一种毛蚶蛋白质的鉴别方法
【专利摘要】本发明涉及一种毛蚶蛋白质的鉴别方法，其特征在于使用凝胶色谱柱高效液相色谱法，提供一种毛蚶蛋白质多肽的专属性鉴别方法，使毛蚶制剂在生产和使用中有效的保证产品质量，进而保证药品疗效。
【专利说明】一种毛蚶蛋白质的鉴别方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及药品检测方法，具体涉及一种毛蚶蛋白质的鉴别方法，属药品【技术领域】。
【背景技术】
[0002]毛蚶肉含丰富的蛋白质、维生素及人体所必需的氨基酸，自古就有着食用、药用价值，《医林纂要》注“蚶肉补心血、散瘀血、除烦醒酒、破结消痰”，《日华子本草》注“蚶肉益血色”。近年来，研究报道显示毛蚶有抗肿瘤作用，具有清除体内自由基、提高机体免疫力的功效。毛蚶肉制剂对肺癌、肾癌、胃癌、肝癌等多种癌症具有较好的治疗作用，且安全性良好。
[0003]根据文献报道毛蚶蛋白质是毛蚶的主要生物活性成分之一，且富含人体所需的必需氨基酸，8种必需氨基酸占总氨基酸的36.5%。抗癌肽类具有很高的抗癌活性。现有文献动植物蛋白质的含量测定方法较多，但对动植物蛋白质的专属性报道很少，更未见对毛蚶蛋白质专属性鉴别方法的研究报道。无法在生产和使用中有效的保证产品质量，进而药品疗效得不到保证。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种毛蚶蛋白质多肽的专属性鉴别方法，使毛蚶制剂在生产和使用中有效的保证产品质量，进而保证药品疗效。
[0005]本发明是这样实现的:
一种毛蚶蛋白质多肽的鉴别方法，其特征在于使用凝胶色谱柱高效液相色谱法，具体步骤如下:
色谱条件及系统适应性:用亲水球形高聚物为填充剂的凝胶色谱柱；以
0.01-0.1OmoI/L的磷酸盐缓冲液为流动相；检测波长为280 nm ;柱温:20-40°C ;流速:
0.lml-lml /min。理论板数按蛋白质分子量100000计算应不低于3000。
[0006]制备毛蚶多肽:取毛蚶制剂研细，称取含毛蚶提取物约5_20g的样品，加10-15倍水超声提取20-40 min,离心5-15 min,取上层液,滤过,滤液按体积分数50-70% (w/v)加入硫酸铵，O?4°C放置过夜，离心，取沉淀，加水5-10ml溶解，以0.5-2%的碳酸氢铵溶液为透析液，用截留分子量为3500的透析膜，O?4°C条件下充分透析(用0.5-2%的BaCl2溶液检查硫酸根离子是否透析完全)，将透析膜内溶液转移至20-100ml量瓶内，用水定容，O?4°C保存，即得毛蚶多肽供试品。
测定:取毛蚶多肽供试品溶液10-100μ 1，注入液相色谱仪，测定，即得。
[0007]毛蚶多肽图谱中在保留时间15.6min左右有一尖锐的特征峰“峰S”，峰S保留时间差异应在±5%之内。
[0008]上述的一种毛蚶多肽的鉴别方法，色谱条件及系统适应性优化为:用亲水球形高聚物为填充剂的凝胶色谱柱；以0.05 mol/L的磷酸盐缓冲液为流动相；检测波长为280nm ;柱温:25。0 ;流速:0.4ml/min。理论板数按蛋白质分子量100000计算应不低于5000。[0009]上述的一种毛蚶多肽的鉴别方法，制备毛蚶多肽优化为:
取毛蚶制剂研细，称取含毛蚶提取物约10_12g，加10-12倍水超声提取30-35 min，离心8-12 min,取上层液,滤过,滤液按体积分数60-65% (w/v)加入硫酸铵,O~4°C放置过夜，离心，取沉淀，加水IOml溶解，以1%的碳酸氢铵溶液为透析液，用截留分子量为3500的透析膜，O~4°C条件下充分透析(用0.8-1 %的BaC12溶液检查硫酸根离子是否透析完全)，将透析膜内溶液转移至25-50ml量瓶内，用水定容，O~4°C保存，即得毛蚶多肽供试品。
[0010]上述的一种毛蚶多肽的鉴别方法，制备毛蚶多肽进一步优化为:
毛蚶提取物溶液的制备取毛蚶制剂研细，称取含毛蚶提取物IOgja 12倍水超声提取30 min,离心10 min,取上层液,滤过,滤液按体积分数60% (w/v)加入硫酸铵,O~4°C放置过夜，离心，取沉淀，加水IOml溶解，以1%的碳酸氢铵溶液为透析液，用截留分子量为3500的透析膜，O~4°C条件下充分透析(用I %的BaC12溶液检查硫酸根离子是否透析完全)，将透析膜内溶液转移至50ml量瓶内，用水定容，O~4°C保存，即得毛蚶多肽供试品。
[0011]上述的一种毛蚶多肽的鉴别方法，测定优化为取毛蚶多肽供试品溶液10-50μ 1，注入液相色谱仪，测定。
[0012]上述的一种毛蚶多肽的鉴别方法，测定进一步优化为取毛蚶多肽试品溶液20 μ 1，注入液相色谱仪，测定。
[0013]上述的一种毛蚶多肽的鉴别方法，可用于毛蚶提取物各种制剂的鉴别。 [0014]上述的一种毛蚶多肽的鉴别方法，可用于魁蚶、泥蚶、花蛤、扇贝提取物及其各种制剂的鉴别。
[0015]本发明的有益效果在于:提供一种毛蚶多肽的鉴别方法，能准确的鉴别毛蚶近源物种魁蚶、泥蚶、扇贝、花蛤等来源的多肽。
[0016]下面通过试验例，进一步说明本发明的有益效果。
[0017]主要仪器与试药
岛津-20Α高效液相色谱仪，紫外检测器；色谱柱:TSK GEL G4000 PffXL(7.8mmX 300mm)；流动相:0.05 mol/1的磷酸盐缓冲液；柱温25?;流速0.4ml/min ;检测波长280nm ;理论板数按蛋白质分子量100000计算为5000。
[0018]试验方法及结果
2.1方法分别制备毛蚶肉、毛蚶肉提取物、毛蚶提取物胶囊、毛蚶提取物片剂、毛蚶提取物丸剂、毛蚶提取物颗粒、魁蚶肉、泥蚶肉、花蛤肉、扇贝肉多肽。
[0019]分别取干毛蚶、魁蚶、泥蚶、花蛤、扇贝肉，粉碎，过60目筛，加8倍量的水，加热提取2次，每次45分钟，合并提取液，过滤，取滤液，浓缩至相对密度为1.10~1.15 (60°C)时，80°C以下，减压干燥，粉碎，分别制得毛蚶、魁蚶、泥蚶、花蛤、扇贝提取物。
[0020]分别取毛蚶提取物胶囊内容物、毛蚶提取物片剂、毛蚶提取物丸剂、毛蚶提取物颗粒粉碎，分别得毛蚶提取物胶囊、毛蚶提取物片剂、毛蚶提取物丸剂、毛蚶提取物颗粒粉。
[0021]分别制备多肽，分别取毛蚶肉提取物、毛蚶提取物胶囊粉、毛蚶提取物片剂粉、毛蚶提取物丸剂粉、毛蚶提取物颗粒粉、魁蚶肉提取物、泥蚶肉提取物、花蛤肉提取物、扇贝肉提取物10 g，加12倍水超声提取30 min，离心10 min，取上层液，滤过，滤液按体积分数60%(w/v)加入硫酸铵，O~4°C放置过夜，离心，取沉淀，加水IOml溶解，以1%的碳酸氢铵溶液为透析液，用截留分子量为3500的透析膜，O~4°C条件下充分透析(用1%的BaC12溶液检查硫酸根离子是否透析完全)，将透析膜内溶液转移至50ml量瓶内，用水定容，O~4°C保存，分别得毛蚶肉、毛蚶肉提取物、毛蚶提取物胶囊、毛蚶提取物片剂、毛蚶提取物丸剂、毛蚶提取物颗粒、魁蚶肉、泥蚶肉、花蛤肉、扇贝肉多肽供试品。
[0022]分别取毛蚶肉、毛蚶肉提取物、毛蚶提取物胶囊、毛蚶提取物片剂、毛蚶提取物丸剂、毛蚶提取物颗粒、魁蚶肉、泥蚶肉、花蛤肉、扇贝肉多肽供试品溶液，注入液相色谱仪，测定。
[0023]结果
不同多肽的图谱结果见表1。
[0024]表1不同多肽的图谱结果
【权利要求】
1.一种毛蚶蛋白质多肽的鉴别方法，其特征在于使用凝胶色谱柱高效液相色谱法，具体步骤如下: 色谱条件及系统适应性:用亲水球形高聚物为填充剂的凝胶色谱柱；以0.01-0.1OmoI/L的磷酸盐缓冲液为流动相；检测波长为280 nm ;柱温:20-40°C ;流速:0.lml-lml /min ;理论板数按蛋白质分子量100000计算应不低于3000 ； 制备毛蚶多肽:取毛蚶制剂研细，称取含毛蚶提取物约5-20g的样品，加10-15倍水超声提取20-40 min,离心5-15 min,取上层液,滤过,滤液按体积分数50-70% (w/v)加入硫酸铵，O~4°C放置过夜，离心，取沉淀，加水5-10ml溶解，以0.5-2%的碳酸氢铵溶液为透析液，用截留分子量为3500的透析膜，O~4°C条件下充分透析(用0.5-2%的BaCl2溶液检查硫酸根离子是否透析完全)，将透析膜内溶液转移至20-100ml量瓶内，用水定容，O~4°C保存，即得毛蚶多肽供试品； 测定:取毛蚶多肽供试品溶液10-100μ 1，注入液相色谱仪，测定； 毛蚶多肽图谱中在保留时间15.6min左右有一尖锐的特征峰“峰S”，峰S保留时间差异应在±5%之内。
2.根据权利要求1的一种毛蚶多肽的鉴别方法，其特征在于色谱条件及系统适应性:用亲水球形高聚物 为填充剂的凝胶色谱柱；以0.05 mol/L的磷酸盐缓冲液为流动相；检测波长为280 nm ;柱温:25。0 ;流速:0.4ml/min ;理论板数按蛋白质分子量100000计算应不低于5000。
3.根据权利要求1的一种毛蚶多肽的鉴别方法，其特征在于制备毛蚶多肽为:取毛蚶制剂研细，称取含毛蚶提取物约10-12g，加10-12倍水超声提取30-35 min,离心8_12 min,取上层液，滤过，滤液按体积分数60-65% (w/v)加入硫酸铵，O~4°C放置过夜，离心，取沉淀，加水IOml溶解，以1%的碳酸氢铵溶液为透析液，用截留分子量为3500的透析膜，O~4°C条件下充分透析(用0.8-1%的BaC12溶液检查硫酸根离子是否透析完全)，将透析膜内溶液转移至25-50ml量瓶内，用水定容，O~4°C保存，即得毛蚶多肽供试品。
4.根据权利要求1或权利要求3的一种毛蚶多肽的鉴别方法其特征在于制备毛蚶多肽为:取毛蚶制剂研细，称取含毛蚶提取物10 g，加12倍水超声提取30 min，离心10 min，取上层液，滤过，滤液按体积分数60% (w/v)加入硫酸铵，O~4°C放置过夜，离心，取沉淀，加水IOml溶解，以1%的碳酸氢铵溶液为透析液，用截留分子量为3500的透析膜，O~4°C条件下充分透析(用1%的BaC12溶液检查硫酸根离子是否透析完全)，将透析膜内溶液转移至50ml量瓶内，用水定容，O~4°C保存，即得毛蚶多肽供试品。
5.根据权利要求1的一种毛蚶多肽的鉴别方法，其特征在于取毛蚶多肽供试品溶液10-50 μ 1，注入液相色谱仪，测定。
6.根据权利要求1或权利要求6的一种毛蚶多肽的鉴别方法，其特征在于取毛蚶多肽供试品溶液20 μ 1，注入液相色谱仪，测定。
7.根据权利要求1或权利要求2或权利要求3或权利要求4或权利要求5或权利要求6或权利要求7的一种毛蚶多糖的鉴别方法，其特征在于用于毛蚶提取物及其各种制剂的鉴别。
8.根据权利要求1或权利要求2或权利要求3或权利要求4或权利要求5或权利要求6或权利要求7的一种毛蚶多肽的鉴别方法，其特征在于用于魁蚶、泥蚶、花蛤、扇贝提取物及其各种制 剂的鉴别。
【文档编号】G01N30/06GK103969367SQ201410187610
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2014年5月6日 优先权日:2014年5月6日
【发明者】刘圣梅, 李诗标, 赵颖, 许翠萍, 张晶 申请人:济南康众医药科技开发有限公司