量生血宝制剂质量的重要因素。但是，目前的生血宝制剂的质量标准检测方法仅测定单一指标成份的含量，未对其它有效成份进行检测。这种检测方法存在一定的局限性，无法较全面反映生血宝制剂的质量水平。
【发明内容】
[0004]本发明提供一种生血宝制剂特征图谱的建立方法，以解决目前的生血宝制剂检测方法无法较全面反映生血宝制剂质量水平的问题。
[0005]为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案:
[0006]生血宝制剂特征图谱的建立方法，包括以下步骤:
[0007]取芍药苷对照品溶解于50% -100% (体积)甲醇中以形成芍药苷对照品浓度为0.02mg/ml溶液，摇匀后得到参照物溶液；
[0008]取设定量的生血宝制剂溶解于O % -100%甲醇、O % -50%乙醇或25_125ml水，称重后通过回流提取或超声处理10-60min，冷却后，再称重量，然后用同种溶剂补重，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液，所述生血宝制剂为口服液或合剂，所述设定量为
1.0-5.0ml，或者所述生血宝制剂为颗粒剂、片剂、胶囊剂、丸剂或生血宝制剂中间体，所述设定量为0.6-3.0g的粉末；
[0009]吸取所述参照物溶液和供试品溶液注入高效液相色谱仪，按照高效液相色谱法检测，得到生血宝制剂的特征图谱；其中，色谱柱为C18反相色谱柱；采用梯度洗脱，且梯度洗脱液的流动相的流速为0.8ml/min-l.2ml/min ;检测波长为200_230nm，柱温为25°C -40°C；梯度洗脱时间为60min-120min。
[0010]优选的，上述建立方法中，梯度洗脱液的流动相为乙腈-水、乙腈-(ο.1%-0.2%)磷酸溶液、乙腈-0.1 %甲酸溶液、甲醇-0.1 %磷酸溶液、甲醇-0.1 %甲酸溶液或甲醇-水。
[0011]优选的，上述建立方法中，所述梯度洗脱液的流动相为流动相A和流动相B组成，流动相A为乙腈，流动相B为0.1 % (体积)磷酸溶液。
[0012]优选的，上述建立方法中，吸取所述参照物溶液和供试品溶液均为5μ I注入高效液相色谱仪，所述梯度洗脱的时间为60min，采用如下方式进行梯度洗脱:
[0013]0-15min,流动相A的体积百分比为2 %，流动相B的体积百分比为98 % ;
[0014]15-30min,流动相A的体积百分比为2 % -15 %，流动相B的体积百分比为98% -85% ；
[0015]30-50min,流动相A的体积百分比为15 % -25 %，流动相B的体积百分比为85% -75% ；
[0016]50-60min,流动相A的体积百分比为25 %，流动相B的体积百分比为75 %。
[0017]优选的,上述建立方法中，所述流动相的流速为1.0ml/min,所述C18反相色谱柱的柱长为250nm。
[0018]生血宝制剂特征图谱，采用如上所述的建立方法获得，所述特征图谱通过取生血宝颗粒剂粉末0.6g溶解于25ml的甲醇溶液得到的供试品溶液检测得到，所述特征图谱具有7个特征峰，其中，5号峰以芍药苷为参照的参照峰，各个特征峰相对保留时间和相对标准偏差为:
[0019]I号峰:相对保留时间0.383±0.019，相对标准偏差为0.19% ；
[0020]2号峰:相对保留时间0.672±0.034，相对标准偏差为0.07% ；
[0021]3号峰:相对保留时间0.801 ±0.040，相对标准偏差为0.05% ；
[0022]4号峰:相对保留时间0.956±0.048，相对标准偏差为0.01% ;
[0023]5号峰:相对保留时间1.000±0.000，相对标准偏差为0.00% ；
[0024]6号峰:相对保留时间1.143±0.057，相对标准偏差为0.01% ;
[0025]7号峰:相对保留时间1.188±0.059，相对标准偏差为0.03%。
[0026]生血宝制剂特征图谱，采用如上所述的建立方法获得，所述特征图谱通过取3.0g生血宝制剂中间体溶解于 125ml的水得到的供试品溶液检测得到，所述特征图谱具有7个特征峰，其中，5号峰以芍药苷为参照的参照峰，各个特征峰相对保留时间和相对标准偏差为:
[0027]I号峰:相对保留时间0.383±0.019，相对标准偏差为0.14% ；
[0028]2号峰:相对保留时间(λ 672±0.034，相对标准偏差为0.00% ；
[0029]3号峰:相对保留时间0.801 ±0.040，相对标准偏差为0.05% ；
[0030]4号峰:相对保留时间0.956±0.048，相对标准偏差为0.00% ；
[0031]5号峰:相对保留时间1.000±0.000，相对标准偏差为0.00% ；
[0032]6号峰:相对保留时间1.143±0.057，相对标准偏差为0.00% ；
[0033]7号峰:相对保留时间1.188±0.059，相对标准偏差为0.00%。
[0034]生血宝制剂特征图谱，采用如上所述的建立方法获得，所述特征图谱通过取1.2g生血宝胶囊粉末溶解于50ml的50%甲醇得到的供试品溶液检测得到，所述特征图谱具有7个特征峰，其中，5号峰以芍药苷为参照的参照峰，各个特征峰相对保留时间和相对标准偏差为:
[0035]I号峰:相对保留时间0.383±0.019，相对标准偏差为1.19% ；
[0036]2号峰:相对保留时间0.672±0.034，相对标准偏差为0.43% ；[0037]3号峰:相对保留时间0.801 ±0.040，相对标准偏差为0.19% ；
[0038]4号峰:相对保留时间0.956±0.048，相对标准偏差为0.05% ；
[0039]5号峰:相对保留时间1.000±0.000，相对标准偏差为0.00% ；
[0040]6号峰:相对保留时间1.143±0.057，相对标准偏差为0.28% ；
[0041]7号峰:相对保留时间1.188±0.059，相对标准偏差为0.12%。
[0042]生血宝制剂特征图谱，采用如上所述的建立方法获得，所述特征图谱通过取2.4g生血宝片剂溶解于IOOml的25%乙醇得到的供试品溶液检测得到，所述特征图谱具有7个特征峰，其中，5号峰以芍药苷为参照的参照峰，各个特征峰相对保留时间和相对标准偏差为:
[0043]I号峰:相对保留时间0.383±0.019，相对标准偏差为0.19% ；
[0044]2号峰:相对保留时间0.672±0.034，相对标准偏差为0.07% ；
[0045]3号峰:相对保留时间0.801 ±0.040，相对标准偏差为0.05% ；
[0046]4号峰:相对保留时间0.956±0.048，相对标准偏差为0.01% ;
[0047]5号峰:相对保留时间1.000±0.000，相对标准偏差为0.00% ；
[0048]6号峰:相对保留时间1.143±0.057，相对标准偏差为0.01% ;
[0049]7号峰:相对保留时间1.188±0.059，相对标准偏差为0.03%。
[0050]生血宝制剂特征图谱，采用如上所述的建立方法获得，所述特征图谱通过取Iml生血宝口服液溶解于25ml的50%乙醇得到的供试品溶液检测得到，所述特征图谱具有7个特征峰，其中，5号峰以芍药苷为参照的参照峰，各个特征峰相对保留时间和相对标准偏差为:
[0051]I号峰:相对保留时间0.383±0.019，相对标准偏差为0.21% ；
[0052]2号峰:相对保留时间0.672±0.034，相对标准偏差为0.08% ；
[0053]3号峰:相对保留时间0.801 ±0.040，相对标准偏差为0.07% ；
[0054]4号峰:相对保留时间0.956±0.048，相对标准偏差为0.05% ；
[0055]5号峰:相对保留时间1.000±0.000，相对标准偏差为0.00% ；
[0056]6号峰:相对保留时间1.143±0.057，相对标准偏差为0.00% ；
[0057]7号峰:相对保留时间1.188±0.059，相对标准偏差为0.04%
[0058]本发明的有益效果如下:
[0059]A、本发明提供的生血宝制剂的特征图谱建立方法对供试品的前处理方法简单，特征性成分保留完整，且供试品溶液稳定性良好。
[0060]B、高效液相色谱方法的精密度较高、重现性良好，分析时间较短，具有一定的专属性；所得特征图谱中各特征峰分离效果较好，且生血宝制剂特征图谱和中间体特征图谱具有较好的相关性。
[0061]C、本发明所建立的特征图谱有7个特征峰，信息量较大，较完整的保留了供试液中的有效成分，明确了 3个指标成份，经比较，采用保留时间适中，分离度较好，峰面积较大的苟药苷参照物作为参照峰。
[0062]D、生血宝制剂中间体特征图谱的应用可增加生血宝制剂生产过程的可控性，生血宝制剂特征图谱的应用能较全面的反映工艺是否稳定均一，有利于保证生血宝制剂的有效成分质量稳定和临床疗效，本发明提供的方法有利地保障了从原料到终端制剂的全过程质量控制。
【专利附图】
【附图说明】
[0063]为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
[0064]图1参照物叠加色谱图；
[0065]图2为生血宝颗粒剂特征图谱；
[0066]图3为10批生血宝颗粒剂特征图谱；
[0067]图4为生血宝 制剂中间体特征图谱；
[0068]图5为10批生血宝制剂中间体特征图谱；
[0069]图6为生血宝胶囊特征图谱；
[0070]图7为10批生血宝胶囊特征图谱；
[0071]图8为生血宝颗粒特征图谱；
[0072]图9为10批生血宝颗粒特征图谱；
[0073]图10为生血宝口服液特征图谱；
[0074]图11为10批生血宝口服液特征图谱；
[0075]图12为生血宝制剂特征峰与各药材特征峰的归属图谱。
【具体实施方式】
[0076]本发明实施例提供了一种生血宝制剂特征图谱的建立方法，以解决目前的生血宝制剂检测无法较全面反映生血宝制剂质量水平的问题。
[0077]为了使本【技术领域】的人员更好地理解本发明实施例中的技术方案，并使本发明实施例的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明实施例中的技术方案作进一步详细的说明。
[0078]本发明实施例中，药材、药品来源及对照品来源如下:
[0079]制何首乌药材(厂家:安徽芍花堂药业有限公司、批号:JY100202);女贞子药材(厂家:安徽芍花堂药业有限公司、批号:ZY1402002);桑椹药材(厂家:安徽芍花堂药业有限公司、批号:ΖΥ1401022);墨旱莲药材(厂家:安徽芍花堂药业有限公司、批号:ΖΥ1402007);白芍药材(厂家:安徽芍花堂药业有限公司、批号:JY140101);黄芪药材(厂家:安徽芍花堂药业有限公司、批号:ZY1401021);狗脊药材(厂家:安徽芍花堂药业有限公司、批号:ΖΥ1401020);芍药苷对照品(中国食品药品检定研究院、110738-201337)。
[0080]生血宝颗粒(湖南康寿制药有限公司，批号为20120501、20121105、20121207、20121211、20130701、20130704、20130801、130701、130803、130805);生血宝胶囊、片剂、口服液、丸剂(实验室自制)；生血宝中间体(实验室自制)。
[0081]实施例一
[0082]本实施例一以生血宝颗粒剂为实验材料建立生血宝制剂特征图谱。
[0083]本发明实施例一提供的生血宝制剂特征图谱的建立方法，包括如下步骤。
[0084]S101、参照物溶液的制备。[0085]称取芍药苷对照品，置于容量瓶中，加50%-100% (体积)甲醇溶解并稀释成0.02mg/ml的溶液，摇匀，即得到参照物溶液，参照物叠加色谱图如图1所示。本实施例中50% -100% (体积)甲醇指的是甲醇的体积比为50% -100%的甲醇水溶液。
[0086]S102、供试品溶液的制备。
[0087]取生血宝颗粒剂粉末0.6g，精密称定后置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，密塞，称定重量。超声处理IOmin后放冷，再称定重量，用甲醇补足减掉的重量，摇匀后过滤。取续滤液作为供试品溶液。
[0088]S103、吸取参照物溶液和供试品溶液注入高效液相色谱仪，按照高效液相色谱法检测，得到生血宝颗粒剂特征图谱。
[0089](I)步骤S103可以选用安捷伦1260高效液相色谱仪，含在线真空脱气机器(G-1311C)、二元泵(G-1311C)、标准自动进样器(G-1329B)、智能化柱温箱(G-1316A)、DAD检测器(G-1314B)、Agilentl260Infinity色谱工作站(美国安捷伦科技有限公司)；SB-5200D超声波清洗仪(宁波新芝生物科技股份有限公司)；FAZ004B分析天平(上海佑科)；BT125D电子天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)。
[0090](2)步骤S103检测的色谱条件如下:
[0091]a、流动相的选择。
[0092]流动相由流动相A和流动相B组成。具体的，可以选择乙腈-水、乙腈-(0.1^-0.2%)磷酸溶液、乙腈-0.1 %甲酸溶液、甲醇-0.1 %磷酸溶液、甲醇-0.1%甲酸溶液、甲醇-水等为流动相(前面为流动相A，后面为流动相B)进行试验。结果表面，乙腈-0.1 %磷酸溶液、乙腈-0.2%磷酸溶液为流动相时，色谱峰的峰形好，各峰分离较完全，其中乙腈-0.1 %磷酸溶液为流动相时效果最好，优选选用乙腈-0.1 %磷酸溶液作为最佳流动相，即流动相A为乙腈，流动相B为0.1 % (体积)磷酸溶液。a中％均代表体积百分比。
[0093]由于生血宝颗粒剂中成分复杂，在恒流条件下，供试品溶液中的各个成分分离度较差，较难体现特征图谱的整体特性；流动相以如下表1所示的梯度洗脱，样品中各组分均有较好的分离，基线平稳，故选用为流动相。
[0094]表1
【权利要求】
1.生血宝制剂特征图谱的建立方法，其特征在于，包括以下步骤: 取芍药苷对照品溶解于50%-100% (体积)甲醇中以形成芍药苷对照品浓度为0.02mg/ml溶液，摇匀后得到参照物溶液； 取设定量的生血宝制剂溶解于O % -100%甲醇、O % -50%乙醇或25-125ml水，称重后通过回流提取或超声处理10-60min，冷却后，再称重量，然后用同种溶剂补重，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液，所述生血宝制剂为口服液或合剂，所述设定量为1.0-5.0ml，或者所述生血宝制剂为颗粒剂、片剂、胶囊剂、丸剂或生血宝制剂中间体，所述设定量为0.6-3.0g的粉末； 吸取所述参照物溶液和供试品溶液注入高效液相色谱仪，按照高效液相色谱法检测，得到生血宝制剂的特征图谱；其中，色谱柱为C18反相色谱柱；采用梯度洗脱，且梯度洗脱液的流动相的流速为0.8ml/min-l.2ml/min ;检测波长为200_230nm，柱温为25°C _40°C;梯度洗脱时间为60min-120min。
2.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，梯度洗脱液的流动相为乙腈-水、乙腈-(0.1^-0.2%)磷酸溶液、乙腈-0.1 %甲酸溶液、甲醇-0.1 %磷酸溶液、甲醇-0.1%甲酸溶液或甲醇-水。
3.根据权利要求2所述的建立方法，其特征在于，所述梯度洗脱液的流动相为流动相A和流动相B组成，流动相A为乙腈，流动相B为0.1 % (体积)磷酸溶液。
4.根据权利要求3所述的建立方法，其特征在于，吸取所述参照物溶液和供试品溶液均为5μ I注入高效 液相色谱仪，所述梯度洗脱的时间为60min，采用如下方式进行梯度洗脱: 0-15min，流动相A的体积百分比为2%，流动相B的体积百分比为98% ； 15-30min，流动相A的体积百分比为2% -15%，流动相B的体积百分比为98% -85%； 30-50min,流动相A的体积百分比为15 % -25 %，流动相B的体积百分比为85 % -75 % ； 50-60min,流动相A的体积百分比为25 %，流动相B的体积百分比为75 %。
5.根据权利要求4所述的建立方法，其特征在于，所述流动相的流速为l.0ml/min，所述C18反相色谱柱的柱长为250nm。
6.生血宝制剂特征图谱，其特征在于，采用如权利要求1所述的建立方法获得，所述特征图谱通过取生血宝颗粒剂粉末0.6g溶解于25ml的甲醇溶液得到的供试品溶液检测得到，所述特征图谱具有7个特征峰，其中，5号峰以芍药苷为参照的参照峰，各个特征峰相对保留时间和相对标准偏差为: I号峰:相对保留时间0.383±0.019，相对标准偏差为0.19% ； 2号峰:相对保留时间0.672±0.034，相对标准偏差为0.07% ； 3号峰:相对保留时间0.801 ±0.040，相对标准偏差为0.05% ; 4号峰:相对保留时间0.956±0.048，相对标准偏差为0.01% ； 5号峰:相对保留时间1.000±0.000，相对标准偏差为0.00% ； 6号峰:相对保留时间1.143±0.057，相对标准偏差为0.01% ; 7号峰:相对保留时间1.188±0.059，相对标准偏差为0.03%。
7.生血宝制剂特征图谱，其特征在于，采用如权利要求1所述的建立方法获得，所述特征图谱通过取3.0g生血宝制剂中间体溶解于125ml的水得到的供试品溶液检测得到，所述特征图谱具有7个特征峰，其中，5号峰以芍药苷为参照的参照峰，各个特征峰相对保留时间和相对标准偏差为: I号峰:相对保留时间0.383±0.019，相对标准偏差为0.14% ； 2号峰:相对保留时间0.672±0.034，相对标准偏差为0.00% ； 3号峰:相对保留时间0.801 ±0.040，相对标准偏差为0.05% ； 4号峰:相对保留时间0.956±0.048，相对标准偏差为0.00% ； 5号峰:相对保留时间1.000±0.000，相对标准偏差为0.00% ； 6号峰:相对保留时间1.143±0.057，相对标准偏差为0.00% ； 7号峰:相对保留时间1.188±0.059，相对标准偏差为0.00%。
8.生血宝制剂特征图谱，其特征在于，采用如权利要求1所述的建立方法获得，所述特征图谱通过取1.2g生血宝胶囊粉末溶解于50ml的50%甲醇得到的供试品溶液检测得到，所述特征图谱具有7个特征峰，其中，5号峰以芍药苷为参照的参照峰，各个特征峰相对保留时间和相对标准偏差为: I号峰:相对保留时间0.383±0.019，相对标准偏差为1.19% ； 2号峰:相对保留时间0.672±0.034，相对标准偏差为0.43% ； 3号峰:相对保留时间0.801 ±0.040，相对标准偏差为0.19% ； 4号峰:相对保留时间0.956±0.048，相对标准偏差为0.05% ； 5号峰:相对保留时间1.000±0.000，相对标准偏差为0.00% ； 6号峰:相对保留时间1.143±0.057，相对标准偏差为0.28% ； 7号峰:相对保留时间1.188±0.059，相对标准偏差为0.12%。
9.生血宝制剂特征图谱，其特征在于，采用如权利要求1所述的建立方法获得，所述特征图谱通过取2.4g生血宝片剂溶解于100mL的25%乙醇得到的供试品溶液检测得到，所述特征图谱具有7个特征峰，其中，5号峰以芍药苷为参照的参照峰，各个特征峰相对保留时间和相对标准偏差为: I号峰:相对保留时间0.383±0.019，相对标准偏差为0.19% ； 2号峰:相对保留时间0.672±0.034，相对标准偏差为0.07% ； 3号峰:相对保留时间0.801 ±0.040，相对标准偏差为0.05% ； 4号峰:相对保留时间0.956±0.048，相对标准偏差为0.01% ； 5号峰:相对保留时间1.000±0.000，相对标准偏差为0.00% ； 6号峰:相对保留时间1.143±0.057，相对标准偏差为0.01% ; 7号峰:相对保留时间1.188±0.059，相对标准偏差为0.03%。
10.生血宝制剂特征图谱，其特征在于，采用如权利要求1所述的建立方法获得，所述特征图谱通过取Iml生血宝口服液溶解于25ml的50%乙醇得到的供试品溶液检测得到，所述特征图谱具有7个特征峰，其中，5号峰以芍药苷为参照的参照峰，各个特征峰相对保留时间和相对标准偏差为: I号峰:相对保留时间0.383±0.019，相对标准偏差为0.21% ; 2号峰:相对保留时间0.672±0.034，相对标准偏差为0.08% ； 3号峰:相对保留时间0.801 ±0.040，相对标准偏差为0.07% ； 4号峰:相对保留时间0.956±0.048，相对标准偏差为0.05% ；.5号峰:相对保留时间1.000±0.000，相对标准偏差为0.00% ；.6号峰:相对保留时间1.143±0.057，相对标准偏差为0.00% ；.7号峰:相对保留时间1.188±0.059，相对标准偏差为0.04%。
【文档编号】G01N30/02GK104020225SQ201410187475
【公开日】2014年9月3日 申请日期:2014年5月6日 优先权日:2014年5月6日
【发明者】谈发金, 郑桂林, 柳卓 申请人:湖南康寿制药有限公司