一种筛选茵陈蒿汤药效物质基础的方法
【专利摘要】一种筛选茵陈蒿汤药效物质基础的方法，它涉及一种筛选中药药效物质基础的方法。本发明要解决现有茵陈蒿汤筛选有效成分时间周期长、耗费大及成本高的问题。本发明方法：一、茵陈蒿汤体内成分峰面积建立；二、基于CCL4肝损伤模型的茵陈蒿汤代谢组学生物标记物建立；三、PCMS研究方法的建立。本发明提供了一种能够快速、简单、准确、耗费小、成本低且通用性较好的筛选中药药效物质基础的方法，该法能够有效确定药效相关成分，并能体现多成分对药效指标综合作用的特点。本发明用于筛选药效物质基础。
【专利说明】一种筛选茵陈蒿汤药效物质基础的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种筛选中药药效物质基础的方法，涉及医药领域。
【背景技术】
[0002] 中药是中医临床预防及治疗疾病的重要物质基础，具有多组分、多途径、多靶点、 多效应整体调节的作用特点，使得研究中药复方物质基础、生物效应及其相互关系相当复 杂。挖掘和阐释中药活性物质成分是研发安全有效、质量可控的现代中药的基础，是揭示 中药科学内涵、指导临床合理用药的前提。由于中药复方体系的复杂性，使得单纯依赖组 分分离或成分分离的传统物质基础研究思路，因研究工作量大而无法穷尽。且中药多组分 "谱-效"研究大多局限于多成分的"谱"与复方药理效应单一指标的"效"之间"系统-点" 的研究，导致现有的研究报告并不能较好地反映其相关性。中药的复杂性极大地限制了中 药药效物质基础的确认及评价。中药的多成分、多靶点及整体性使中药药效物质基础评价 研究进展缓慢。中药血清药物化学，即从口服方剂后的含药血清中分离鉴定中药药效物质 基础的思路和研究设计，使研究结果体现中药成分的体内治疗状态，获得体现方剂治疗效 应的体内直接作用物质，超越体外单味药化学分析难以进行的障碍。中药血清药物化学研 究方法为发现中药药效物质基础，解决中药有效性及安全性等质量问题提供了方法学支 撑，被国内外广泛应用。利用代谢组学技术解释疾病的生物学本质，利用血清药物化学方法 发现方剂的体内直接作用物质；在有效性的前提下将内源性证候的生物标记物与体内的外 源性方剂成分相关联阐明方剂药效物质基础及有效性机制，可阐明方剂配伍规律及其科学 内涵。
[0003] 中药入血成分与中药药效之间必然存在关联性，可以利用相关分析将入血成分谱 的峰面积（含量）与药效作用强度的动态变化联系起来，通过统计分析并通过生物学实验 来确定众多成分中真正的有效成分。鉴于此，基于中药的临床用药形式，以方剂为起点，利 用中药血清药物化学方法分析口服方剂后的中药体内直接作用物质及其动态规律，并结合 内源性证/病的生物标记物（中药药效标记物）的轨迹变化规律，建立并完善血清中外源 性中药成分与内源性标记物两组变量关联度分析方法Plotting of Correlation between Marker Metabolites and Serum Constituents (PCMS)，提取与内源性标记物高度关联的外 源性中药成分作为潜在的中药药效物质基础，进行生物学验证，确定中药药效物质基础。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是为了解决现有茵陈蒿汤筛选有效成分时间周期长、耗费大及成本 高的问题，提供一种筛选茵陈蒿汤药效物质基础的方法。
[0005] 本发明的一种筛选茵陈蒿汤药效物质基础的方法，通过以下步骤实现的：
[0006] -、茵陈蒿汤体内成分峰面积建立：
[0007] (1)供试品的制备：称取18g茵陈蒿加水1400mL煮沸，保持沸腾煎煮至700mL，力口 入9g桅子和6g大黄，再保持沸腾煎煮10min，煎煮液纱布过滤，滤液浓缩至茵陈蒿浓度为 lg/mL，制成冻干粉备用；
[0008] (2)体内分析样品的制备：将步骤（1)制备的冻干粉加水配成浓度为0. 65g/mL的 溶液，以lmL/100g的剂量灌胃给予Wistar雄性大鼠，采用肝门静脉采血法在给药15min后 取血，采用固相萃取法纯化后得体内分析样品；
[0009] (3)通过分析各色谱峰的UV、MS、MS/MS数据，鉴定出茵陈蒿汤大鼠血中移行成份 21个，测出21个成分的峰面积x i;j。
[0010] 二、基于CCL4肝损伤模型的茵陈蒿汤代谢组学生物标记物建立：
[0011] (1)样品采集与制备：取大鼠分三组，分别为空白组、模型组和给药组，其中模型 组口服体积百分含量为20%的CCL 4油溶液，剂量为lmL/kg，给药组口服给予茵陈蒿汤，茵 陈蒿汤剂量为lmL溶液/100g大鼠体重，空白组给予同体积生理盐水，各组每日灌胃给药1 次，连续8d，用代谢笼收集12h尿液，尿液收集过程中置于冰中保存，并且各组均肝门静脉 米血制备血液样品保存；
[0012] (2)样品分析：将尿液和血液样品均于4°C、8000rpm?12000rpm条件下离心 5min ?lOmin，取上清液，供 UPLC-Q-T0F/MS 分析；
[0013] 其中，高效液相色谱条件为：
[0014] 色谱柱填料 ACQUITY UPLC? BEH C18，规格为 50mmX 2. 1mm，1. 7 μ m ;柱温为 35°C ; 流动相为B相0. 1 %甲酸乙腈和A相质量百分含量为0. 1 %甲酸溶液，流速为0. 40mL/min? 0· 60mL/min，检测波长 245nm，进样量 2. 0 μ L ;
[0015] 其中，质谱条件为：
[0016] 尿液样品：电喷雾离子源，采用正离子及Tof/MS模式检测；扫描参数：脱溶剂气流 量为500L/h?600L/h，温度为300°C，锥孔气流量为50L/h，离子源温度为110°C，毛细管电 压为2. 5KV，锥孔电压为35V，萃取电压为3. 0V，微通道板电压为1600V ;每0. Is采集一次； 采用亮氨酸-脑啡肽溶液为锁定质量溶液，质量扫描范围为m/zlOO?1000 ;
[0017] 血液样品：脱溶剂气流量为450L/h?650L/h，其余参数与尿液样品参数相同；
[0018] (3)CCL4诱导大鼠肝损伤模型生物标记物的确定：将各组生化指标的数值用 SPSS17. 0分析，确定相应数据组的生物标记物，在尿液代谢组中确定20个具有显著贡献 率的生物标记物，在血液代谢组中确定12个具有显著贡献率的生物标记物；其中尿液代谢 组中 20 个生物标记物为 C1QH2208、C14H180 5、C14H18N204、C 9H7N02、C16H31N0 2、C16H1205、C12H 16N203、 Ci2Hi8N2〇3> c16h31no5> c12h20n4o5> c24h34o2> c26h43no6> c10h7no3> c24h34o2> c24h36o3> c6h7n5o> c5h9no3> C24H3202、CnH2QN 203 和 C15H2203 ;血液代谢组中 12 个生物标记物为 C3H5N03、C16H18N 303、C8H1006、 〇2〇Η 36Ν602、c10h8o、c 26h37no3、c24h34o 2、c33h49no4、c8h 4o3、c12h13no2、c 24h36o3 和 c22h4(io4 ;
[0019] 三、PCMS研究方法的建立：
[0020] (1)血清中外源性中药化学成分信息数据的标准化：
[0021] 设有i个评价对象，j个评价指标，通过下述公式得到峰面积标准化yi;j，
[0022] yhJ = {x1J-xJ)lb],
[0023] 其中I为指标j的平均值，δ ^为指标j的标准差，为步骤一得到的茵陈蒿汤 大鼠血中移行成份的21个峰面积。
[0024] (2)代谢生物标记物的相对强度的数据标准化：
[0025] 设对于步骤-中的生物标记物指标k，给药组治疗如后指标值分别为Xn， k、Xm，k，讲 这两个治疗前后代谢物指标值进行标准化计算：
[0026] Δκ=[( Xm,,-Xn.,)-X]/5,
[0027] 其中Λκ为步骤二中的生物标记物标准化处理之后数据；为步骤二中的生物标 记物k治疗后的相对强度；Χ ηΛ为步骤二中的生物标记物k治疗前的相对强度；X为步骤二 中的生物标记物k的平均值；δ k为指标k的标准差。
[0028] (3)变量相关分析：
【权利要求】
1. 一种筛选茵陈蒿汤药效物质基础的方法，其特征在于它包括以下步骤： 一、 茵陈蒿汤体内成分峰面积建立： (1) 供试品的制备：称取18g茵陈蒿加水1400mL煮沸，保持沸腾煎煮至700mL，加入9g 桅子和6g大黄，再保持沸腾煎煮lOmin，煎煮液纱布过滤，滤液浓缩至茵陈蒿浓度为lg/mL， 制成冻干粉备用； (2) 体内分析样品的制备：将步骤（1)制备的冻干粉加水配成浓度为0. 65g/mL的溶 液，以lmL/100g的剂量灌胃给予Wistar雄性大鼠，采用肝门静脉采血法在给药15min后取 血，采用固相萃取法纯化后得体内分析样品； (3) 通过分析各色谱峰的UV、MS、MS/MS数据，鉴定出茵陈蒿汤大鼠血中移行成份21个， 测出21个成分的峰面积Xiij。 二、 基于CCL4肝损伤模型的茵陈蒿汤代谢组学生物标记物建立： (1) 样品采集与制备：取大鼠分三组，分别为空白组、模型组和给药组，其中模型组口 服体积百分含量为20 %的CCL4油溶液，剂量为lmL/kg，给药组口服给予茵陈蒿汤，茵陈蒿 汤剂量为lmL溶液/100g大鼠体重，空白组给予同体积生理盐水，各组每日灌胃给药1次， 连续8d，用代谢笼收集12h尿液，尿液收集过程中置于冰中保存，并且各组均肝门静脉采血 制备血液样品保存； (2) 样品分析：将尿液和血液样品均于4°C、8000rpm?12000rpm条件下离心5min? lOmin，取上清液，供UPLC-Q-TOF/MS分析； 其中，高效液相色谱条件为： 色谱柱填料 ACQUITY UPLC? BEH C18，规格为 50mmX2. 1mm，1. 7 μ m ;柱温为 35°C ;流 动相为B相0. 1%甲酸乙腈和A相质量百分含量为0. 1%甲酸溶液，流速为0. 40mL/min? 0· 60mL/min，检测波长 245nm，进样量 2. 0 μ L ; 其中，质谱条件为： 尿液样品：电喷雾离子源，采用正离子及Tof/MS模式检测；扫描参数：脱溶剂气流量为 500L/h?600L/h，温度为300°C，锥孔气流量为50L/h，离子源温度为110°C，毛细管电压为 2. 5KV，锥孔电压为35V，萃取电压为3. 0V，微通道板电压为1600V ;每0. Is采集一次；采用 亮氨酸-脑啡肽溶液为锁定质量溶液，质量扫描范围为m/zlOO?1000 ; 血液样品：脱溶剂气流量为450L/h?650L/h，其余参数与尿液样品参数相同； (3) CCL4诱导大鼠肝损伤模型生物标记物的确定：将各组生化指标的数值用SPSS17.0 分析，确定相应数据组的生物标记物，在尿液代谢组中确定20个具有显著贡献率的生物标 记物，在血液代谢组中确定12个具有显著贡献率的生物标记物；其中尿液代谢组中20个 生物标记物为 C1QH2208、C14H180 5、C14H18N204、C 9H7N02、C16H31N0 2、C16H1205、C12H 16N203、C12H18N 203、 Ci6H3iN〇5> c12h20n4o5> c24h34o2> c26h43no6> c10h7no3> c24h34o2> c24h36o3> c6h7n5o> c5h9no3> c24h32o2> CnH2QN203 和 C15H2203 ;血液代谢组中 12 个生物标记物为 C3H5N03、C16H18N 303、C8H1q06、C 2QH36N602、 c10h8o、c26h37no3、c 24h34o2、c33h49no 4、c8h4o3、c12h 13no2、c24h36o3 和 c22h4(io4 ; 三、 PCMS研究方法的建立： (1)血清中外源性中药化学成分信息数据的标准化： 设有i个评价对象，j个评价指标，通过下述公式得到峰面积标准化yu， >ν = (?;)/δ， 其中I为指标j的平均值，h为指标j的标准差，Xu为步骤一得到的茵陈蒿汤大鼠 血中移行成份的21个峰面积。 (2) 代谢生物标记物的相对强度的数据标准化： 设对于步骤二中的生物标记物指标k，给药组治疗前后指标值分别为Xn，k、Xm， k，讲这两 个治疗前后代谢物指标值进行标准化计算： Δκ = [( Xm>-Xn.,)-X]/5t 其中Λ κ为步骤二中的生物标记物标准化处理之后数据；X% k为步骤二中的生物标记物 k治疗后的相对强度；Xn，k为步骤二中的生物标记物k治疗前的相对强度；X为步骤二中的 生物标记物k的平均值；δ k为指标k的标准差。 (3) 变量相关分析：
通过上述公式得出变量R，R?表示成分η在m指标上的相关系数，其中R表示变量关联 矩阵，r表示相关系数；
通过R确定药效相关成分对药效指标的作用，其中0.5 < |r| <1表示显著相关，从而 筛选出中药药效物质基础。
2. 根据权利要求1所述的一种筛选茵陈蒿汤药效物质基础的方法，其特征在于步骤二 中所述的将尿液和血液样品均于4°C、lOOOOrpm条件下离心5min。
3. 根据权利要求1所述的一种筛选茵陈蒿汤药效物质基础的方法，其特征在于步骤二 中所述的高效液相色谱条件为：流动相为B相0. 1 %甲酸乙腈和A相质量百分含量为0. 1% 甲酸溶液，流速为〇. 50mL/min。
4. 根据权利要求1所述的一种筛选茵陈蒿汤药效物质基础的方法，其特征在于步骤二 中所述的尿液样品：电喷雾离子源，采用正离子及Tof/MS模式检测；扫描参数：脱溶剂气流 量为 600L/h。
5. 根据权利要求1所述的一种筛选茵陈蒿汤药效物质基础的方法，其特征在于步骤二 中所述的血液样品：脱溶剂气流量为500L/h。
【文档编号】G01N30/88GK104101674SQ201410208639
【公开日】2014年10月15日 申请日期:2014年5月16日 优先权日:2014年5月16日
【发明者】王喜军, 张爱华 申请人:王喜军