利用4个蛋白联合预测食道癌患者预后的试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明所要解决的技术问题是提供一种检测石蜡包埋组织中目的蛋白表达情况的试剂。本发明解决该技术问题的技术方案是提供了一种评价食道癌患者预后信息的检测试剂盒。该试剂盒包括4种目的蛋白的抗体-δ-catenin、Dynamin-2、Erbin和LAP-1抗体，还包括山羊血清、0.01M柠檬酸盐修复液、3％H2O2、Polymer增强剂、Polymer聚合物、DAB显色试剂、PBS溶液。使用该试剂盒评价食道癌患者的预后比国际TNM分期简单易行，且敏感性及特异性均高于TNM分期，以及更适用于国人的食道癌预后评估。
【专利说明】利用4个蛋白联合预测食道癌患者预后的试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及联合多个蛋白抗体并利用免疫组织化学超敏型二步法去检测食道癌患者标本的表达情况进而预测患者预后的试剂盒。
【背景技术】
[0002]食道鱗状细胞癌(EsophagealSquamous Cell Carcinoma, ESCC)在我国是一种常见的上消化道恶性肿瘤，在国人的恶性肿瘤死亡率中位居第四位。全世界每年40余万的新发食道癌病例中，一半以上发生在我国，我国也是世界上公认的食道癌第一高发国。上世纪70年代，在全国范围内实施了恶性肿瘤普查，确立河北磁县、河南林县、山西阳泉、四川盐亭、广东潮汕和江苏淮安等地区为中国食道癌六大高发区。
[0003]准确预测食道癌患者的预后对于临床进一步的治疗和随访具有重要意义。然而，目前除了国际T匪分期外还没有一种简便有效的方法可以更加准确地预测食道癌患者的预后。然而，期预测患者的预后比较繁琐，需要准确地评价肿瘤的浸润深度、转移淋巴结的个数、肿瘤有无远处转移等，况且国际?m分期的制定缺少大量国人食道癌的病例资料，因此在评价我国患者的预后时适用性比较差，而本发明所采用的4个指标联合预测患者预后的试剂盒比单个指标检测具有更高的预测效果，同时也明显高于?!分期的预测能力，并且本发明所基于的免疫组织化学超敏型二步法是一种成熟可靠、可在基层医院广泛使用的方法。本试剂盒中4种抗体蛋白的背景介绍如下。
[0004]δ -catenin蛋白作为黏附分子Catenin家族中的一员，除了在神经元突触处发挥重要的生理作用外，其在肿瘤演进过程中所发挥的作用也越来越受到人们的关注。最近的文献也报道了 S-catenin在肺癌、前列腺癌、大脑星形细胞瘤及卵巢癌中的表达明显增高且和患者的不良预后密切相关。然而，在国人恶性肿瘤死亡率居第四位的食道癌中δ-catenin的表达情况如何及其与患者预后的关系尚不清楚。本发明的前期研究发现δ-catenin在食道癌组织中高表达并与患者的不良预后密切相关。
[0005]Dynamin-2蛋白主要定位在细胞连接处，并参与细胞伪足的形成。在子宫颈鳞状细胞癌中Dynamin-2的表达增加。本发明的前期研究发现Dynamin-2在食道癌组织中的表达与患者的不良预后密切相关。
[0006]Erbin蛋白定位在细胞连接半桥粒处,在皮肤鳞状细胞癌中Erbin的表达增加。本发明的前期研究发现Erbin在食道癌组织中高表达并与患者的不良预后密切相关。
[0007]LAP-1蛋白也定位在细胞连接处，特别是神经元突触膜上。该蛋白在肿瘤组织中表达的研究甚少。本发明的前期研究发现LAP-1在食道癌组织中的表达与患者的不良预后密切相关。
[0008]虽然上述每种蛋白均具有预测食道癌患者预后的能力，但把4种蛋白联合起来预测食道癌患者的预后则具有更强的判断效能，甚至高于国际公认的TNM分期的预测能力。
【发明内容】
[0009]本发明所要解决的技术问题是提供一种基于免疫组织化学方法的4个蛋白抗体联合预测食道癌患者预后的试剂盒。
[0010]其中，上述的免疫组织化学方法主要是检测中性福尔马林固定和石蜡包埋的标本。
[0011]其中，上述试剂盒主要包括4种蛋白抗体,分别是δ-catenin、Dynamin-2、Erbin和LAP-1抗体。
[0012]其中，上述试剂盒还包括:山羊血清,0.01M柠檬酸盐修复液,3% H2O2, Polymer增强剂，Polymer聚合物，DAB显色试剂，PBS溶液。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1是δ -catenin蛋白在不同表达人群的Kaplan-Meier生存曲线(X2 = 6.671,P = 0.010)。
[0014]图2是Dynamin-2蛋白在不同表达人群的Kaplan-Meier生存曲线(X2 = 5.181,P = 0.023)。
[0015]图3是Erbin蛋白在不同表达人群的Kaplan-Meier生存曲线(X2 = 4.633, P =0.031.)。 [0016]图4是LAP-1蛋白在不同表达人群的Kaplan-Meier生存曲线(X2 = 8.546，P =
0.003)。
[0017]图5是4种蛋白联合后判断该人群的Kaplan-Meier生存曲线(X2 = 18.574，Ρ〈0.001.)。
[0018]图6是ROC曲线(注:4种蛋白联合后形成的曲线下面积最大，为0.627)。
【具体实施方式】
[0019]我们收集了 299例2007-2011年的食道癌患者的手术标本存档蜡块。下面结合附图实施例作进一步详细描述。
[0020]免疫组织化学超敏型二步法步骤如下。
[0021]标本经连续切片、二甲苯脱蜡、梯度酒精水化后，用超敏型二步法检测目的蛋白的表达，具体方法如下。
[0022](I)切片经0.01M柠檬酸盐修复液抗原修复、3% H2O2灭活内源性过氧化物酶、山羊血清封闭后，分别与δ -catenin、Dynamin-2、Erbin> LAP-1抗体4°C孵育过夜。
[0023](2)切片与Polymer增强剂和Polymer聚合物分别孵育后经DAB显色。
[0024](3)切片经苏木素复染核，梯度酒精脱水，二甲苯透明和中性树胶封片。
[0025](4)切片在完成上述每步后均经PBS溶液洗涤。
[0026]所有的免疫染色切片经2位病理医师采用盲法独立评分。肿瘤细胞浆中出现棕黄色颗粒被认为是阳性信号。染色强度分为4级:0，阴性；1，弱染色；2，中度染色；3，强染色。阳性细胞百分数分为5级:0，0~5% ;1，6~25% ;2，26~50% ;3，51~75% ;4，≥76%。每个标本的总分数是由肿瘤细胞染色强度和肿瘤细胞阳性百分数两部分的乘积得出的，范围是O~12。为了方便统计，我们把所有病例分为低表达和高表达2组，I代表低表达组，2代表高表达组,其cut-off值根据X-tile软件确定。δ -catenin:0~7分为低表达组，8~12分为高表达组；Dynamin-2:0~4分为低表达组,6~12分为高表达组；Erbin:0~I分为低表达组，2~12分为高表达组；LAP-1:0~4分为低表达组，6~12分为高表达组。
[0027]4个指标联合起来判断食道癌患者预后的方程式如下。
[0028]Y= α ΧΑ+β XB+Y XC+δ XD，其中α、β、Y、δ为系数，通过Cox回归可以得出数值，故方程式变为Y = 0.367ΧΑ+0.349ΧΒ+0.556XC+0.410XD。A、B、C、D为该例标本中4个蛋白的表达状态，I代表低表达，2代表高表达。计算出每例标本的Y值后按照从小到大的顺序排列，其中位于中间位置的病例对应的Y值为cut-off值，即2.092。小于等于该值的病例为低危组，高于该值的病例为高危组，这样分成2组后再进行单因素统计分析。此外，也可以通过绘制ROC曲线去比较每个蛋白形成的曲线下面积(AUC)的大小。
[0029]数据的统计学处理。
[0030]使用SPSS13.0统计软件处理数据。各蛋白的表达与患者的年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤位置、肿瘤分化程度、浸润深度、淋巴结转移状态、?m分期之间的关系使用Ch1-Square检验；各蛋白的表达与患者的生存时间的关系使用Kaplan-Meier生存分析；预测影响患者预后的独立危险因素使用Cox比例风险回归模型；每种蛋白预测食道癌患者预后的效能使用ROC曲线；P〈0.05被认为有统计学显著性。
[0031]结果显示:4个蛋白的表达都与食道癌患者的--Μ分期及淋巴结转移状态密切相关。
[0032]Cox风险回归模型检测各蛋白单独或联合表达后的Risk值及是否是患者预后的独立危险因素如下。
[0033]δ -catenin的表达状态与患者的生存时间密切相关，并且还是独立的预后因子(Risk = 1.775,95% Cl = 1.282-2.459，P = 0.001)。
[0034]Dynamin-2的表达状态与患者的生存时间密切相关，但不是独立的预后因子(Risk = 1.295,95% Cl = 0.933-1.798, P = 0.123)。
[0035]Erbin的表达状态与患者的生存时间密切相关，但不是独立的预后因子(Risk =1.215,95% Cl = 0.867-1.705, P = 0.258)。
[0036]LAP-1的表达状态与患者的生存时间密切相关，但不是独立的预后因子(Risk =
1.417,95% Cl = 0.951-2.111，P = 0.087)。
[0037]4个蛋白联合具有更强的食道癌预后预测能力，同时也是独立的预后因子(Risk=1.854，95% Cl = 1.336-2.574，Ρ〈0.001)，甚至高于 TNM 分期(Risk = 1.798，95 % Cl=1.290-2.507，P = 0.001)和淋巴结转移状态(Risk = 1.781,95% Cl = 1.272-2.493，P = O- 001)的预测能力。
[0038]4个蛋白联合后形成的ROC曲线面积是最大的，同时也具有较高的敏感性和特异性。
[0039]
【权利要求】
1.一种预测食道癌患者预后的试剂盒，其特征在于试剂盒中包括抗δ-catenin、抗Dynamin-2、抗Erbin和抗LAP-1四种蛋白抗体。
2.根据权利要求1所述的预测食道癌患者预后的试剂盒，其特征在于:试剂盒中还包括山羊血清、0.01M柠檬酸盐修复液、3% H2O2^Polymer增强剂、Polymer聚合物、DAB显色试剂、PBS溶液。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒在制备联合预测食道癌患者预后的试剂盒中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于使用试剂盒所检测的标本为中性福尔马林固定和石蜡包埋的组织蜡块。
5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于:所使用的检测方法为免疫组织化学超敏型二步法。
6.根据权利要求3-5任一项所述的应用，其特征在于预测食道癌患者预后的方法包括如下步骤:标本经切片、脱蜡、水化后用超敏型二步法检测目的蛋白的表达。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于预测食道癌患者预后的方法具体如下:切片经脱蜡至水、抗原修复、灭活内源性过氧化物酶和山羊血清封闭后，分别与一抗δ -catenin、Dynamin_2、Erbin和LAP-1在保湿盒内孵育过夜；随后分别与Polymer增强剂和Polymer聚合物孵育后经DAB显色和苏木素复染细胞核；最后经酒精脱水和二甲苯透明后用中性树胶封片，并对每张免疫组化染色切片进行评分。
8.根据权利要求3-7任一项所述的应用，其特征在于:每种蛋白表达高低的cut-off值由X-tile软件确定,其中δ -catenin的cut-off值是7分,Dynamin-2的cut-off值是4 分，Erbin 的 cut-off 值是 I 分，LAP-1 的 cut-off 值是 4 分。
9.根据权利要求3-8任一项所述的应用，其特征在于:每例标本在应用4种抗体分别检测后，其4种蛋白联合表达的计算公式为Y = α ΧΑ+β XB+Y XC+δ XD,其中α、β、Y、δ为系数，可以通过Cox回归得出，故该公式转换为Y =0.367XA+0.349XB+0.556XC+0.410 XD ;A、B、C、D 分别为该例标本中 δ -catenin、Dynamin-2,Erbin,LAP-1蛋白的表达状态，I代表低表达，2代表高表达；在计算出每例标本的Y值后按照从小到大的顺序排列，其中位于中间位置的标本所对应的Y值为cut-off值，即2.092，那么低于该值的病例为低危组，高于该值的病例为高危组。
10.根据权利要求3-9任一项所述的应用，其特征在于:评价个体食道癌患者预后的信息时，只需把该患者4个蛋白的免疫组化得分所对应的表达状态套入公式中，就可以得出Y值，然后与我们确定的cut-off值2.092比较，小于该值的患者属于低危组，其3年生存率为40.74%，而大于该值的患者属于高危组，其3年生存率为21.13%。
【文档编号】G01N33/574GK104034902SQ201410202256
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2014年5月9日 优先权日:2014年5月9日
【发明者】张俊毅, 白玉勤, 瑞云, 董彩凤, 许秀娥, 吴健谊, 许丽艳, 李恩民 申请人:赤峰学院, 汕头大学医学院