与癌症相关的新抗原的制作方法

与癌症相关的新抗原的制作方法
【专利摘要】本发明提供了可用于治疗和诊断癌症的新的与癌症相关的抗原。本发明进一步提供了该新抗原结合蛋白质，和免疫偶联物的氨基酸和核酸序列。本发明还涉及诊断和治疗的方法以及试剂盒。
【专利说明】与癌症相关的新抗原
[0001]本申请是申请日为2006年12月21日、发明名称为“与癌症相关的新抗原”的中国专利申请号200680053091.9的分案申请。

【技术领域】
[0002]本发明涉及与癌症相关的新抗原以及用于治疗和检测癌症的方法和组合物。

【背景技术】
[0003]在2000年，全世界大约有2200万人患癌症，并有620万人死于这类疾病。每年有超过1000万的新病例，且这一估计值将在未来15年内增加50% (WHO,世界癌症报告(World Cancer Report)Bernard ff.Stewart and Paul Kleihues, eds.1ARCPress, Lyon, 2003)。目前的癌症治疗局限于侵入式手术治疗、放射治疗和化学治疗，所有的这些方法或是会带来潜在的严重副作用，非特异性毒性和/或对身体意象和/或生活质量带来损伤性改变。癌症可对化学疗法产生抗性，这减少了进一步的选择和成功治愈的可能性。一些癌症的预后比起其他的而言更糟，而一些癌症几乎是致命的。此外，一些有相对高治愈率的癌症，由于它们的高发病率而成为主要的杀伤疾病。
[0004]导致目前癌症治疗中的不充分的原因之一是这些治疗缺少对受侵袭组织和细胞的选择性。外科切除术一般均会切除那些看起来正常的组织以作为“安全边缘”，而这可增加发病率和并发症的危险。并且，这也可能除去一些可能散布在肿瘤细胞中的健康组织，这些组织可能能够维持或恢复受侵袭器官或组织的功能。由于放射和化学疗法的非特异性作用模式，因而将杀死或损伤许多正常细胞。这可导致严重的副作用，例如严重的恶心、体重减轻和精力减退、脱发等，并且会增加在以后出现第二种癌症的危险。对癌细胞具有更高选择性的治疗将不对正常细胞造成损害，从而将改善治疗结果、副作用和生活质量。
[0005]对癌症治疗的选择性可通过靶向作用对癌细胞有特异性但未在正常细胞中发现的分子而得到改善。然后，这些分子可用作基于抗体的诊断或治疗的靶点，或作为能改变它们功能的药物。
[0006]关于野生型Scratch蛋白质知道的很少，其是在对所得的假设蛋白质序列的概念性翻译和分析的基础上获得的。已发现哺乳动物的Scratch (Mammalian Scratch) (Scrt)mRNA的表达局限于大脑，脊髓和重新分化的有丝分裂期后的神经元中，这意味着其在神经元分化中可能扮演的角色。人的哺乳动物的Scratch基因已被定位到q24.3 (染色体8)上(Nakakura 等人，2001a, PNAS vol98p4010-4015 和 Nakakura 等人，2001.Mol.Brain.Res.Vol95pl62-166)。
[0007] 哺乳动物的Scratch与其他锌指蛋白共享SNAG区域，如SNAI1，SNAI2, SNAI3, GFII和 GFIIB。尽管少数研究 SNAG 域(Batlle E 等人，2000.Nat.Cell B1l1Vol.2:84-89 ；Kataoka H 等人，2000.Nucleic Acids Res.Vol.28:626-633 ；Grimes HL 等人，1996.Mol.Cell.B1l.Vol.16:6263-6272 ；Hemavathy K 等人，2000.Mol.Cell.B1l.Vol:20:5087-5095)和蜗牛运动功能的实验室已发现了 Scrt基因的过度表达，但蛋白质本身的存在到目前为止还未显示出来。根据假设的蛋白质序列，Scratch蛋白质应当有5个锌指蛋白区和SNAG区对转录抑制中的功能负责。该序列表明所得蛋白质是核内蛋白质，且事实上已发现重组哺乳动物的Scratch的表达局限于转染细胞的核中(Nakakura等人，2001a, PNAS vol98p4010-4015)。


【发明内容】

[0008]本
【发明者】们已确认出与癌症相关的新的蛋白质。因此，本发明提供了可用于治疗和诊断癌症的新的与癌症相关的抗原。特别的，该抗原与恶性胶质瘤、黑素瘤、乳癌、肺癌、卵巢癌、淋巴瘤、胃癌和/或前列腺癌相关。
[0009]该新抗原是哺乳动物的Scratch的一种变异体。该变异体具有不存在于野生型Scratch的跨膜区，因此本发明的蛋白质可在细胞表面上探测到。因此，本发明包括一种分离的蛋白质，其包含一种在癌细胞表面表达的与癌症相关的哺乳动物的Scratch的变异体。在本发明的一种实施方式中，该与癌症相关的哺乳动物的Scratch的变异体包含由SEQID NO:1定义的氨基酸序列或其变异体，或由SEQ ID NO: 2定义的氨基酸序列或其变异体。
[0010]本发明的另一方面是分离的蛋白质，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或其变异体或SEQ ID NO:2的氨基酸序列或其变异体。
[0011 ] 本发明也包括编码本发明所述的分离的蛋白质的分离的核酸序列、包含本发明的核酸序列的重组表达载体和包含本发明的重组表达载体的宿主细胞。
[0012]在本发明的另一方面，本发明包括一种检测或监控患有或疑似患有癌症的研究对象的癌症的方法，其包括在样品中的细胞上检测本发明分离的蛋白质，其中当在细胞上检测出分离的蛋白质时 ，表明存在癌症。
[0013]此外，本发明还包括检测或监控患有或疑似患有癌症的研究对象的癌症的方法，其包括在样品中的细胞中检测与癌症相关的哺乳动物的Scratch的变异体的表达，其中当在细胞中检测出与癌症相关的哺乳动物的Scratch的变异体的表达时，表明存在癌症。
[0014]本发明的进一方面是一种通过调节癌细胞中哺乳动物的Scratch的功能或表达来治疗或预防研究对象中癌症的方法。
[0015]本发明还包括药物组合物，其含有有效量的本发明的分离的蛋白质、本发明的分离的核酸序列和/或本发明的重组表达载体。
[0016]本发明的进一方面是本发明的分离的蛋白质、本发明的分离的核酸序列和/或本发明的重组表达载体在引起研究对象免疫应答中的应用。
[0017]本发明的另一方面是本发明的分离的蛋白质、本发明的分离的核酸序列和/或本发明的重组表达载体在治疗或预防癌症中的应用。
[0018]此外，本发明包括在研究对象中治疗或预防癌症的方法，其包括向研究对象或来自研究对象的细胞施用有效量的本发明的分离的蛋白质、本发明的分离的核酸序列和/或本发明的重组表达载体。
[0019]本发明还包括在研究对象中弓丨起对本发明的分离的蛋白质的免疫应答的方法，其包括向研究对象或来自研究对象的细胞施用有效量的本发明的分离的蛋白质、本发明的分离的核酸序列和/或本发明的重组表达载体。
[0020]本发明的另一方面是一种检测或监控研究对象中癌症的方法，其包括以下步骤:
[0021](I)将取自所述研究对象的测试样品与特异性结合到癌细胞抗原的结合蛋白接触，以产生结合蛋白-抗原复合物；
[0022](2)测量测试样品中结合蛋白-抗原复合物的量；以及
[0023](3)比较测试样品和对照中结合蛋白-抗原复合物的量。
[0024]从下面详细的描述中可以看出本发明的其它特性以及优点。然而，应当理解的是，由于本领域技术人员将能够根据这里的详细描述在本发明精神和范围内做出各种变化和改变，因此本发明给出的详细描述和具体实施例仅是出于示例的目的。

【专利附图】

【附图说明】
[0025]现对本发明相关的附图进行描述，其中
[0026]图1示出了 VB3-011结合到本发明蛋白质上涉及的聚糖聚糖结构。硫酸软骨素A，也称作软骨素-4-硫酸盐(由于在4位存在硫酸盐分子)，是一种重复D-半乳糖胺和葡糖醛酸(A)的线性分子。当两个这样的CSA分子通过2-6 α键交叉相连时，则聚糖单元就代表了一个可由血凝素(HA)⑶识别的聚糖单元。
[0027]图2是表示HA试剂固定的示意图。在第一阶段，HA的特异性通过阻断抗-HA/蛋白质-G-琼脂糖表位增强。在第二阶段，用蛋白质-G-琼脂糖对其进行固定，同时阻滞任何由抗-1gG偶合步骤产生的非特异性。在第三阶段，与乙醇胺反应，确保离开HA表位，所有其他的活性胺基团均被阻滞，从而提升对HA的特异性。
[0028]图3示出了通过VB3-011检测到的本发明蛋白质的凝集素基纯化的结果。Con-A和WGA外源凝集素下拉非特异性蛋白质，而HA仅下拉一种存在于阳性细胞系而在阴性细胞系中缺少的蛋白质(图3Α)。当用HA纯化后，U87MG、U118MG和Α375显示出单带，而Panc-1和Daudi未显示出可探测的带(图3B)。
[0029]图4示出了由于室温下降解导致的聚糖的消失。在进行SDS-PAGE分离前，当放置于室温下I小时会在含有HA试剂的IP上观察到50kDa的带，导致聚糖残基的降解从而在36kDa位置上显示出缺少抗原的聚糖部分的蛋白质带。
[0030]图5示出了在纯化的抗原复合物中在36kDa分子量(Mw - 36kDa)和等电点(pi)是9.7处出现的一个单一蛋白质点。这代表了在VB3-011抗原纯化中获得的2D-PAGE的蛋白质印迹(Western blotting)图。从凝胶获得相应的点被用作ID目的。
[0031]图6和SEQ ID NO: 3示出了获得的多肽的完全定位以及野生型哺乳动物的Scratch分子(登录号#gi 113775236)的序列覆盖。
[0032]图7和SEQ ID NO:4示出了由MDA-MB-435S获得的gi 115928387的序列覆盖和用于435S-衍生的序列和Scrt的BLAST序列比对。MDA-MD-435S表现出Scratch的截断版本即17.823kDa蛋白质gi 115928387的存在，其与野牛型的哺乳动物的Scratch分子的序列185-366具有100%的同源性。
[0033] 图8示出了由A-375细胞系获得的肽的TOF-MS扫描谱图，用以检测样品中所有肽离子的存在。在1200-1400V下对静电纳米喷雾下进行100次100_1200amu范围的扫描获得了大量的肽回收，随后对之进行分析获得蛋白质ID为哺乳动物的Scratch。图8A示出了所有多电荷肽离子的TOF-MS扫描谱图，图SB示出了单电荷肽离子的退卷积(反褶积)谱图。
[0034]图9示出了由U87MG细胞系获得的肽的TOF-MS扫描谱图，用以检测样品中所有肽离子的存在。在1200-1400V下在静电纳米喷雾下进行300次100_1200amu范围的扫描获得了大量的肽的回收，随后对之进行分析获得蛋白质ID为哺乳动物的Scratch。图9A示出了所有多电荷肽离子的TOF-MS扫描谱图，图9B示出了单电荷肽离子的退卷积(反褶积)谱图。
[0035]图1O示出了由U118MG细胞系获得的肽的TOF-MS扫描谱图，用以检测样品中所有肽离子的存在。在1200-1400V下在静电纳米喷雾下进行27次100_1200amu范围扫描，获得了大量的肽的回收，随后对之进行分析获得蛋白质ID为哺乳动物的Scratch。图1OA示出了所有多电荷肽离子的TOF-MS扫描谱图和图1OB示出了单电荷肽离子的退卷积(反褶积)谱图。
[0036]图11和SEQ ID NO:1示出了在表2中所列的质谱分析中回收的肽的序列覆盖，从凝胶内经胰蛋白酶消化回收了共18个肽，获得了 67%的蛋白质覆盖。划下划线的序列代表回收的肽序列。突出标记的肽包括新的序列。具体地，以粗体表示的序列为新的序列，而以斜体表示的序列代表了与哺乳动物的Scratch的完全匹配。
[0037]图12基于Mowse得分的概率，离子得分_10*Log (P)，其中P是在随机事件中观察到的配对概率。得分大于77的蛋白质是显著的(P〈0.05)。示出了从VB3-011Ag回收的肽的肽质谱指纹区的结果。蛋白质得分大于77时被认为是显著的。观察到的唯一显著的蛋白质ID指向了一种抗原，即已知的具有得分为149的哺乳动物的Scratch。
[0038]图13示出了识别出的抗原哺乳动物的Scratch具有重大的得分149。由于数据库服务器本身的性质和相似性/同源性连接的蛋白质，该蛋白质的所有异型均算作记击中数。MS/MS断裂和肽的同源性证实了该抗原是哺乳动物的Scratch。
[0039]图14示出了作为三电荷的分子(802.00000, 3+)出现的中性肽Mr.2402.978172的MS/MS离子断裂。这种肽序列与Scratch的肽完全匹配。中性肽2Mr的单一同位素质量(计算):2400.1206 ;离子分数:53 ;预期值:0.89 ;匹配(粗红线):使用134个最强峰的72/287片段离子。
[0040]图15示出了作为两电荷的分子(1068.500000, 3+)出现的中性肽Mr.2134.985448的MS/MS离子断裂。回收的肽的边侧区与Scratch的肽完全匹配；然而，序列的其余部分在序列信息中显示出不超过40%的同源性。中性肽2Mr的单一同位素质量(计算):2134.9614 ;离子分数:90 ;预期值:0.0016 ;匹配(粗红线):使用36个最强峰的32/220片段离子。
[0041 ] 图16示出了对成神经细胞瘤组织(A-C)和黑素瘤组织(D-F)的VB3-011免疫组织化学染色的代表性图片。组织截面分别为:(A)早期的成神经细胞瘤(I，II，III期非-N-myc扩增的)，3+ ; (B)非-N-myc扩增的IV期成神经细胞瘤，2+ ； (C) N-myc扩增的IV期成神经细胞瘤，3+。(D)早期的黑素瘤(1-1II期)，3+; (E) IV期黑素瘤，3+; (F)转移性的疾病，3+。所有的图片均以400倍放大显示。
[0042]图17和SEQ ID N0S:5和3示出了 Scratch-1的限制定位。
[0043]图18示出了在用抗原-阳性细胞MB-435S(空心圆圈)和抗原-阴性细胞Panc-1 (黑色圆圈)的进行的VB6-011的MTS分析中，VB6-011的体外细胞毒性。以每孔1000个细胞接种的细胞,与Fab-de-bouganin纯化的蛋白质温育。温育(培养)5天后,测量细胞生存力和确定出IC5Q。

【具体实施方式】
[0044](A) ^JL
[0045]术语“细胞”包括一单一的细胞和复数个细胞或细胞全体。向细胞施用试剂(例如与癌症相关的蛋白质)包括活体外和活体内施用。
[0046]这里使用的术语“全身给药”是指免疫偶联物和/或其他的癌症治疗剂可以方便的形式如注射(皮下、静脉内、肌肉等)、口服施用、吸入、经过皮肤施用或局部涂敷(例如局部的霜剂或药膏等)、栓剂涂敷或以植入的方式而被全身地给药。植入物可以是多孔的、无孔的或凝胶材料，包括膜，例如硅橡胶膜或纤维。栓剂通常含有重量含量在0.5% -10%范围内的活性成分。
[0047]术语“氨基酸”包括所有的天然氨基酸和改性的氨基酸。
[0048]这里使用的术语“抗体”意在包括单克隆抗体、多克隆抗体和嵌合抗体。抗体可来自重组源和/或在转基因动物体内产生。这里使用的术语“抗体片段”意在包括Fab、Fab’、F(ab’)2、scFv、dsFv、ds-scFv、二聚体、微抗体(minibody)、双价抗体(diabody)和它们的多聚体以及双特异性的抗体片段。抗体可采用传统技术被片段化。例如，？(&13’)2片段可通过用胃蛋白酶处理抗体而产生。可对所得的F(ab’)2片段进行处理还原二硫键，从而产生Fab’片段。木瓜蛋白酶消化可形成Fab片段。Fab、Fab’和F(ab’)2、scFv、dsFv、ds_scFv、二聚体、微型抗体、双链抗体片段和其他片段也可通过重组技术合成。
[0049]“至少在中等严格杂交条件下”是指所选择的条件促进了溶液中两个互补核酸分子之间的选择性杂交。杂交可发生在全部或部分的核酸序列分子上。杂交部分通常具有至少15(例如20，25，30，40或50)个核苷酸的长度。本领域技术人员将认识到核酸双链或杂种的稳定性是由Tm决定，而在含钠的缓冲液中，Tm是钠离子浓度和温度的函数(Tm =81.5。。- 16.6 (LoglO [Na+])+0.41(% (G+C) - 600/1)，或类似的等式)。因此，决定杂种的稳定性的清洗条件下的参数为钠离子浓度和温度。为了确认与已知合适分子相似但不相同的分子，可假设I %的错配导致Tm降低约1°C，例如如果寻求的核酸分子具有>95%的相同性，则最终的清洗温度将降低约5°C。基于这些考虑，本领域技术人员将能够容易地选择适当的杂交条件。在优选的实施方式中，选择的是严格的杂交条件。例如，可采用以下条件来获得严格杂交:在5倍氯化钠/柠檬酸钠(SSC)/5x DenhardtJ s溶液/1.0% SDS下根据上述等式在Tm-5°C下进行杂交，然后用0.2x SSC/0.1% SDS在60°C下清洗。中等严格的杂交条件包括在3x SSC中42°C下的洗涤步骤。然而，应当理解的是使用其他可替代的缓冲液、盐和温度也可获得等同的严格性。关于杂交条件的其他的指南可在以下文献中找到:当代分子生物学指导(Current Protocols in Molecular B1logy), John ffiley&Sons, N.Y.，2002,以及 Sambrook 等.，分子克隆:实验指南(Molecular Cloning:a LaboratoryManual), Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001.
[0050]这里使用的术语“结合蛋白质”是指特异性结合到另一种物质如本发明的与癌症相关的抗原上的蛋白质。在一种实施方式中，结合蛋白质是抗体或抗体片段。
[0051]“适用于活体内施用的生物相容形式”是指施用物质的形式产生的治疗效果超过任何的毒性效果。
[0052]这里使用的术语“与癌症相关的哺乳动物的Scratch的变异体”、“本发明的与癌症相关的抗原”、“本发明的与肿瘤相关的抗原”或“本发明的分离的蛋白质”是指在癌症细胞表面表达的哺乳动物的Scratch的一种新变异体，或者是这种新变异体的也表达于癌症细胞表面的变异体。在一种实施方式中，该新的与癌症相关的抗原具有至少一个跨膜区。在具体的实施方式中，该与癌症相关的哺乳动物的Scratch的抗原是包含SEQ ID NO:1限定的氨基酸序列的分离的蛋白质或包含了 SEQ ID N0:2限定的氨基酸序列的分离的蛋白质。
[0053]术语“癌细胞”包括癌症或肿瘤形成的细胞、转化的细胞或易变为癌症或肿瘤形成细胞的细胞。
[0054]这里使用的“保守的氨基酸取代”是其中的一个氨基酸残基被其他氨基酸残基代替但不会失去蛋白质期望的性能的氨基酸取代。
[0055]这里使用的术语“对照”是指从已知患有癌症或未患有癌症的研究对象或一组研究对象中获取的样品。
[0056]术语“可控制释放系统”用于指免疫偶联物和/或本发明的其他的癌症治疗剂可以可控的形式进行施用。例如，微动泵可将控制的计量直接输送至肿瘤区域，从而精细地调节着药物组合物施用的时间和浓度(参见如Goodson, 1984, in Medical Applicat1ns ofControlled Release, vol.2, pp.115-138)。
[0057]术语“肽的衍生物”是指具有一个或多个通过官能侧基的反应而化学衍生的残基的肽。这类衍生的分子包括如那些自由氨基经衍生形成了胺盐酸盐、对甲苯磺酰基、苄氧羰基、叔丁基氧羰基、氯乙酰基或甲酰基的分子。自由的羧基可经衍生形成盐、甲基和乙基酯或其他类型的酯或酰肼。自由羟基可经衍生形成O-酰基或O-烷基衍生物。组氨酸的咪唑氮可经衍生形成N-1m-苄基组氨酸。衍生物还包括那些含有20种标准氨基酸中的一个或多个天然氨基酸衍生物的肽。例如:4_羟基脯氨酸可取代脯氨酸；5_羟基赖氨酸可取代赖氨酸；3-甲基组氨酸可取代组氨酸；高丝氨酸可取代丝氨酸；以及鸟氨酸可取代赖氨酸。
[0058]表达“检测或监控癌症”是指确定研究对象是否患有癌症、癌症的范围、癌症的严重程度和/或癌症的等级的方法或过程。
[0059]这里使用的术语“直接施用”是指癌症治疗剂可不加限制地在肿瘤内、脉管内和肿瘤周围进行施用。例如，癌症治疗剂的施用可以是通过一次或多次直接注射至肿瘤内、连续或不连续输入肿瘤内、引入癌症治疗剂的储液器、向肿瘤内引入慢速释放装置、向肿瘤内引入慢速释放制剂和/或在肿瘤上直接涂敷进行。施用“至肿瘤内”的模式包括将癌症治疗剂引入至肿瘤区域，或至在很大程度上直接流入肿瘤区域内的血管或淋巴管内。
[0060]这里的表达“有效量”是指在剂量上和在一段时间内获得期望效果所需要的的有效剂量。治疗剂的有效量可根据如动物的疾病阶段、年龄、性别、体重这些因素而改变。给药方案可经调整而提供最佳的治疗应答。例如，可每日分开多次施用剂量或可根据治疗情况中出现的紧急情况而按比例地减少剂量。
[0061] 这里使用的术语“诱发免疫应答”或“导致免疫应答”是指引起、触发、导致、增强、改善或增加免疫系统的任何应答，这种应答例如可以是体液或细胞介导性质。可使用本领域技术人员已知的测定方法来评定免疫应答的诱发或增强，这些方法包括但不限于:抗体检测(例如ELISA检测)、抗原特异性细胞毒性检测和细胞因子的产生(例如ELISP0T检测)。优选地，本发明的分离的蛋白质、核酸序列或重组的表达载体，以及本发明的方法触发或增强了细胞的免疫应答，更优选的是T细胞的应答。
[0062]这里使用的术语“VB3-011抗体”是指具有在W097/044461中揭露的抗体的可变区的抗体，其显示出对各种癌细胞的特异性结合但不会与正常组织或细胞发生显著结合。
[0063]这里使用的术语“分离的核酸序列”是指当由重组DNA技术产生时基本上不含细胞物质或培养基的核酸，或指当通过化学合成时基本上不含化学前体或其他化学物的核酸。并且，分离的核酸也是基本上不含有天然位于衍生该核酸的核酸两侧的序列(即位于核酸5’和3’端的序列)。术语“核酸”意在包括DNA和RNA，且可以是双链的或单链的。
[0064]这里使用的术语“分离的蛋白质”是指当由重组DNA技术产生时基本上不含细胞物质或培养基的蛋白质，或指当通过化学合成时基本上不含化学前体或其他化学物的核酸。它包括本发明的新的与癌症相关的抗原。
[0065]“哺乳动物的 Scratch”(gi 113775236:gi I 46397014:gi 113129535)是由定位于人类染色体8的q24.3上的基因编码的蛋白质。通过对基于概念式转录的假定蛋白质序列的分析可知，哺乳动物的Scratch具有5个锌指区域和I个SNAG区域。它被认为是一种细胞核内的蛋白质。该假定蛋白质序列示于SEQ ID N0:3中。
[0066]这里使用的术语“核酸序列”是指由天然碱基、糖和糖间(骨架)连接构成的核苷或核苷酸单体的序列。该术语还包括由非天然单体或其部分构成的改性的或取代的序列。本发明的核酸序列可以是脱氧核糖核酸序列(DNA)或核糖核酸序列(RNA)，且可包括天然碱基腺嘌呤、鸟嘌呤、胞核嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶。该序列还可含有改性的碱基。这种改性的碱基的例子包括氮杂和脱氮腺嘌呤、鸟嘌呤、胞核嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶；以及黄嘌呤和次黄嘌呤。
[0067]这里使用的术语“样品”是指任何来自可用于癌症测定的研究对象的流体、细胞或组织样品。
[0068]这里使用的术语“序列同一性”是指两个多肽序列之间的相同序列的百分比。为了确定两个多肽序列之间的相同序列的百分比，将这两个序列的氨基酸序列进行比对，优选使用的是 Clustal W algorithm (Thompson, JD, Higgins DG, Gibson TJ, 1994, NucleicAcids Res.22(22):4673-4680)和 BL0SUM62 评分矩阵(Henikoff S.和 HenikoffJ.G.，1992，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA89:10915 - 10919)以及空位开放罚分为 10 和空位延伸罚分为0.1，这样当一个序列总长度的至少50%包含在比对中时，在两序列之间获得的为最高级的匹配。可用于比对序列的其他方法为Needleman和Wunsch的比对法(J.Mol.B1l., 1970, 48:443),该法由 Smith 和 Waterman (Adv.App1.Math., 1981, 2:482)加以改进，从而在两序列之间获得了最高级的匹配，且确定出了两序列之间的相同氨基酸的数目。现有技术中已知的其他的计算两氨基酸序列之间的同一性百分比的方法包括如那些由 Carillo 和 Lipton 描述的方法(SIAM J.Applied Math.，1988，48:1073)和在Computat1nal Molecular B1logy, Lesk, e.d.0xford University Press, New York, 1988, B1computing:1nformatics and Genomics Projects 中描述的方法。一般来说，将应用到计算机程序来进行这样的计算。可用在这里的计算机程序包括但不限于GCG(DeVereUx等人，Nucleic Acids Res., 1984, 12:387) BLASTP, BLASTN and FASTA (Altschul 等人，J.Molec.B1l.，1990:215:403)。
[0069]这里使用的术语“研究对象”是指动物界内任何的动物成员，优选为哺乳动物，更优选为人类。在一种优选的实施方式中，研究对象疑似患有癌症或患有癌症。
[0070]这里使用的表达“治疗或预防癌症”是指抑制癌细胞复制、预防细胞转变为癌症形成细胞、抑制癌症扩散(转移)、抑制肿瘤生长、减少癌细胞数目或肿瘤生长、降低癌症的恶性程度(例如分化增加)或缓解与癌症相关的症状。
[0071]这里使用的术语“变异体”包括本发明的氨基酸和核苷酸序列的变异体或化学等同物，其以与本发明的蛋白质或核酸分子基本相同的方式履行着基本相同的功能。例如，本发明的蛋白质的变异体包括但不限于保守的氨基酸取代。本发明的蛋白质的变异体还包括对本发明的蛋白质的插入或缺失。此外，变异的肽和变异的核苷酸序列包括类似物和其衍生物。本发明的与癌症相关的抗原的变异体是指在之细胞上表达而不在正常细胞上表达的蛋白质序列。
[0072](B)与癌症相关的新抗原
[0073]本发明提供了一种与癌症相关的新抗原，其在癌细胞表面表达但不在正常细胞表面有显著表达。这种新的与癌症相关的抗原是哺乳动物的Scratch的一种变异体。其具有哺乳动物的Scratch中不存在的跨膜区域。该跨膜区域的序列示于SEQ ID N0:2。与癌症相关的变异体的序列示于SEQ ID NO:1。
[0074]在一种实施方式中，本发明提供了一种分离的蛋白质，其含有由SEQ ID N0:1或其变异体定义的序列的氨基酸。在另一种实施方式中，本发明提供了一种分离的蛋白质，其含有由SEQ ID NO:2或其变异体定义的序列的氨基酸。
[0075]这种与癌症相关的新抗原是在在癌细胞表面表达的哺乳动物的Scratch。因此，本发明提供了一种分离的蛋白质，其包含一种与癌症相关的哺乳动物的Scratch的变异体，其中该与癌症相关的哺乳动物的Scratch的变异体在癌细胞表面表达。在一种实施方式中，与癌症相关的哺乳动物的Scratch的变异体包含由SEQ ID NO:1定义的氨基酸序列。在另一种实施方式中，与癌症相关的哺乳动物的Scratch的变异体包含由SEQ ID N0:2定义的氨基酸序列。
[0076]本领域技术人员将能够认识到本发明包括了氨基酸序列SEQ ID N0S:1_2的变异体，其他该变异体也是与癌症相关的抗原。变异体包括本发明揭露的序列的化学等同物。这样等同物包括在这里公开的具体蛋白质基本具有相同的方式履行着基本相同的功能。例如，等同物包括但不限于保守的氨基酸取代。
[0077]在一种实施方式中，本发明的分离的蛋白质的变异的氨基酸序列具有至少50%，优选为至少60%，更优选为至少70%，最优选为至少80%，以及进一步更优选为至少90%的与SEQ ID N0S:1或2的序列同一性。
[0078]本发明还提供了编码本发明的分离的蛋白质的分离的核酸序列。在一种实施方式中，该分离的核酸序列具有示于SEQ ID N0:6中的序列。此外，本发明还包括了编码本发明的分离蛋白质的分离核酸序列的变异体。例如，该变异体包括在至少在中等严格杂交条件下，杂交到编码本发明的分离蛋白质的核酸序列上的核苷酸序列。该变异的核酸序列编码与癌症相关的抗原蛋白质。
[0079] 本发明包括分离的蛋白质或与癌症相关的抗原以及相应的核酸序列的应用。例如，本发明的分离的蛋白质产生结合蛋白质和免疫偶联物的应用，而它们又可用作治疗或预防癌症或可用于检测或监控研究对象中的癌症。因此，本发明包括本发明的分离的蛋白质和核酸序列在治疗或预防癌症中的应用以及在生产用于治疗或预防癌症或用于诊断癌症的药物中的应用。
[0080](C)与癌症相关的新抗原的药物组合物、方法和应用
[0081]本发明提供了一种在癌细胞表面表达但在正常细胞表面没有显著表达的新的与癌症相关的抗原。因此，该新的与癌症相关的抗原可用于治疗和预防癌症的疗法中，这包括使用本发明分离的蛋白质来在活体内引起免疫应答。此外，本发明还包括癌症的诊断方法，其包括对新的与癌症相关的抗原的检测。
[0082]癌症可以是任何在其细胞表面表达本发明的与癌症相关的抗原的癌症。在本发明的一种实施方式中，癌症包括但不限于:胃癌、结肠癌、前列腺癌和子宫颈癌、子宫癌、卵巢癌、胰腺癌、肾癌、肝癌、头和颈癌、鳞状细胞癌、胃肠癌、乳癌(例如癌瘤、导管的、小叶的和乳头的)、肺癌、非霍奇金氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤、白血病(例如急性淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、急性骨髓性白血病和慢性骨髓性白血病)、脑癌、成神经细胞瘤、肉瘤、直肠癌、膀胱癌、胰腺癌、子宫内膜癌、浆细胞瘤、淋巴瘤和黑素瘤。在一种优选的实施方式中，癌症包括但不限于:成胶质细胞瘤、黑素瘤、乳癌、肺癌、卵巢癌、淋巴瘤、结肠癌、胃癌和/或前列腺癌。
[0083](i)药物组合物
[0084]本发明的一个方面是一种药物组合物，其包含有效量的本发明的分离的蛋白质与适合的稀释剂或载体的混合。本发明的另一个方面是一种药物组合物，其包含有效量的本发明的分离的核酸与适合的稀释剂或载体的混合。本发明的进一个方面是一种药物组合物，其包含有效量的本发明的重组表达载体与适合的稀释剂或载体的混合。
[0085]本发明的药物组合物例如可用于治疗或预防癌症。此外，药物组合物可用于在研究对象中引起对本发明的分离的蛋白质的免疫应答。
[0086]这里描述的组合物可由已知的制备可施用于研究对象的药学上可接受的组合物的方法制备，使得有效量的活性物质与药学上可接受的载体进行组合。适合的载体例如描述 (6: Remington's Pharmaceutical Sciences(Remington's PharmaceuticalSciences, 20thed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., USA, 2000)中。在该基础上，所述组合物包括但不限于与一种或多种药学上可接受的载体或稀释剂相关的物质的溶液，且包含在具有适合的pH和生理液体等渗透压的缓冲液中。
[0087]如果免疫试剂(例如本发明的分离的蛋白质和/或编码它的核酸序列，和/或重组表达载体)和/或组合物无论采取何种施用形式都与佐剂形成共免疫的话，则免疫原性可得到显著提高。通常，佐剂的用量是在磷酸缓冲盐水溶液中占0.05-1.0%。佐剂增强了免疫原的免疫原性，但它们自身不一定是产生免疫性的。佐剂可通过在施用部位附近局部保留免疫原产生贮藏效果，从而有利于缓慢、持续地向免疫系统的细胞释放免疫原而作用。佐剂也可将免疫系统的细胞吸引至免疫原贮藏处，并刺激这些细胞引发免疫应答。因此，本发明的实施方式进一步包含了含有佐剂的药物组合物。
[0088]多年以来佐剂已被用于改善宿主对如疫苗的免疫应答。内源性佐剂(例如脂多糖)通常是用死亡的或减毒的细菌组分作为疫苗。外源性佐剂为免疫调节剂，其通常是非共价地连接至抗原且经配制增强宿主的免疫应答。因此，已鉴定出增强肠胃外给药的抗原的免疫应答的佐剂。然而，这些佐剂中的一些是有毒的，且可导致不期望的副作用，从而使得它们不适合用于人类和许多动物。事实上，仅有氢氧化铝和磷酸铝(统称为明矾(alum))被常规地用作人和兽用疫苗中的佐剂。明矾在增强抗体对白喉和破伤风类毒素的抗体应答的效果已得到很好的建立。然而，它也有一些限制。例如，明矾对流感接种疫苗无效，且不能与其他免疫原一致地引发细胞介导的免疫应答。由明矾作为佐剂抗原引发的抗体主要是鼠中的IgGl同种型，其受到一些疫苗试剂的保护可能不是最佳的。
[0089]许多外源性佐剂可激发对免疫原的潜在免疫应答。这些包括复合到细胞膜蛋白抗原上的皂角苷(免疫激发复合物)、具有矿物油的普郎尼克类(pluixmic)聚合物、杀死的分枝杆菌和矿物油、弗氏完全佐剂(Freund’s complete adjuvant)、细胞产物如胞壁酰基二肽(MDP)和脂多糖(LPS)，以及脂质A和脂质体。
[0090]在本发明的一个方面，可用在这里描述的发明中任何一种实施方式的佐剂如下。用于肠胃外免疫的佐剂包括铝化合物(例如，氢氧化铝、磷酸铝和羟基磷酸铝)。根据标准实验方案，抗原可以与铝化合物一同发生沉淀或吸附到铝化合物上。其他的佐剂例如RIBI (ImmunoChem, Hamilton, MT)也可用于肠胃外施用。
[0091]用于粘膜免疫的佐剂包括细菌毒素(例如霍乱毒素(CT)、大肠杆菌不耐热毒素(LT)、艰难梭菌毒素A和百日咳毒素(PT)，或它们的组合、亚单元、类毒素或突变体)。例如，可使用天然霍乱毒素亚单元B (CTB)的纯化制剂。只要它们保留着佐剂活性，任何这些毒素的片段、类似物、衍生物和融合物都是适合的。优选使用的是具有减毒的突变体。适合的突变体已经描述(W095/17211 (Arg-7-Lys CT 突变体)、W096/6627 (Arg-192-Gly LT 突变体)和TO95/34323(Arg-9-Lys和Glu-129-Gly PT突变体))。可用于本发明的方法和组合物中的其他 LT 突变体包括如 Ser-63-Lys、Ala-69-Gly、Glu-11-Asp 和 Glu-112-Asp 突变体。其他的佐剂也可以用于粘膜给药(例如各种来源的细菌单磷酰脂A(MPLA)(例如大肠杆菌、明尼苏达沙门氏菌(Sal monella minnesota)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)或弗氏志贺菌(Shigella flexneri)、阜式或聚乳酸/甘醇酸(PLGA)微球。
[0092]可兼用于粘膜和肠胃外的佐剂包括聚磷腈(polyphosphazene)(例如，冊95/2415)、00吐01(313-0-况，^-二甲基氨基甲烷)-氨基甲酰)胆固醇(例如美国专利号 5，283，185 和 W096/14831)以及 QS-21 (例如 W088/9336)。
[0093]可采用任何本领域技术人员已知的传统途径，用含有本发明的分离的蛋白质、本发明的分离的核酸序列和/或本发明的重组表达载体的药物组合物对研究对象进行免疫。这可包括，例如通过粘膜(例如，眼睛的、鼻内的、口腔的、胃的、肺的、肠的、直肠的、阴道的或尿道的)表面、通过肠胃外(例如皮下的、皮内的、肌肉的、静脉内的或腹膜内的)的途径或结节内进行免疫。优选的途径取决于免疫原的选择，这对于本领域技术人员而言是显而易见的。可以是单一剂量或一定间隔内重复剂量进行施用。适合的剂量取决于本领域技术人员知晓的各种参数，例如免疫原本身(例如肽对核酸(和其更特异性的类型)、施用途径和被接种的动物的状况(例如:重量、年龄和类似条件等)。
[0094]本领域技术人员将能够理解药物组合物可配制成适合于在活体内施用的生物相容的形式而向研究对象施用。可向包括人和动物在内的活的有机体施用这些物质。本发明的药物组合物的治疗活性量的施用定义为获得期望结果所必需的在剂量下和时间内的有效量。例如，物质的治疗活性量可因各种因素而变化，例如因个体的疾病状况、年龄、性别和体重，以及本发明的重组蛋白质在个体中引发期望应答的能力。给药方案可经调整而提供最佳的治疗应答。例如，可每日分开多次施用剂量或可根据治疗中出现的紧急事件而成比例地减少剂量。
[0095]本发明的药物组合物可全身地给药。药物制剂可直接向癌症部位施用。根据给药途径，药物组合物可以包衣在材料中，以保护组合物不受失活所述组合物的酶、酸和其他天然条件的作用影响。
[0096]根据本发明的一个方面，药物组合物是通过直接施用向研究对象给药的。本发明预期了施用至少足以获得终点的量的药物组合物，且如果需要，该药物组合物还包括药学上可接受的载体。
[0097]根据另一方面，药物组合物可在活体外进行施用。例如，淋巴细胞可从患有癌症的研究对象中取出并用组合物进行活体外刺激，然后融合回研究对象中。
[0098]本发明还提供了用于降低手术后并发症危险的方法，该方法包括在治疗癌症的手术之前、手术其间或手术之后施用有效量的本发明的药物组合物。
[0099]药物组合物包括但不限于:冻干粉或水溶液的或非水溶液的经灭菌的可注射溶液或悬浮液，其可进一步含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和赋予组合物与受体的组织或血液基本相容性的溶质。可存在于这种组合物中的其他成分包括如水、表面活性剂(例如Tween)、醇、多元醇、甘油和植物油。即时注射溶液和悬浮液可由灭菌粉末、颗粒、片剂或浓缩溶液或悬浮液来制备。本发明的药物组合物的供应形式例如包括但不限于冻干粉的形式，其可用消毒过的水或盐水在向研究对象施用前进行重建。
[0100]本发明的药物组合物可含有药学上可接受的载体。适合的药学上可接受的载体包括基本上为化学惰性和无毒的组合物，它们不影响药物组合物的生物活性的有效性。适合的药物载体的例子包括但不限于:水、盐水溶液、甘油溶液、乙醇、N-(I (2, 3-二油酰氧基)丙基)N，N, N-三甲基氯化铵(DOTMA)、二油酰磷脂酰-乙醇胺(DOPE)和脂质体。这些组合物应当含有治疗有效量的化合物和适合量的载体，从而提供可向研究对象直接施用的形式。
[0101]组合物可以是药学上可接受的盐的形式，其包括但不限于那些形成了自由氨基的盐，例如那些衍生自氯化氢、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的盐，以及那些形成了自由羧基的盐，例如那些衍生自钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的盐。
[0102]在本发明的各种实施方式中，药物组合物是直接全身地进行施用或直接向肿瘤区域施用。
[0103]在所述药物组合物可用于治疗患有癌症的包括哺乳动物，优选为人的动物的方法中。被施用的药物组合物的剂量和类型将取决于各种因素，而这些因素可在人类研究对象中容易地得到监控。这些因素包括癌症的病因学和严重程度(等级和阶段)。
[0104] 使用本发明的药物组合物的临床结果可容易由相关领域内的技术人员，如医师所辨别。例如，用于测量癌症的临床标记物的标准医学测试可作为治疗有效性的有力的指示物。这些测试可包括但不限于:身体检查、性能尺度、疾病标记物、12-导联心电图(EGC)、肿瘤测量、组织切片检查、细胞检查、细胞学、肿瘤的最长直径计算、射线照相术、肿瘤的数字成像、生命体征、体重、不良事件的记录、传染性事件的评估、伴随药物治疗的评估、疼痛的评估、血液或血清化学、尿分析、CT扫描以及药物代谢动力学分析。另外，包含了本发明的药物组合物和另一种癌症治疗剂的联合疗法的协同效果可通过与接受单一疗法的病人进行比较来确定。
[0105]本发明的另一种实施方式是用于治疗或预防癌症的试剂盒，其包含有效量的本发明的药物组合物，以及使用这种药物组合物来治疗癌症的说明。
[0106]在大多数批准通过的抗癌疗法中，抗癌疗法都是与其他抗癌疗法组合使用的。因此，本发明提供了本发明的药物组合物与至少一种另外的抗癌疗法的组合使用预防或治疗癌症的方法。其他的抗癌疗法可在本发明的药物组合物施用之前、交叠、 同时和/或之后施用。当同时施用时，本发明的药物组合物和其他癌症治疗可在单一配方或分开的配方施用，如果是分开的配方，则可选择地釆用不同的施用模式。一种或多种本发明的药物组合物和一种或多种其他的癌症疗法的组合可协同地对抗肿瘤或癌症。所述其他的癌症疗法包括但不限于：放射疗法和其他的抗癌治疗剂。这些其他的抗癌治疗剂可包括但不限于：2，2’，2’’-三氯三乙基胺、6-氮杂尿苷、6-重氮-5-氧-L-正亮氨酸、6-巯基票呤、醋葡醒内酯、阿克拉霉素放射菌素（aclacinomycins actinomycin)、六甲蜜胺(altretamine)、氨苯乙哌卩定酮(aminoglutethimide)、安口丫 P定(amsacrine)、阿那曲唑(anastrozole)、安西他滨(ancitabine)、血管生成素反义寡核苷酸(angiogenin antisense oligonucleotide)、安曲霉素（anthramycin)、阿扎胞苷（azacitidine)、氮丝氨酸（azaserine)、氮丙唳（aziridine)、batimastar、bcl_2 反义寡核苷酸(bcl_2antisense oligonucleotide)、苯佐替派(benzodepa)、比卡鲁胺 (bicalutamide)、比生群（bisantrene)、博来霉素（bleomycin)、布舍瑞林（buserelin)、 白消安（busulfan)、放线菌素 C (cactinomycin)、卡普睾酮（calusterone)、卡钼 (carboplatin)、卡波昆（carboquone)、洋红霉素（carminomycin)、卡莫氟（carmofur)、 卡莫司汀（carmustine)、卡柔比星（carubicin)、嗜癌霉素（carzinophilin)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、氯地孕酮(chlormadinone acetate)、 葡糖氯乙亚硝脲(chlorozotocin)、色霉素(chromomycins)、顺钼(cisplatin)、克拉屈滨(cladribine)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、阿糖胞苷(cytarabine)、达卡巴嗪(dacarbazine)、放线菌素(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地磷酰胺 (defosfamide)、脱擬秋水仙减(demecolcine)、denopterin、地托比星(detorubicin)、 地口丫酉昆(diaziquone)、多烯紫衫醇(docetaxel)、去氧氟尿苷(doxifIuridine)、多柔比星（doxorubicin)、屈洛昔芬（droloxifene)、屈他雄酮（dromostanolone)、依达曲沙(edatrexate)、efIomithine^ 依利醋铵(elliptinium acetate)、乙啼替氟 (emitefur)、enocitabune、表柔比星(epirubicin)、环硫雄酉享(epitiostanol)、依索比星 (esorubicin)、雌莫司汀（estramustine)、依托格鲁（etoglucid)、依托泊式（etoposide)、 法倔唑（fadrozole)、芬维 A 胺（fenretinide)、氟尿苷（fIoxuridine)、氟拉达滨 (f Iudarabine)、氟尿啼唳(f Iuorouracil)、氟他胺（f Iutamide)、亚叶酸(folinic acid)、 福美斯坦（formestane)、憐雌酷（fosfestrol)、福莫司汀（fotemustine)、硝酸嫁（gallium nitrate)、吉西他滨(gemcitabine)、戈舍瑞林(goserelin)、己焼雌酷(hexestrol)、 轻基脲(hydroxyurea)、依达比星(idarubicin)、异环磷酰胺(ifosfamide)、英丙舒凡（improsulfan)、干扰素-ct (interferon-alpha)、干扰素-旦（interferon-beta)、 干扰素-Y (interferon-gamma)、白细胞间介素-2 (interleukin-2)、L-天冬酰胺酶 (L-asparaginase)、香燕多糖（Ientinan)、来曲唑（Ietrozole)、柳菩林（Ieuprolide)、洛莫司汀(1mustine)、氯尼达明(1nidamine)、甘露醇氮芥(mannomustine)、麻西罗霉素(marcel1mycin)、氮芥(mechlorethamine)、盐酸氮芥(mechlorethamine oxidehydrochloride)、安宫黄体素(medroxyprogesterone)、醋酸甲地孕酮(megestrolacetate)、甲地孕酮(melengestrol)、美法仑(melphalan)、美诺立尔(menogaril)、美雄焼(mepit1stane)、甲氨蝶呤(methotrexate)、美妥替哌(meturedepa)、米帕(miboplatin)、灭特复星(miltefosine)、二溴甘露醇(mitobronitol)、米托胍腙(mitoguazone)、二溴卫矛醇(mitolactol)、丝裂霉素(mitomycins)、米托坦(mitotane)、米托蒽醌(mitoxantrone)、莫哌达酉享(mopidamol)、霉酌.酸(my cophenol ic acid)、尼鲁米特(nilutamide)、尼莫司汀(nimustine)、nitracine、诺拉霉素(nogalamycin)、新恩比兴(novembichin)、olivomycins、奥沙利钼(oxaliplatin)、紫杉醇(paclitaxel)、喷司他丁(pentostatin)、培洛霉素(peplomycin)、培磷酰胺(perfosfamide)、phenamet、phenesterine、哌泊溴焼(pipobroman)、哌泊舒凡(piposulfan)、吡柔比星(pirarubicin)、批；曲克辛(piritrexim)、普卡霉素(plicamycin)、podophyllinicacid2-ethyl_hydrazide、聚憐酸雌二醇(polyestrad1l phosphate)、卟吩姆钠(porfimer sodium)、紫菜霉素(porfiromycin)、泼尼莫司汀(prednimustine)、甲基节月井(procabazine)、普罗帕吉曼(propagermanium)、PSK、蝶罗呤(pteropterin)、P票呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、雷莫司汀(ranimustine)、雷佐生(razoxane)、罗多比星(rodorubicin)、罗喹美克(roquinimex)、西佐糖(sizofican)、索布佐生(sobuzoxane)、锗螺胺(spirogermanium)、链黑霉素(streptonigrin)、链脲佐菌(streptozocin)、它莫西芬(tamoxifen)、泰素帝(taxotere)、替加氟(tegafur)、替莫唑胺(temozolomide)、替尼泊式(teniposide)、细交链抱菌酮酸(tenuzonic acid)、睾内酯(testolactone)、thiamiprine、硫鸟_呤(th1guanine)、塞替派(th1tepa)、雷替曲塞(Tomudex)、拓扑替康(topotecan)、托瑞米芬(toremifene)、三亚胺醌(triaziquone)、曲他胺(triethylenemeIamine)、三乙基憐铵(triethylenephosphoramide)、三乙基硫代憐铵(triethyleneth1phosphoramide)、曲洛司坦(trilostane)、三甲曲沙(trimetrexate)、曲普瑞林(triptorelin)、曲憐胺(trofosfamide)、trontecan、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、尿啼卩定氮芥(uracil mustard)、乌瑞替派(uredepa)、氨基甲酸乙酯(urethan)、长春减(vinblastine)、长春新减(vincristine)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)、阿糖胞苷(cytosine arabinoside)、吉姆单抗(gemtuzumab)、th1epa、环磷酰胺(cyclothosphamide)、抗代谢药(如甲氨蝶呤(methotrexate)、6_ 巯口票呤(6-mercaptopurine)、6 —硫代鸟票呤(6-th1guanine)、阿糖胞苷(cytarabine)、5-氟尿啼卩定(5_fIuorouraciI)、氟达拉滨(fIudarabine)、吉西他滨(gemcitabine)、氮烯咪胺(dacarbazine)、temozoamide)、六甲三聚氰胺(hexamethyImeIamine)、密妥坦(LYSODREN)、核苷类似物(nucleoside analogues)、植物生物碱(例如泰素(Taxol)、紫杉醇(paclitaxel)、喜树碱(camptothecin)、拓扑替康(topotecan)、伊立替康(irinotecan) (CAMPTOSAR，CPT-1I)、长春新减(vincristine)、长春花生物减(vincaalkyloids)例如长春碱(vinblastine))、鬼曰毒素(podophyllotoxin)、表鬼曰毒素(epipodophyIlotoxin)、VP_16 (依托泊式(etoposide))、细胞松驰素 B (cytochalasin B)、短杆菌肽 D(gramicidin D)、溴化乙锭(ethidium bromide)、依米丁(emetine)、蒽环类药物(anthracyclines)(例如柔红霉素(daunorubicin))、阿霉素脂质体(doxorubicinliposomal)、二羟基蒽化二酮(dihydroxyanthracind1ne)、光辉霉素(mithramycin)、放线菌素 D (actinomycin D)、阿地白介素(aldesleukin)、allutamine、biaomycin、卡培他滨(capecitabine)、carboplain、chlorabusin、cyclarabine、daclinomycin、floxuridhe、醋酸亮丙瑞林(lauproIide acetate)、左方定咪唑(Ievamisole)、lomusline、mercaptopurino、美司那(mesna)、mitolanc、pegaspergase、pentoslatin、picamycin、riuxlmab、坎帕斯 _1 (campath-1)、straplozocin、维 A 酸(tretinoin)、VEGF 反义寡核苷酸(VEGFantisense oligonucleotide)、长春地辛(vindesine)以及长春瑞宾(vinorelbine)。本发明还涵盖了含有一种或多种癌症治疗剂(例如FLAG，CHOP)的组合物。FLAG含有氟拉达滨(fludarabine)、阿糖胞苷(Ara-C)和G-CSF。CHOP含有环磷酰胺、长春新碱、阿霉素和泼尼松(Prednisone)。对于现有技术中已知的所有癌症治疗剂，例如可参见最近发表的TheMerck Index and the Physician's Desk Reference。
[0107]用于联合疗法的药物组合物可包括但不限于:抗生素(例如放线菌素D、博来霉素、光神霉素、安曲霉素)、门冬酰胺酶、杆状菌和Guerin，白喉毒素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、抗有丝分裂剂、相思子毒素、篦麻毒素A、绿脓杆菌外毒素、神经生长因子、血小板衍生的生长因子、组织血纤维蛋白溶酶原活化剂、抗组胺剂、抗作呕剂等。
[0108]实际上，向需要进行治疗的患者施用有效量的本发明的药物组合物可达到使另一种具有临床显著效果的癌症治疗剂剂量的降低。这种其他癌症治疗剂剂量减少的效果在没有施用本发明的药物组合物的情况下可能观察不到。因此，本发明提供了治疗肿瘤或癌症的方法，其包括施用剂量减少的一种或多种其他癌症治疗剂。
[0109]并且，对需要的患者进行的包含本发明药物组合物的联合疗法与标准治疗方案的持续时间或周期数目相比，可允许相对较短的治疗时间。因此，本发明提供了治疗肿瘤或癌症的方法，其包括在较短持续时间和/或更少的治疗周期内施用一种或多种其他癌症治疗剂。
[0110]因此，根据本发明，含有本发明的药物组合物和另一种癌症治疗剂的联合疗法可降低整体癌症治疗的毒性(即副作用)。例如，在输送减少的剂量的本发明的药物组合物和/或其他癌症治疗剂时，和/或在减少周期持续时间(即单次施用的周期或一系列的这种施用的时期)，和/或当减少周期数目时，可观察到与单一疗法或另一种联合疗法相比降低的毒性。
[0111]因此，本发明提供了一种药物组合物，其进一步含有一种或多种另外的抗癌治疗剂，其可选择的含在药学上可接受的载体中。
[0112]本发明还提供了试剂盒，该试剂盒含有有效量的本发明的药物组合物，其可选择地与一种或多种其他癌症治疗剂联合，以及如何使用其治疗癌症的说明。
[0113]如上所述，含有本发明的药物组合物的联合疗法可使其他癌症治疗剂的施用对癌症或肿瘤变得敏感。因此，本发明涵盖了用于预防、治疗和/或预防癌症复发的联合疗法，其包括在施用剂量减少的癌症治疗剂之前、之后、或同时施用有效量的本发明的药物组合物。例如，采用本发明的药物组合物的最初治疗可增加癌症或肿瘤对随后的癌症治疗剂剂量的敏感性。这样的剂量可以是与单独施用癌症治疗剂时或在不施用本发明的药物组合物时的标准剂量的下限接近，或在其之下。当同时施用时，本发明的药物组合物可与癌症治疗剂分开施用，以及可选择地通过不同的施用模式。
[0114]在一种替代的实施方式中，施用另外的癌症治疗剂可使得癌症或肿瘤对本发明的药物组合物变得敏感。在这种实施方式中，该另外的癌症治疗剂可在施用本发明的药物组合物之前给予。
[0115]在一种实施方式中，该另外的癌症治疗剂包含顺钼(cisplatin)，例如PLATIN0L或 PLATINOL-AQ^ristol Myers)，剂量范围约为 5-10、11-20、21_40 或 41_75mg/m2/ 周期。
[0116]在另一种实施方式中，该另外的癌症治疗剂包含卡钼(carboplatin)，例如PARAPLATIN(Bristol Myers)，剂量范围约为 2-3，4-8，9-16，17-35，或 36_75mg/m2/ 周期。
[0117]在又一种实施方式中，该另外的癌症治疗剂包含环磷酰胺(cyclophosphamide),例如 CYTOXAN (Bristol Myers Squibb),其剂量范围约为 0.25-0.5、0.6-0.9、1_2、3_5、6-10、11-20 或 21-40mg/kg/ 周期。
[0118]在另一种实施方式中，该另外的癌症治疗剂包含阿糖胞苷(cytarabine),例如 CYT0SAR-U(Pharmacia & Upjohn)，其剂量范围约为 0.5_1、2-4、5_10、11_25、26_50 或51-100mg/m2/周期。在又一种实施方式中，另外的癌症治疗剂包含阿糖胞苷脂质体，例如DEP0CYT(Chiron Corp.)，其剂量范围约为 5_50mg/m2/ 周期。
[0119]在又一种实施方式中，另外的癌症治疗剂包含氮烯咪胺(dacarbazine)，例如DTIC 或 DTICD0ME (Bayer Corp.)，其剂量范围约为 15_250mg/m2/ 周期或约 0.2_2mg/kg/ 周期。
[0120]在另一种实施方式中，该另外的癌症治疗剂包含拓扑替康(topotecan),例如 HYCAMTIN(SmithKline Beecham)，其剂量范围约为 0.1-0.2,0.3-0.4,0.5-0.8 或0.9-1.5mg/m2/ 周期。
[0121]在另一种实施方式中，该另外的癌症治疗剂包含伊立替康(irinotecan),例如CAMPTOSAR (Pharmacia & Up john)，其剂量范围约为 5-9、10-25 或 26_50mg/m2/ 周期。
[0122]在另一种实施方式中，该另外的癌症治疗剂包含氟拉达滨(f ludarabine)，例如FLUDARA (Berlex Laboratories)，其剂量范围约为 2.5_5、6_10、11-15 或 16_25mg/m2/周期。
[0123]在另一种实施方式中，该另外的癌症治疗剂包含阿糖胞苷(Ara-C) (cytosinearabinoside (Ara-C))，其剂量范围约为 200-2000mg/m2/ 周期、300-1000mg/m2/ 周期、400-800mg/m2/ 周期或 500-700mg/m2/ 周期。
[0124]在另一种实施方式中，该另外的癌症治疗剂包含多烯紫衫醇(docetaxel),例如TAXOTERE (Rhone Poulenc Rorer)，其剂量范围约为 6-10、11-30 或 31_60mg/m2/ 周期。
[0125]在另一种实施方式中，该另外的癌症治疗剂包含紫杉醇(paclitaxel)，例如TAXOL(Bristol Myers Squibb)，其剂量范围约为 10-20、21-40、41_70 或 71_135mg/kg/周期。
[0126] 在另一种实施方式中，该另外的癌症治疗剂包含5-氟尿B密唳(5-fIuorouraciI),其剂量范围约为0.5-5mg/kg/周期、l-4mg/kg/周期或2_3mg/kg/周期。
[0127]在另一种实施方式中，该另外的癌症治疗剂包含多柔比星(doxorubicin)，例如ADRIAMYCIN (Pharmacia & Up john)、DOXIL (Alza)、RUBEX (Bristol Myers Squibb)，其剂量范围约为 2-4、5-8、9-15、16-30 或 31_60mg/kg/ 周期。
[0128]在另一种实施方式中，该另外的癌症治疗剂包含依托泊甙(etoposide)，例如VEPESID (Pharmacia & Up john)，其剂量范围约为 3.5_7、8_15、16-25 或 26_50mg/m2/ 周期。
[0129]在另一种实施方式中，该另外的癌症治疗剂包含硫酸长春碱(vinblastine),例如VELBAN(Eli Lilly)，其剂量范围约为 0.3-0.5,0.6-0.9,1-2 或 3-3.6mg/m2/ 周期。
[0130]在另一种实施方式中，该另外的癌症治疗剂包含硫酸长春新碱(vincristine),例如 ONCOVIN (Eli Lilly)，其剂量范围约为 0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6 或 0.7mg/m2/ 周期。
[0131]在另一种实施方式中，该另外的癌症治疗剂包含甲氨蝶呤(methotrexate)，其剂量范围约为 0.2-0.9、1-5、6-10 或 ll-20mg/m2/ 周期。
[0132]在另一种实施方式中，本发明的药物组合物与至少一种其他免疫治疗剂联合施用，那些免疫治疗剂包括但不限于美罗华(rituxan)、利妥昔单抗(Rituximab)、阿仑单抗-1 (campath-1)、吉妥单抗(gemtuzumab)和曲妥珠单抗(trastuzutmab)。
[0133]在另一种实施方式中，本发明的药物组合物是与一种或多种抗血管形成剂组合施用，这些抗血管形成剂包括但不限于:血管生成抑制素、沙利度胺(Thalidomide)、kringle5、人内皮抑素(Endostatin)、Serpin (丝氨酸蛋白酶抑制剂)、抗凝血酶、纤维粘连蛋白的29kDa N-末端和40kDa C-末端蛋白质水解片段、泌乳刺激素的16kDa蛋白质水解片段、血小板因子-4的7.SkDa蛋白质水解片段、对应于血小板因子-4的13氨基酸肽(Ma1ne等人，1991，Cancer Res.51:2077-2083)、对应于胶原质I的片段的14-氨基酸肽(Tolsma等人，1993，J.Cell B1l.122:497-511)、对应于凝血栓蛋白I的片段的19-氨基酸肽(Tolsma 等人，1993，J.Cell B1l.122:497-511)、对应于 SPARC 的片段的 20-氨基酸肽(Sage等人，1995，J.Cell.B1chem.57:1329-1334)以及它们的变异体，还包括它们的药学上可接受的盐。
[0134]在另一种实施方式中，本发明的药物组合物是与放射疗法联合施用的。疗法也可包含外科手术和/或化学疗法。例如，本发明的药物组合物可与放射疗法、顺钼、氟尿嘧啶(5-FU, Adrucil)、卡钼和/或紫杉醇(Taxol)联合施用。使用本发明的药物组合物进行的治疗可允许使用更低的放射剂量和/或更少次数的放射治疗，这例如可减少严重的喉咙痛的发生，这种疼痛会阻碍吞咽功能，并可能会导致不期望的减重或脱水。
[0135]在另一种实施方式中，药物组合物是与一种或多种细胞因子组合施用的，这些细胞因子包括但不限于:淋巴因子、肿瘤坏死因子、与肿瘤坏死因子类似的细胞因子、淋巴毒素、干扰素、巨噬细胞炎性蛋白、粒单核细胞集落刺激因子、白细胞间介素(包括但不限于:白细胞间介素-1、白细胞间介素-2、白细胞间介素-6、白细胞间介素-12、白细胞间介素-15、白细胞间介素-18)以及它们的变异体，和包括它们的药学上可接受的盐。
[0136] 在又一种实施方式中，本发明的药物组合物是与癌症疫苗或生物制剂组合施用，这些癌症疫苗或生物制剂包括但不限于:自体同源的细胞或组织、非自体同源的细胞或组织、癌胚抗原、甲胎蛋白(a-fetoprotein)、人类绒毛膜性腺激素、卡介苗(BCG)活疫苗、分枝杆菌细胞壁-DNA复合物、黑素细胞系蛋白质以及突变的肿瘤特异性抗原。
[0137]在另一种实施方式中，药物组合物是与荷尔蒙疗法联合施用。荷尔蒙治疗剂包括但不限于:荷尔蒙促进剂、荷尔蒙拮抗剂(例如:氟他胺、他莫西芬、醋酸亮丙瑞林(柳培林(LUPRON))以及类固醇(例如:地塞米松、类维生素A、倍他米松、氢化可的松、可的松、强的松、去氢睾酮、糖皮质激素、盐皮质激素，雌激素、睾丸激素、孕酮)。
[0138]在另一种实施方式中，药物组合物是与基因疗法计划联合施用以治疗或预防癌症。
[0139]因此，联合疗法可增加癌症或肿瘤对施用的本发明的药物组合物和/或其他癌症治疗剂的敏感性。这样，就可能实现较短的治疗周期，从而降低毒性事件的发生。对于具体使用的癌症治疗剂而言，周期的期间可能有所不同。本发明还涵盖了连续的或不连续的施药，或将每日剂量分成数个部分进行施用。具体癌症治疗剂的适合的周期持续期间将由本领域技术人员所理解，而本发明涵盖了对各种癌症治疗剂的最优化治疗计划的持续的评估。现有技术中已提供了对本领域技术人员的具体指导。如参见Therasse等人，2000, “Newguidelines to evaluate the response to treatment in solid tumors.EuropeanOrganizat1n for Research and Treatment of Cancer, Nat1nal Cancer Institute ofthe United States, Nat1nal Cancer Institute of Canada，，，J Natl Cancer Inst.Feb2 ；92(3): 205-16。
[0140]本发明的药物组合物应当能够以任何适合的方法进行施用，例如注射、口服、吸入、经皮或肿瘤内，且任何其他的癌症治疗剂也可通过相同的或不同的施用模式向患者输送。此外，当欲向研究对象输送多种癌症治疗剂时，本发明的药物组合物和一种或多种其他的癌症治疗剂可通过一种方法给药，而其他的癌症治疗剂可通过另外的施用模式施用。
[0141]本发明还提供了试剂盒，该试剂盒含有有效量的本发明的药物组合物，其可选择地与一种或多种其他癌症治疗剂联合，以及如何使用的说明。
[0142](ii)诊断方法
[0143]由于新的与癌症相关的抗原是在癌症细胞上表达，而在正常细胞上无显著表达，因此对新的与癌症相关的抗原的检测可被用作癌症的诊断方法。
[0144]本发明的一种实施方式是检测或监控患有或疑似患有癌症的研究对象中癌症的方法，其包括在样品中的细胞中检测与癌症相关的哺乳动物的Scratch的变异体的表达，其中当在细胞中检测出与癌症相关的哺乳动物的Scratch的变异体的表达时，表明存在癌症。
[0145]在发明的一种实施方式中，提供了一种检测研究对象中癌症细胞的方法，该方法包括:
[0146](a)由该研究对象提供样品；
[0147](b)检测该样品中的与癌症相关的抗原的水平；以及
[0148](C)比较该样品中的与癌症相关的抗原的水平与对照样品中的水平，其中与对照样品相比，若与癌症相关的抗原的水平增加，则表明该研究对象患有癌症。
[0149]短语“检测与癌症相关的抗原的水平”包括检测与癌症相关的抗原的水平和检测编码该与癌症相关的抗原的核酸分子的水平。下面将更详细地讨论用于检测蛋白质和核酸的方法的例子。
[0150]与癌症相关的抗原优选的含有示于SEQ ID NO: 2中的序列，更优选地为SEQ IDNO:1中的序列。
[0151]术语“样品”可以是任何含有希望检测到的癌细胞的样品，这些样品包括但不限于:生理流体(包括血液、血清、腹水)、组织提取物、新鲜收获的细胞以及在细胞培养物中培育的细胞的溶解产物。
[0152]术语“对照样品”包括任何可用于建立基础或正常水平的样品，且可包括采自健康人群的组织样品或模拟生理流体的样品。对照样品也可以是来自研究对象的不同时间点的样品，例如在进行癌症治疗之前。
[0153]本发明的方法可用于诊断癌症的阶段。本发明还可用于监控癌症的进展以及监控特定的治疗是否有效。特别是该方法可用于证实在手术、癌症化疗、和/或放疗后肿瘤组织的不存在或去除。该方法可被进一步用于监控癌症化疗发和肿瘤的复发。
[0154]在一种实施方式中，本发明涵盖了用于监控研究对象中癌症进展的方法，包括:
[0155](a)由研究对象提供样品；
[0156](b)确定该样品中的与癌症相关的抗原的水平；
[0157](c)在稍后重复步骤(a)和(b)，并比较步骤(b)与步骤(C)的结果，其中在与癌症相关的抗原表达水平上的差异指示出在研究对象中癌症的进展。
[0158]特别是在稍后出现的升高水平的与癌症相关的抗原可指示出癌症正在发展，且治疗(如果实施了的话)并不有效。相反，在稍后出现的降低水平的与癌症相关的抗原可指示出癌症正在衰退，且治疗(如果实施了的话)是有效的。
[0159]许多技术可被用于检测细胞上哺乳动物的Scratch的与癌症相关的变异体。例如，结合蛋白，如结合到哺乳动物的Scratch的与癌症相关的变异体的抗体可用于免疫分析以检测细胞表面哺乳动物的Scratch的与癌症相关的变异体的表达。本领域技术人员将能够理解，许多技术都可用于检测和/或定量哺乳动物的Scratch的与癌症相关的变异体的细胞表面表达，这些技术包括但不限于:蛋白质印迹法法、在SDS-PAGE后进行的免疫沉淀法、免疫细胞化学法、FACS、蛋白质阵列和类似的方法等。
[0160]检测核酸分子的方法
[0161]在一种实施方式中，本发明的方法涉及对检测编码与癌症相关的抗原的核酸分子的检测。本领域技术人员可构建出用于检测样品中编码与癌症相关的抗原的核酸分子的核苷酸探针。适合的探针可基于SEQ ID N0:6或SEQ ID NO:25中所示的核酸序列制备。适合的探针包括基于编码来自癌症相关抗原区域的至少5个连续氨基酸的核酸序列的核酸分子，优选的探针包含15-30个核苷酸。核苷酸探针可用可检测的物质来标记，例如可采用提供充分信号且具有足够半衰期的放射性标记如32p、3h、14c和类似物等。其他可采用的可检测物质包括由特异性标记的抗体识别的抗原、荧光化合物、酶、对标记的抗原呈特异性的抗体以及发光化合物。可根据杂交速度和探针结合到待检测的核苷酸上的速度以及可用于杂交的核苷酸的量来选择适合的探针。标记的探针可杂交到在固体支持物上的核酸上，固体支持物例如有在 Sambrook 等人，1989，Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2nded.)中进行过一般描述的硝化纤维过滤器或尼龙膜。核酸探针可用于检测基因，优选人类细胞中的编码与癌症相关抗原的基因。核苷酸探针也可用于诊断涉及与癌症相关抗原的疾患，监控这类疾患的发展，或监控治疗。在一种实施方式中，探针被用于诊断和监控癌症的发展，优选地为妇产科癌症的发展。
[0162]探针可用于杂交技术以检测编码与癌症相关抗原的基因。该项技术一般涉及用探针在对探针特异性地退火到核酸的互补链上有利的条件下，接触和培育由研究对象或其他细胞源获得的样品中的核酸(例如重组DNA分子，克隆的基因)。培育之后，除去未退火的核酸分子，检测已杂交到探针上核酸分子的存在。
[0163]对核酸分子的检测可能会涉及用扩增的方法对特异性基因序列进行扩增，这些方法例如有聚合酶链式反应(PCR)，然后采用本领域技术人员已知的技术对扩增的分子进行分析。适合的引物可由本领域技术人员按常规进行设计。
[0164]这里描述的杂交和扩增技术可用于分析编码与癌症相关的抗原的基因的定性和定量方面。例如，RNA可从已知表达与癌症相关的抗原的基因的细胞类型和组织中分离出，并采用现有技术已知的杂交(如标准的Northern分析)或PCR技术进行测试。
[0165]引物和探针可原位用于以上描述的方法中，即直接用于从活组织检查或切除术中获得的研究对象的组织的组织切片(固定的和/或冷冻的)。
[0166]因此，本发明提供了一种检测研究对象中癌细胞的方法，包括:
[0167](a)由研究对象提供样品；
[0168](b)从该样品中提取编码该与癌症相关的抗原或其部分的核酸分子；
[0169](C)使用聚合酶链反应扩增提取的核酸分子；
[0170](d)确定编码该与癌症相关的抗原的核酸分子的存在；以及
[0171]e)比较该样品中的编码与癌症相关的抗原的核酸分子的水平与对照样品中的水平，其中与对照样品相比，若编码与癌症相关的抗原的核酸分子的水平增加，则表明该研究对象患有癌症。
[0172]在优选的实施方式中，所述核酸分子编码含有SEQ ID NO: 2，更优选的为SEQ IDNO:1的与癌症相关的抗原。在一【具体实施方式】中，该核酸分子含有不于SEQ ID N0:6或其诊断片段。在另一种实施方式中，该核酸分子含有示于SEQ ID NO:25(其编码示于SEQ IDNO:2中的跨膜片段)或其诊断片段。
[0173] 这里描述的本发明的方法还可采用微阵列，如寡核苷酸阵列、cDNA阵列、染色体组DNA阵列或组织阵列进行。优选的阵列是组织微阵列。
[0174]在一优选的实施例中，编码哺乳动物的Scratch的与癌症相关的变异体的RNA表达产品用于检测细胞中哺乳动物的Scratch的与癌症相关的变异体的表达。本领域技术人员将能够理解，RNA表达产品的检测或定量可通过检测编码哺乳动物的Scratch的与癌症相关的变异体或其片段，或那些特异性地和/或选择性地杂交到编码哺乳动物的Scratch的与癌症相关的变异体的mRNA或其片段上的寡核苷酸、cDNA、DNA、RNA、PCR产品、合成的DNA、合成的RNA或其他天然的或改性的核苷酸的组合而实现。
[0175]许多方法可用于检测和/或定量细胞中哺乳动物的Scratch的与癌症相关的变异体的RNA表达，这些方法包括RT-PCR、核酸酶保护试验、例如核糖核酸酶保护试验和SI核酸酶试验，以及Northern印迹和类似方法等。
[0176]在一种【具体实施方式】中，
【发明者】们制备出了如实施例4中描述的扩增变异型和野生型scratch(SEQ ID NO:26)两者或仅扩增变异型scratch(SEQ ID NO:27)的PCR引物。使用这种引物能够区别出变异型和野生型scratch。
[0177]
【发明者】们还确定出野生型哺乳动物的Scratch的序列在核苷酸118处含有一KpnI限制性位点，而在与癌症相关的变异体中不存在该限制性位点。因此，为了测试癌症是否表达了该变异体，可在凝胶电泳之后用KpnI限制性酶消化扩增的pCR产物。如果测试的细胞表达了野生型的哺乳动物的Scratch，则将能检测到67bp和93bp的两个片段。如果细胞表达了与癌症相关的变异体，则PCR产物的大小将与未消化的对照的相同。
[0178]因此，本发明提供了一种检测或监控患有或疑似患有癌症的研究对象中癌细胞癌症的方法，包括:
[0179](a)由研究对象提供样品；
[0180](b)从该样品中提取编码野生型scratch或scratch的与癌症相关的变异体的核酸分子；
[0181](c)用KpnI限制性酶消化核酸分子；以及
[0182](d)确定消化的核酸分子的大小，其中未消化的核酸分子的存在指示出研究对象患有癌症。
[0183]检测与癌症相关的抗原的方法
[0184]在另一种实施方式中，本发明的方法涉及对与癌症相关的抗原的检测。在一种实施方式中，该与癌症相关的抗原是用特异性结合到与癌症相关的抗原上的抗体进行检测的。结合到与癌症相关的抗原上的抗体可使用现有技术已知的方法进行制备。
[0185]对与癌症相关的抗原具有特异性活性的抗体，或衍生物，如酶联接体或标记的衍生物，可用于检测各种样品(如生物材料)中与癌症相关的抗原。它们可用作诊断或预后试剂，且它们可用于检测与癌症相关的抗原的蛋白质表达水平中的异常、或结构和/或时间的、组织的、细胞的或亚细胞位置中的异常。活体外免疫分析也可用于评价或监控具体疗法的有效性。本发明的抗体也可用于活体外以确定编码经基因改造而产生与癌症相关的抗原的细胞中的与癌症相关的抗原的基因表达的水平。
[0186]抗体可用于任何已知的依赖于与癌症相关的抗原的抗原决定簇和抗体之间的结合相互作用的免疫分析中。这类分析的例子有放射免疫分析、酶免疫分析Uf^BELISA)、免疫荧光、免疫沉淀、乳胶粘着、红血球凝聚和组织化学测试。抗体可用于检测和定量样品中与癌症相关的抗原，以确定其在癌症中的角色和诊断癌症。
[0187]特别是，本发明的抗体可用于免疫-化学分析，例如在细胞的和亚细胞的水平，以检测与癌症相关的抗原，将其定位于特定的细胞和组织上，以及定位于特定的亚细胞位置，以及对表达水平进行定量。
[0188]现有技术已知的使用光和电子显微镜的用于定位抗原的细胞化学技术可用于检测与癌症相关的抗原。一般而言，本发明的抗体可用可检测的物质进行标记，且与癌症相关的抗原可基于这种可检测的物质的存在而定位在组织和细胞中。可检测的物质的例子包括但不限于以下:放射性同位元素(例如咕、14(:、355、1251、1311)、荧光标记(例如FITC、若丹明、镧、磷)、发光标记，例如发光氨；酶标记(例如辣根过氧化物酶、β -半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酯酶、乙酰胆碱脂酶)、生物素基(其可通过标记的抗生物素蛋白如含荧光标记的抗生蛋白链菌素或通过光学或量热方法检测到的酶活性而检测到)，由第二个报告基因识别的预定的多肽表位(如亮氨酸拉链对序列、第二抗体结合部位、金属结合区域、表位标签)。在一些实施方式中，标记是通过各种长度的间隔笔连接的以减少潜在的空间位阻。抗体也可与电子密度物质如铁蛋白或胶体金偶合，这些物质可容易地通过电子显微镜显现出。
[0189]抗体或样品可固定在能够固定细胞、抗体等的载体或固体支持物上。例如，载体或固体支持物可以是硝化纤维、或玻璃、聚丙烯酰胺、辉长岩和磁铁矿。支持材料可以具有任何可能的构型，包括球形(如小珠)、圆柱形(如试管或孔的内壁、或棒的外表面)、或平的(如片、测试条)。也可以采用一些间接方法，其中主要抗原-抗体反应通过引入第二种对与癌症相关的抗原的抗体反应具有特异性的抗体来扩增。例如，对与癌症相关的抗原具有特异性的抗体是兔IgG抗体，则该第二种抗体可以是用这里描述的可检测的物质标记的山羊抗-兔Y-血球素。
[0190]当使用放射性标记作为可检测的物质时，与癌症相关的抗原可以通过放射自显照相术进行固定。放射自显照相术的结果可以通过确定放射自显照相术中颗粒密度来进行定量，颗粒密度的确定可通过各种光学方法，或对颗粒进行计数来进行。
[0191]标记的抗癌症相关的抗原的抗体可用于在研究对象进行手术，即成像时来定位肿瘤组织。通常,对于活体内应用而言,抗体使用放射性标记物(例如:碘-123、碘-125、碘-131、镓-67、锝-99和铟-111)来标记的。可在组织成像前数小时到4天的时间，将标记的抗体制剂在适合的载体内通过静脉注射而向研究对象施用。在这段期间，未结合的部分从研究对象中清除，而仅有剩余的抗体是与肿瘤组织相关的抗体。通过适合的Y照相机检测出同位素的存在。标记的组织可用已知的标记物关联到研究对象的身体，以精确定位进行手术的肿瘤的位置。
[0192]因此，在另一种实施方式中，本发明提供了一种检测研究对象中癌症的方法，包括:
[0193](a)由研究对象提供样品；
[0194](b)用结合到与癌症相关的抗原的抗体接触该样品；
[0195](C)检测该样品中的与癌症相关的抗原的水平；以及
[0196](d)比较该样品中的与癌症相关的抗原的水平与对照样品中的水平，其中与对照样品相比，若与癌症相关的抗原的水平增加，则表明该研究对象患有癌症。
[0197](iii)治疗方法
[0198] 如上所述，与癌症相关的新抗原存在于癌细胞上，但不显著存在于正常细胞上。因此，与癌症相关的新抗原可用于预防和治疗癌症的治疗方法中。此外，与癌症相关的新抗原或其片段可用于引起活体内例如疫苗中或活体外的免疫应答。
[0199]本发明的一种实施方式是本发明的分离的蛋白质或其片段在制备治疗或预防癌症的药物中的应用。本发明的另一种实施方式是本发明的分离的蛋白质或其片段在治疗或预防癌症中的应用。本发明的进一步实施方式是本发明的分离的蛋白质或其片段在制备引起免疫应答的药物中的应用。本发明的另一种实施方式是本发明的分离的蛋白质或其片段在引起免疫应答的中的应用。
[0200]本发明还包括本发明的分离的核酸序列在制备治疗或预防癌症的药物中的应用。本发明还进一步包括本发明的分离的核酸序列在治疗或预防癌症中的应用。此外，本发明还包括本发明的分离的核酸序列或其片段在制备引起免疫应答的药物中的应用。本发明还进一步包括本发明的分离的核酸序列在引起免疫应答中的应用。
[0201]本发明的进一步的实施方式是本发明的重组表达载体在制备治疗或预防癌症的药物中的应用。本发明的另一种实施方式是本发明的重组表达载体在治疗或预防癌症中的应用。另外，本发明还包括本发明的重组表达载体在制备在研究对象中引起免疫应答的药物中的应用。本发明的另一种实施方式是本发明的重组表达载体在研究对象中引起免疫应答的药物中的应用。
[0202]本发明的另一种实施方式是治疗或预防癌症的方法，其包括向有需要的研究对象或他的细胞施用有效量的本发明的分离的蛋白质或其片段。此外，本发明包括治疗或预防癌症的方法，其包括向有需要的研究对象或他的细胞施用有效量的本发明的分离的核酸序列。此外，本发明还包括治疗或预防癌症的方法，其包括向有需要的研究对象或他的细胞施用有效量的本发明的重组表达载体。
[0203]本发明的另一种实施方式是诱导研究对象对本发明的分离的蛋白质免疫应答的方法，其包括向有需要的研究对象或他的细胞施用有效量的本发明的分离的蛋白质或其片段。此外，本发明还包括在研究对象中引起对本发明的分离的蛋白质的免疫应答的方法，其包括向有需要的研究对象或他的细胞施用有效量的本发明的分离的核酸序列。此外，本发明还包括在研究对象中引起对本发明的分离的蛋白质的免疫应答的方法，其包括向有需要的研究对象或他的细胞施用有效量的本发明的重组表达载体。
[0204]上述方法包括活体内或活体外施用本发明的分离的蛋白质。对于活体外应用而言，蛋白质可被用于刺激由患者获得的淋巴细胞，这些淋巴细胞然后被重新输入到研究对象体内以增加对表达了与癌症相关的抗原的癌细胞的免疫应答。
[0205]本发明的进一方面是一种通过调节在癌细胞上或在癌细胞内的哺乳动物Scratch的与癌症相关的变异体的活性或表达来治疗或预防研究对象中癌症的方法。
[0206]在本发明的一种实施方式中，治疗或预防研究对象中癌症的方法包括阻碍或降低哺乳动物的Scratch的与癌症相关的变异体的功能。在本发明的一种实施方式中，本发明的结合蛋白被用于阻碍或降低哺乳动物的Scratch的与癌症相关的变异体的功能。
[0207]在本发明的另一种实施方式中，哺乳动物的Scratch的与癌症相关的变异体的功能是通过减少或阻碍哺乳动物的Scratch的与癌症相关的变异体的功能在细胞中的表达而得到了阻碍或减少。
[0208]可采用标准技术来阻碍或降低哺乳动物的Scratch的与癌症相关的变异体的功能在细胞中的表达，所使用的技术包括与哺乳动物的Scratch基因的与癌症相关的变异体具有反应性的反义的、三重螺旋的或核糖酶分子。
[0209]例如，可采用标准技术来产生反义核酸分子，即与编码目的多肽的有义核酸分子互补的分子，例如与编码双链cDNA分子的编码链互补或与mRNA序列互补。这样,反义核酸即可以氢键连接到正义核酸上。反义核酸可以互补到整条编码链上，或仅其一部分上，例如所有的或部分的蛋白质编码区(或开放读码框)。反义核酸分子可与编码目的多肽的核苷酸序列的编码链的非编码区的全部或部分形成反义。非编码区(“5’和3’未翻译区”)为编码区的5’和3’边侧序列，且未被翻译成为氨基酸。
[0210]反义寡核苷酸可以是长度如约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个或更长的核苷酸。本发明的反义核酸可使用化学合成和酶连接反应按照现有技术已知的步骤进行构建。例如，反义核酸(如反义寡核苷酸)可使用天然核苷酸或各类为增加分子的生物稳定性或增加在反义和正义核酸之间形成的双链的物理稳定性而设计的改性核苷酸来化学合成，例如可使用硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸。可用于产生反义核酸的改性的核苷酸的例子包括:5_氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟基甲基)尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫尿核苷、5-羧基甲基氨基甲基尿嘧啶、二羟尿嘧啶、β -D-半乳糖Q核苷、次黄嘌呤核苷、Ν6-异戊烯腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫脲嘧啶、β-D-甘露糖Q核苷、5’-甲氧基羧基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲基硫代-Ν6-异戍烯腺嘌呤、尿喃唳-5-氧乙酸(V)、wybutoxosine、假尿喃唳、Q核苷、2_巯基嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸(V)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧基丙基)尿嘧啶、(&叩3)?以及2，6-二氨基嘌呤。或者，反义核酸可用核酸已被反义方向亚克隆进的表达载体生物产生，(即从插入的核酸转录的RNA与目的靶核酸呈反义取向)。
[0211]向研究对象施用的或在原位生成的反义核酸分子与编码兴趣多肽的细胞的mRNA进行杂交或与其结合，从而抑制了表达，例如通过抑制转录和/或翻译而达成。杂交可以通过传统的核苷酸互补性以形成稳定的双链，或在反义核酸分子结合到DNA双链的情况下，通过在双螺旋的大沟内的特异性相互作用形成。本发明的反义核酸分子的施用途径例如包括直接注射到组织部位。或者，反义核酸分子可经改性而靶向选择的细胞，然后再进行全身性施用。例如，对于全身性施用，反义分子可经改性，从而它们能特异性地结合到在选择细胞如T细胞或脑细胞上表达的受体或抗原,例如通过将反义核酸分子连接至结合在细胞表面受体或抗原上的肽或抗体上。反义核酸分子也可使用载体，例如下面描述的基因疗法载体来向细胞输送。为获得足够的反义分子的细胞内浓度，其中反义核酸分子在强PoiII或Pol III启动子控制下的载体构建是优选的。
[0212]目的反义核酸分子可以是α-异头核酸分子。α-异头核酸分子与互补的RNA形成特异的双链杂种，其中与常见的α-单元不同的是，这两条链相互平行(Gautier等人，1987，Nucleic Acids Res.15:6625-6641)。反义核酸分子也可含有2’ -ο-甲基核糖核苷酸(Inoue 等人，1987，Nucleic Acids Res.15:6131-6148)或嵌合的 RNA-DNA 类似物(Inoue 等人，1987，FEBS Lett.215:327-330)。
[0213] 核酶是具有核糖核酸酶活性的起催化作用的RNA分子，这种核糖核酸酶活性能够切断具有与他们互补区域的单链的核酸，例如mRNA，且也可使用标准的技术来生成。因此，核酶(例如银头状的核酶(描述于 Haseloff and Gerlach, 1988，Nature334:585-591)可用于催化裂解mRNA转录物，从而抑制由mRNA编码的蛋白质的翻译。对编码目的多肽的核酸分子具有特异性的核酶可基于编码与哺乳动物的Scratch基因的与癌症相关的变异体的核苷酸序列而设计。例如，在Cech等人的美国专利号4，987，071和Cech等人的美国专利号5，116，742中，构建出四膜虫L-19IVS RNA的衍生物，其中活性位点的核苷酸序列与待切断的核苷酸序列互补。可选地，也可使用编码目的多肽的mRNA从RNA分子库中筛选具有特异性核糖核酸酶活性的催化性RNA。例如参见Bartel and Szostak, 1993, Science261:1411-1418。
[0214]使用熟知的技术也可产生出三重螺旋结构。例如，目的多肽的表达可通过靶向与编码该多肽的调节区的基因(如启动子和/增强子或)的互补的核苷酸序列所抑制，形成三重螺旋结构以防止基因在目标细胞上的转录。一般描述参见Helene, 1991，AnticancerDrug Des.6 (6): 569-84 ；Helene, 1992, Ann.N.Y.Acad.Sc1.660:27-36 ；和 Maher, 1992, B1assaysl4(12):807-15。
[0215]在各种实施方式中，可在碱基部分，糖部分或磷酸酯骨架对核酸组合物进行改性，以改进分子的如稳定性、杂交性或溶解性。例如，核酸的脱氧核醣磷酸酯骨架可经改性而产生妝核酸(见 Hyrup 等人，1996，B10rganic & Medicinal Chemistry4 (I): 5-23)。这里使用的术语“肽核酸”或“PNAs”是指核酸类似物，如DNA类似物，其中的脱氧核醣磷酸酯骨架被假肽骨架替代，且只保留了四种天然核碱基。已发现PNA的中性骨架允许DNA在低离子强度条件下对RNA的特异性杂交。PNA寡聚体的合成可采用标准的固相肽合成方法进行，例如在 Hyrup 等人,1996,见上；Perry_0’ Keefe 等人,1996, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA93:14670-675中描述的方法。
[0216]PNA例如可通过将亲脂性的或其它的辅助基团连接到PNA上，通过形成PNA-DNA嵌合体，或通过使用脂质体或其它现有技术已知的药物输送技术改性而增强它们的稳定性或细胞的吸收性。例如，可产生出集中了 PNA和DNA两者优点的PNA-DNA嵌合体。这样的嵌合体允许DNA识别酶，例如RNAse H和DNA聚合酶，与DNA部分相互作用，同时在PNA部分提供高结合亲和力和特异性。PNA-DNA嵌合体可使用根据碱基堆积、核碱基之间的键数目以及取向而选择的适当长度的连接物连接(Hyrup，1996，见上)。PNA-DNA嵌合体的合成可如Hyrup, 1996，见上，和Finn等人所述的进行，1996，Nucleic AcidsRes.24(17):3357-63中所描述那样进行。例如，可使用标准的亚磷酰胺偶联化学和改性的核类似物来在支持物上合成DNA链。化合物例如5’ -(4-甲氧基三苯甲基)氨基-5’ -脱氧_胸苷亚磷酰胺可用作PNA和DNA的5’端之间的连接(Mag等人，1989，Nucleic AcidsRes.17:5973-88)。然后，PNA单体可逐步偶联以产生具有5’ PNA片段和3’ DNA片段的嵌合分子(Finn 等人，1996，Nucleic Acids Res.24 (17): 3357—63)。或者，可使用具有 5’PNA片段和3’ DNA片段的嵌合分子来合成嵌合分子(Petersen等人，1995，B10rganic Med.Chem.Lett.5:1119-1124)。
[0217]在其他的实施方式中，寡核苷酸可包括其它的附加基团，例如肽(例如用于在活体内祀向宿主细胞受体)，或辅助穿过细胞膜(参见如Letsinger等人，1989，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA86:6553-6556 ；Lemaitre 等人，1987，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA84:648-652 ；Internat1nal Publicat1n N0.W088/09810)或血脑屏障(参见如 Internat1nalPublicat1n N0.W089/10134)的试剂。此外，寡核苷酸可用杂交_触发的裂解剂(参见如van der Krol 等人，1988，B1/Techniques6:958-976)或嵌入剂(参见如 Zon, 1988, Pharm.Res.5:539-549)修饰。为此，寡核苷酸可偶联到另一个分子上，例如肽、杂交触发的交联剂、运输剂、杂交触发的裂解剂等。
[0218] 本发明的另一方面是一种识别能够调节哺乳动物的Scratch的与癌症相关的变异体的表达或活性的化合物的方法，其可用于预防或治疗癌症。在本发明的一种实施方式中，该用于识别能够预防或治疗癌症的化合物的方法包括以下步骤:
[0219](a)将表达哺乳动物的Scratch的与癌症相关的变异体的细胞与测试化合物接触；以及
[0220](b)确定哺乳动物的Scratch的与癌症相关的变异体的表达或功能；以及
[0221](c)将哺乳动物的Scratch的与癌症相关的变异体的表达或功能与对照比较，其中若与对照比较哺乳动物的Scratch的与癌症相关的变异体的表达或功能降低则指示出该化合物可用于预防或治疗癌症。
[0222](D)结合蛋白质
[0223]本发明的另一方面是结合蛋白质，优选为一结合到本发明的分离的蛋白质上的抗体或抗体片段。这种结合蛋白质通常可被称作“本发明的结合蛋白质”，或优选被称作“本发明的抗体或抗体片段”。
[0224]在一种实施方式中，本发明包括对哺乳动物的Scratch的与癌症相关的变异体特异的结合蛋白质。在一种优选的实施方式中，该与癌症相关的哺乳动物的Scratch的变异体包含由SEQ ID NO:1定义的氨基酸序列或其变异体，或由SEQ ID N0:2定义的氨基酸序列或其变异体。在另一种实施方式中，该结合蛋白质结合到分离的蛋白质上，这种分离的蛋白质包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或其变异体或SEQ ID NO: 2的氨基酸序列或其变异体。
[0225]在一些实施方式中，抗体或抗体片段包含所有或部分的重链恒定区，例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAU IgA2、IgE、IgM或IgD恒定区。并且，抗体或抗体片段可包含所有或部分的K轻链恒定区或λ轻链恒定区。
[0226]本发明的分离的蛋白质可被用于制备单克隆或多克隆抗体。可采用传统的方法来制备抗体。例如参考Goding, J.W.，Monoclonal Antibodies !Principles and Practice, 2ndEd.，Academic Press, London, 1986。
[0227]也可通过对在具有细胞表面组成的细胞中表达的编码免疫球蛋白基因或其部分的表达库进行筛选来产生对具体抗原或分子如癌细胞上的抗原或分子具有特异性的抗体，或抗体片段。例如，可使用噬菌体表达库来在细节中表达完整的Fab片段，VH区和FV区。(例如参见 Ward 等人，Nature341:544-546 (1989) ；Huse 等人，Science246:1275-1281 (1989)；和 McCafferty 等人，Nature348:552-554 (1990))。
[0228]本发明还提供了含有本发明结合蛋白质，优选为抗体和抗体片段，以及药学上可接受的赋形剂、载体、缓冲剂或稳定剂的组合物。
[0229]此外，本发明的结合蛋白质可用于诊断癌症。
[0230]在一种优选的实施方式中，该结合蛋白质是结合到在癌细胞表面表达的哺乳动物的Scratch的与癌症相关的变异体上的抗体或抗体片段，其优选为含有氨基酸序列SEQ IDN0S:1或2中任何一者的分离的蛋白质。此外，可对癌细胞进行评估以确定它们对本发明治疗方法的易感性，例如可获得癌细胞的样品并确定样品结合到本发明的结合蛋白质，优选为抗体或抗体片段上的能力。
[0231]因此，本发明包括诊断方法、试剂和试剂盒，其本身可在本发明的治疗方法进行之前、进行其间或进行之后使用，以确定是否有癌细胞表达了抗原并能结合到本发明的结合蛋白质，优选为抗体和抗体片段。
[0232]在一种实施方式中，本发明提供了一种检测或监控研究对象中癌症的方法，其包括以下步骤:
[0233](I)将取自所述研究对象的测试样品与特异性结合到癌细胞抗原的结合蛋白接触，以产生结合蛋白-抗原复合物；
[0234](2)测量测试样品中结合蛋白-抗原复合物的量；以及
[0235](3)比较测试样品和对照中结合蛋白-抗原复合物的量。
[0236]在一种实施方式中，抗原是哺乳动物的Scratch的与癌症相关的变异体，优选为含有氨基酸序列SEQ ID N0S: 1-2中任何一种的分离的蛋白质。
[0237]本发明进一步包括用于检测或监控癌症的试剂盒，其含有本发明的结合到癌细胞上的抗原上的任何一种结合蛋白质以及对其的使用说明。
[0238]当用于诊断应用中时，本发明的结合蛋白质，优选为抗体或抗体片段，可用可检测的标记物如不透射线的或放射性同位素；例如3h、14c、32p、35s、1231、1251、131i ;突光(荧光团)或化学发光(发色团)化合物，例如异硫氰酸荧光素、若丹明或虫萤光素、酶如碱性磷酸酶、β -半乳糖苷酶或辣根过氧物酶、显象剂或金属离子进行标记。如上所描述的，将标记物连接到结合蛋白质的方法，如抗体或抗体片段上的方法是现有技术中已知的。
[0239]本发明的另一方面是一种检测或监控研究对象中癌症的方法，其包括以下步骤:
[0240](I)在取自所述研究对象的样品中测量本发明的抗体的量；以及
[0241](2)比较测试样品和对照中本发明的抗体的量。
[0242]在一种实施方式中，本发明的抗体的量是通过测量测试样品中发明的抗体的量来测量的，例如通过ELISA进行。在另一种实施方式中，发明的抗体的量是通过测量测试样品中编码本发明的抗体的核酸的表达水平来测量的，例如通过RT-PCR进行。
[0243]Ε)本发明的蛋白质的制备
[0244]本领域技术人员将认识到可通过多种方式中的任何一种来自被本发明的蛋白质，例如与癌症相关的新抗原，结合蛋白质，优选为抗体和抗体片段，但最优选的是使用重组方法来制备。
[0245]因此，本发明的核酸分子可通过已知的方式插入适合的表达载体中，以确保本发明蛋白质的良好表达。可能的表达载体包括但不限于:粘粒、质粒或改性的病毒(例如有复制缺陷的逆转录酶病毒、腺病毒和腺相关病毒)，只要该载体与使用的宿主细胞相容即可。该表达载体“适合于宿主细胞的转化”，这意味着该表达载体含有本发明的核酸分子和基于用于表达的宿主细胞选择的调节序列，该序列有效地连接至核酸分子。有效地连接意味着核酸分子连接至调节序列的方式使得该核酸得以表达。
[0246] 因此，本发明涵盖了本发明的重组表达载体，其含有本发明的核酸分子，或其片段，以及用于转录和翻译插入的蛋白质序列所必需的调节序列。
[0247]适合的调节序列可源自各种来源，其包括细菌、真菌、病毒、哺乳动物或昆虫基因(例如参见在 Goeddel, Gene Express1n Technology:Methods inEnzymologyl85, Academic Press, San Diego, CA(1990)中描述的调节序列)。如以下讨论的那样，对适合的调节序列的选择取决于宿主细胞，这可由本领域技术人员轻易地完成。这种调节序列的例子包括:转录启动子和增强子或RNA聚合酶结合序列、核醣体结合序列包括翻译开始信号。此外，根据选择的宿主细胞和采用的载体，其他的序列如复制原点、其他的DNA限制位点、增强子以及赋予转录可诱导性的序列均可插入到表达载体中。
[0248]本发明的重组表达载体也可含有可选择的标记物基因，以便于具有本发明重组分子的转化或转染的宿主细胞的选择。可选择的标记物基因的例子是编码蛋白质的基因，如对某些药物产生抗性的G418和潮霉素、编码β -半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、荧光虫荧光素酶或免疫球蛋白或其部分如免疫球蛋白的Fe部分，优选为IgG的基因。对可选择的标记物基因的转录是通过可选择的标记物蛋白质如β -半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶或荧光虫荧光素酶的浓度变化来监控的。如果可选择的标记物基因编码的蛋白质具有耐抗生素性，如耐新霉素性，则可用G418来选择转化体细胞。已插入可选择的标记物基因中的细胞将存活，而其他的细胞将死亡。这就使得本发明的重组表达载体的可视化和检测，特别是确定突变对表达和表型的影响成为可能。可以认为可选择的标记物可从目的核酸中引入到分离的载体上。
[0249]该重组表达载体也可含有编码融合部分的基因，该融合部分提供了重组蛋白质的增强的表达、重组蛋白质的增强的溶解性，并且通过作为在亲和性纯化过程中作为配体而辅助目标重组蛋白质的纯化。例如，可在目标重组蛋白质中插入蛋白质水解裂解位点，以使重组蛋白质在融合蛋白质纯化后从融合部分分离。典型的融合表达载体包括pGEX(Amrad Corp., Melbourne, Australia) > pMal (New England B1labs, Beverly, MA)和pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ)，它们分别将谷胱甘肽S_转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白质或蛋白质A融合到重组蛋白质上。
[0250]重组表达载体可被引入到宿主细胞中而产生转化的宿主细胞。术语“用……进行转化”、“用……进行转染”、“转化”和“转染”意在包括将核酸(如载体)通过现有技术中已知的任何技术引入细胞。这里使用的术语“转化的宿主细胞”也意在包括能够进行糖基化的细胞，其用本发明的重组表达载体进行了转化。原核细胞可用核酸通过如电穿孔或氯化钙介导的转化而进行转化。例如，可通过传统的技术如磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-右旋糖苷介导的转染、脂质转染试剂、电穿孔或微注射将核酸引入到哺乳动物细胞中。适用于转化和转染宿主细胞的方法可在Sambrook等人(Molecular Cloning:A LaboratoryManual, 3rd Edit1n, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001),以及其他实验室教科书中找到。
[0251]适合的宿主细胞包括大量不同的各种真核宿主细胞和原核细胞。例如，本发明的蛋白质可在酵母细胞或哺乳动物细胞中表达。其他适合的宿主细胞可在Goeddel,Gene Express1n Technology:Methods in Enzymologyl85, Academic Press, SanDiego, CA(1990)中找到。此外，本发明的蛋白质可在原核细胞，如大肠杆菌(Zhang等人，Science303(5656):371-3(2004))中表达。另外，可使用基于假单胞菌的表达系统例如荧光假单胞菌(美国专利申请公布号US2005/0186666，Schneider, Jane C等人)。
[0252] 适用于本发明的酵母和真菌宿主细胞包括但不限于:酿酒酵母、毕赤酵母(Pichia)属或克鲁维酵母(Kluyveromyces)属以及曲霉菌类的各个种。用于在酵母酿酒酵母(S.cerevisiae)中表达的载体包括pYepSecl (BaIdar1.等人，EmboJ.6:229-234(1987))、pMFa (Kurjan and Herskowitz,Cell30:933-943 (1982))、pJRY88(Schultz 等人，Gene54:113-123(1987))和 pYES2(Invitrogen Corporat1n, SanDiego, CA)。酵母和真菌转化的实验方案为本领域技术人员熟知(参见Hinnen等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA75:1929 (1978) ；Itoh 等人，J.Bacter1logyl53:163 (1983)和 Cullen等人，(B1lTechnology5:369 (1987))。
[0253]适用于进行本发明的哺乳动物细胞包括:C0S(e.g.，ATCC N0.CRL1650orl651)、BHK (e.g.ATCC N0.CRL6281)、CHO (ATCC N0.CCL61)、HeLa (e.g.，ATCC N0.CCL2)、293 (ATCCN0.1573)和NS-1细胞。用于在哺乳动物细胞中直接表达的适合的表达载体通常包括启动子(例如来自病毒材料如多瘤病毒、腺病毒2、细胞巨化病毒和猿病毒40)，以及其他的转录和翻译控制序列。哺乳动物表达载体的例子包括pCDM8(Seed，B.，Nature329:840 (1987))和 pMT2PC (Kaufman 等人，EMBO J.6:187-195 (1987))。
[0254]根据这里提供的教导，也可以轻松地实现启动子、终止子和用于将适合类型的表达载体引入植物、鸟类和昆虫细胞内的方法。例如，在一种实施方式中，本发明的蛋白质可由植物细胞表达(参见Sinkar等人，J.B1sci (Bangalore) 11:47-58 (1987),该文综述了发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)载体的使用；另见Zambryski等人，Genetic Engineering, Principles and Methods, Hollaender and Setlow(eds.), Vol.VI, pp.253-278, Plenum Press, New York(1984),该文描述了将表达载体用于植物细胞，包括 PAPS2O22、PAPS2023 和 PAPS20:M 等)。
[0255]适合于进行本发明的昆虫细胞包括来自家蚕(Bombyx)、金翅夜蛾(Trichoplusia)或斜纹夜蛾(斜纹夜蛾)的细胞和细胞系。可用于在培养的昆虫细胞(SF9细胞)中进行蛋白表达的杆状病毒(Baculovirus)载体包括pAc系列(Smith等人，Mol.Cell B1l.3:2156-2165(1983))和 pVL 系列(Luckow, V.A.,和 Summers, Μ.D.，Virologyl70:31-39 (1989))。一些适合本发明重组蛋白质表达的杆状病毒-昆虫细胞表达体系在PCT/US/02442 中进行了描述。
[0256]另外，本发明的蛋白质也可在非人类的转基因动物如小鼠、大鼠、兔、羊和猪(Hammer 等人，Nature315:680-683 (1985) ;Palmiter 等人，Science222:809-814 (1983)；Brinster 等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA82:4438-4442(1985) ；Palmiter 和 BrinsterCell41:343-345 (1985)和美国专利号4，736，866))中进行表达。
[0257]本发明的蛋白质也可通过化学合成法采用蛋白质化学领域熟知的技术如固相合成(Merrifield, J.Am.Chem.Assoc.85:2149-2154 (1964) ;Frische 等人，J.Pept.Sc1.2(4): 212-22 (1996))或在均匀溶液中合成(Houbenweyl, Methods of OrganicChemistry, ed.E.ffansch, Vol.151 and II, Thieme, Stuttgart (1987))来制备。
[0258]包括与其他分子，如蛋白质缀合的本发明的蛋白质的N-端或C-端融合蛋白质，可经重组技术通过融合制备。所得的融合蛋白质含有本发明的融合到这里描述的选择的蛋白质或标记物蛋白质上的蛋白质。本发明的重组蛋白质也可通过已知技术结合到其他蛋白质上。例如，可使用W090/10457中描述的异种双功能含硫醇的连接剂N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫-并酸酯)或N-琥珀酰亚胺基-5硫乙酸酯来偶联蛋白质。可用于制备融合蛋白质或偶联物的蛋白质的例子包括细胞结合蛋白质如免疫球蛋白、荷尔蒙、生长因子、外源凝集素、胰岛素、低密度脂蛋白、胰高血糖素、内啡肽、铁传递蛋白、铃蟾肽、去唾液酸糖蛋白、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、红血球凝聚素(HA)以及截取的myc。
[0259]因此，本发明提供了一种重组表达载体，其含有编码本发明的蛋白质如本发明的分离的蛋白质的核酸序列。另外，本发明还提供了一种宿主细胞，其含有本发明的重组表达载体。
[0260]下面使用非限制性的实施例对本发明进行描述:
[0261]实施例
[0262]实施例1:与癌症相关的Scratch的分离和确定
[0263]实验设计
[0264]使用了黑素瘤细胞系(A-375)、神经胶质瘤细胞系(U118iK^PU87MG)、乳癌细胞系(MDA-MB435S)、胰腺细胞系(PANC-1)和T-细胞系(Daudi)来进行研究(表1)。这些细胞系是基于流式细胞仪得出的肿瘤细胞系测量结果选择的。
[0265]肿瘤细胞系的生长和维持
[0266]用于研究的细胞系购自ATCC并根据ATCC推荐的指南进行培养。收集90%汇合以及生存力>90%的细胞。
[0267]结合到VB3-011的抗原的初步表征
[0268]由设计成评价点印迹法的基于凝胶的方法进行检测的实验获得了初步表征数据；并从进行实验来确定与抗原相关的抗原决定部位的性质。
[0269]由这些实验获得的数据将VB3-011抗原归类为带有聚糖改性的“不能印迹的”抗原，即涉及到在抗原上结合至VB3-011的表位被糖基化。
[0270]VB3_011Ag富集和纯化
[0271]由印迹性研究获得的初步数据给出了基于外源凝集素的纯化方法是对VB3-011的最佳抗原制备方法。大量的实验揭露了聚糖改性涉及CS(软骨素硫酸盐)的可溶形式；这些(CSB和CSE)中的两种具有有限的组织分布。这样，聚糖改性可归因于CSA，而透明质酸对其的影响较小。
[0272]软骨素硫酸盐A(CSA)是由含D-半乳糖胺和D-葡萄糖醛酸的线性重复单元构成。软骨素硫酸盐A的基本单元中的半乳糖胺的氨基被乙酰化，产生N-乙酰基-半乳糖胺；N-乙酰基-半乳糖胺4-位的硫酸基被酯化(图1A) (Sugahara K等人，1988.J.B1l.Chem.Vol.263:10168-10174 ；Sugahara K等人，1991.Eur.J.B1chem.Vol.202:805-811 ；Prydz K和 Dalen KT.2000.J.Cell Sc1.Vol.113:193-205)。当在第二条碳链的 C2 和第一条碳链的C6的这些线性重复单元在支化点处发生交联(α 2-6)，这样出现代表多于一条CSA线性链的聚糖单一单元时，除了硫酸盐化作用外，它类似于HA识别的聚糖和Neu5Ac ( α 2 - 6)Gal (β I — 4)葡糖醛酸(图1B)。
[0273] 当两个或多个CSA分子交联在一起时，其类似于由红血球凝聚素(HA)识别的聚糖-Neu5Ac ( α 2 — 6)Gal ( β I — 4)葡糖醒酸，Azumi等人.，(1991)显示出从海鞘类的血细胞分离的红血球凝聚素的活性，真海鞘(Halocynthia roretzi)被肝磷脂、软骨素硫酸盐和脂聚糖(LPS)抑制，但不被单糖和二糖如N-乙酰基-半乳糖胺、半乳糖和蜜二糖抑制。红血球凝聚素显示出对肝磷脂、软骨素硫酸盐和LPS的结合能力，这可分别由肝磷脂-琼脂糖凝胶色谱和离心分离实验得到证实(Ajit Varki等人，eds.1999.Essentials of Glycob1logy)。同样地，分支杆菌的红血球凝聚素显示出对硫酸乙酰肝素的结合，和流感嗜血菌的红血球凝聚素结合到CSA具有额外的α 2-6键(Azumi K等人，Α1991.Dev.Comp.1mmunol.Vol.15 (1-2): 9-16 ;Menozzi FD 等人，11996.J.Exp.Med.,Vol.184(3):993-1001)。硫酸乙酰肝素和软骨素硫酸盐A在C5差向异构上不同。因此，如下生成了能够进行基于外源凝集素的纯化的新的试剂。重组HA通过与二甲基环已酮(DMP)偶联而固定到抗-HA的抗体上，这样当被用作IP试剂时，HA识别细胞表面上与抗原相关的CSA。细胞膜制备物用固定的HA进行亲和性纯化，洗出液进行SDS-PAGE和WB分析，然后用VB3-011抗体进行探测。
[0274]基于外源凝集素的纯化
[0275]在室温下的章动器上使特异结合到聚糖_Neu5Ac ( α 2 — 6) Gal (I — 4) Glc上的重组HA分子结合到抗-HA抗体上2小时，然后将HA-抗-HA复合物结合到蛋白质-G-琼脂糖上。此后进行离心分离步骤以除去未结合的部分。然后用已知能使邻近的蛋白质发生交联的二甲基环已酮(DMP)交联该固定的复合物。通过简单的离心分离步骤除去过剩的或未用到的交联剂和未结合的材料。交联步骤中可能产生的副产物非特异性氨基，其用三乙醇胺在室温下中和2小时。这样，用PBS充分清洗并存储在2-8°C的含0.05% NaN3的PBS中，就生成了基于外源凝集素的试剂。除了 HA-试剂外、Con-A-琼脂糖和WGA-琼脂糖也被用作亲和性纯化试剂来检测更佳的抗原回收。
[0276]在基于外源凝集素的纯化中，最少用到500 μ g细胞膜蛋白质。单独使用蛋白质-G琼脂糖凝胶的预清洁步骤是在加入试剂之前的抗原纯化中的第一步。混合物中总共用到了15-20 μ L的试剂作为沉淀剂。采用模拟生理环境的缓冲条件，将该抗原-外源凝集素混合物在4°C章动过夜。应当小心确保在每一步抗原分离步骤中均使用了蛋白酶抑制剂。
[0277]离心分离抗原-外源凝集素复合物，用RIP-A溶解缓冲液洗，并用pH2.5的0.2M糖胶洗提。将代表未结合部分的上清液储存以测试那些未在亲和性纯化中分离的蛋白质。基于外源凝集素的纯化是在两种神经胶质瘤细胞系(U118MG和U87MG): —黑素瘤细胞系(A-375)、一上皮细胞系(MDA-MB-435S)和两种阴性细胞系(Panc-1 JPDaudi)中进行的。基于凝胶的分析和蛋白质印迹
[0278]ID-PAGE:将纯化的蛋白质置于样品制备的还原条件，然后用SDS-PAGE/蛋白质印迹进行分析。当使用还原条件时，分离的抗原用含1%的β_巯基乙醇的样品缓冲液在65°C处理15分钟。所得点印迹用VB3-011和相应的偶联到HRP上的次级抗体进行探测，并通过化学发光显示出纯化的蛋白质。
[0279]2D-PAGE:纯化的蛋白质用二维凝胶电泳进行分离，以解开在ID-PAGE分析中可能出现的任何蛋白质堆积效果。二维凝胶电泳根据蛋白质在第一维中的等电点(Pl)以及在第二维中的分子量来解开蛋白质。将上述解开的蛋白质转移到硝化纤维膜上过夜，并在ID-PAGE的情况下进行处理。蛋白质印迹用VB3-011进行探测，反应的蛋白质通过化学发光而显示。
[0280]肽提取和抗原ID
[0281]由凝胶内核溶液内胰蛋白酶消化物种提取肽:胰蛋白酶消化是采用顺序等级的胰蛋白酶在20小时的肽提取过程中进行的，最终提取到的肽在QSTARPulsar-1 (ES1-qTOF-MS/MS)上进行分析，该设备配备了工作流速为20_50nL/min的纳米源。肽被离子化且检测到的分子为带双重、三重或四重电荷，这些分子随后根据它们相应的质量进行细分。在可能的条件下还对确认的蛋白质进行了从头测序(De-novosequencing) 0肽从阳性和阴性细胞系中都进行提取，以确保它是正确的抗原。由质谱获取的肽的质量被直接用于识别抗原，其依据是由蛋白质数据库所获得的MOWSE得分，该数据库可通过MOWSE搜索引擎进入。由凝胶切片和溶液内(U118MG，U87MG，A-375，435S)两者提取肽，并对其进行MS分析。
[0282]结果
[0283]HA试剂固定
[0284]重组HA分子不是抗体，故不会作为固定用伴侣而直接结合到蛋白质-G-琼脂糖凝胶上。为了使这种分子在抗原纯化过程中发挥作用，将HA结合到能够特异性地结合到HA的抗-HA抗体上，分子用蛋白质-G-琼脂糖凝胶以连续的方式固定。这不仅会固定户和无，并且还会锁住如图2所示的任何可能由抗-HA引起的非特异性作用。该固定的HA-抗-HA复合物随后用二甲基环已酮这一将各种试剂保持接近的交联试剂稳定。最终复合物在过程中生成多个反应性胺，而非HA分子上的反应性结合位点。这些反应性基团主要用IM的三乙醇胺来阻滞，从而保证HA分子上反应性位点的最大暴露。
[0285]外源凝集素-纯化
[0286]所有纯化反应均用预清除的(pre-cleared)蛋白质进行。使用更长的培育时间以最小化非特异性和增强同类抗体-抗原复合物的稳定性。在该项研究中用到了 6种细胞系(A-375、U118MG、U87MG、MDA-MB-435S、Panc-1 和 Daudi)。在对 SDS-PAGE 上分离的抗原进行解开之前，采用了还原条件来制备样品。用VB3-011来探测蛋白质印迹，以确保纯化的抗原是VB3-011的同类结合伴侣。
[0287]lD-PAGE/ffestern 分析
[0288]当使用HA试剂时，在抗原-阳性细胞系(A-375)中还原条件下(图3A)在ID-PAGE~50kDa分离后，仅检测到一个特异性带，而这个带在阴性细胞系(Panc-1)子中不存在。观察到了与Con-A和WGA凝集素的非特异性相互作用，这表明在VB3-011抗原上存在的聚糖可被HA识别。当用HA试剂纯化时(图3B)，神经胶质瘤细胞系(U118MG和U87MG)也显示出~50kDa的单带。当样品在SDS-PAGE分离前置于室温I小时时，在抗原-阳性细胞系(A-375、U118MG和U87MG)中观察到~36kDa的强带和50kDa的弱带(图4)。
[0289]2D-PAGE 分析
[0290]为了确定等电点(pi)和评价在ID-PAGE分析中蛋白质堆积的可能性，由HA纯化的抗原在二维聚酰胺凝胶电泳(2D-PAGE)上进行分离，其中第一维中的分离是基于pl，而第二维中的分离是基于分子量。然后将凝胶转移到硝化纤维膜上，并进行标准的蛋白质印迹步骤。由于2D凝胶对蛋白质的检测要求量约比ID凝胶要求的高4倍，从4个独立反应中纯化的抗原被汇集到并一起用于2D-PAGE分析。同时处理两组凝胶以用于蛋白质印迹分析，以确保在库马西染色凝胶上检测到的蛋白质与在蛋白质印迹中观察到的是一样的。用VB3-011探测2D的蛋白质印迹，并用ECL(化学发光)进行检测。如图5所示，在~36kDa/Pl = 9.7+0.2检测到一个单点。
[0291]肽的提取和蛋白质的分析
[0292]A-375、U87MG和U118MG膜被用于纯化特异性结合到VB3-011上的抗原。如图3A和3B所示，在所有的三种细胞系中均观察到了~50kDa的带。从库马西染色凝胶中切除蛋白质带，用于凝胶内消化以提取肽进行MS分析。
[0293]ID-凝胶带和2D-点中的蛋白质用胰肮酶进行消化，而将他们从凝胶中释放出，并在反相LC-MS/MS系统中进行分析。使用生物资讯分析工具由数据库分析找出蛋白质。原始数据包括那些在TOF-MS谱图、MS/MS破裂数据中所列出的肽和一列提出的含杂质的蛋白质，该蛋白质与分离的蛋白质的Pl或分子量不符。为了进行分析，MS/MS谱图被直接提交至Ij Mascot 搜索弓 I擎在 www.Matrixscience.com。
[0294] 质谱分析
[0295]肽的分析按两种方式进行:
[0296]?所有回收的和重建成它们的正确质量的肽均直接用于肽质谱的指纹步骤以获得蛋白质的ID。
[0297]?选择充裕的和离子化良好的肽作进一步MS/MS离子碎片化，其中‘y’和‘b’离子被用于推导它们的主要结构。然后搜索这些序列的，找出蛋白质数据库中的同种，得到蛋白质至ID。
[0298]肽经离子化在LC-MS/MS系统中以带两重、三重或四重电荷的分子检出，这与在物质辅助离子化如MALDI中以带单一电荷检测出的不同。带不同电荷的肽随后在质谱步骤中被净化到它们相应的质量。然后用基于mascot搜索引擎的基质科学对这些肽的质量进行直接分析，以得到抗原的ID。根据由蛋白质数据库所获得的MOWSE得分，直接使用由质谱获取的肽的质量来确定抗原，蛋白质数据库可通过搜索引擎如MASCOT、SEQUEST和Prospector进入。对所有的蛋白质身份均使用和选择QSTAR-pulsar_I,这是由于它包括与MASCOT相匹配的来自Pepsea的最新蛋白质数据库添加。
[0299]2D印迹分析
[0300]由2D-凝胶切除的蛋白质印迹被确认为Scratch。pi和分子量完全与哺乳动物的Scratch相符。回收到含有15个匹配的肽的总和为37%序列覆盖，其中每个肽显示出与原始蛋白质的100%的同源性。
[0301]由神经胶质瘤和黑素瘤细胞系纯化得到的50kDa带的分析
[0302]由所有三种细胞系(U87MG、U118MG和A375)的质谱获得的数据均表明哺乳动物的Scratch作为抗原而结合到VB3-011上。在所有筛选的细胞系中，神经胶质瘤细胞系(U87MG和U118MG)显示出最高的得分同一性。黑素瘤细胞系A-375也显示出抗原的过度表达。除了上述细胞系外，上皮细胞系如MDA-MB-435S、PC_3、A-549和CFPAC-1也以相同的方式被筛选，除了显示出存在Scratch的截取的版本即17.823kDa蛋白质gi 115928387的MDA-MB-435S外，其余的都与原始Scratch分子的序列158-366具有100%的同源性。参见图7(SEQ ID N0:4)。由这些细胞系获得的细胞膜制备物被用于使用HA-试剂进行的对VB3-011抗原的亲和性纯化。其余的上皮细胞系未显示出可检测的蛋白质。
[0303]在手工模式和IDA两种模式下获得的TOF-MS扫描，以回收具有意义ID的最多数目的肽。见图8-10。
[0304] 回收的肽的清单和它们在哺乳动物的Scratch序列上的定位在图11 (SEQ IDNO:1)和表2(SEQ ID N0S:2和7_24)中给出。通过从头测序获得了所有存在的肽。
[0305]肽2402.1206 和 2134.9614 的 MS/MS 碎片化
[0306]一安装在纳米源上不连续的纳米喷雾头被用于此用途。碰撞能量为48V以及气幕和CAD气分别维持在25和6，和使样品循环1.667分钟(100个周期)以获得稳定的质谱离子碎片。两种肽(2402.978172 - 802.00000，3+ ；2134.985448 - 1068.500000，2+)的 MS/MS碎片化得到了图14和15中示出的碎片离子。对应于肽质量为2402.97812的肽‘PELATAAGGYINGDAAVSEGYAADAF’ (SEQ ID NO:7) 100%地定位到 Scratch 序列上，而对应于肽质量为 2134.985448 的肽 RFLAAFLAAAGPFGFALGPSSV(SEQ ID NO:2)显示出与边侧序列 100%的同源性，但与中间的序列不同，这表明确定出了一种新的序列。这种序列的存在仅解释了蛋白质上可存在的跨膜区域。数据库中可获得的哺乳动物的Scratch序列是一种假设翻译的结果，而在序列中并不存在任何跨膜区。恢复的蛋白质序列显示出与数据库中可获得的哺乳动物的Scratch蛋白质67%的同源性，表明由于存在跨膜区而存在于细胞表面。由光谱获得的其他的肽显然与哺乳动物的Scratch中的序列匹配，因此被算在主要吻合之内。离子碎片化数据进一步证实了作为VB3-011的同源抗原的Scratch的新形式的身份。
[0307]图12和13确认哺乳动物的Scratch为抗原。
[0308]讨论
[0309]使用Hybridomics? 和 ImmunoMine?Viventia 的专有平台技术(参见W097/044461)，从分离自诊断患有II级星细胞瘤的患者的外周血淋巴细胞(PBL)生成的VB3-011,其为一种IgG MAb。该抗体对其他细胞系的宿主显示出活性，这些细胞系各自代表不同的癌症适应症。尽管对多种肿瘤细胞类型显示出活性，VB3-011仅限于结合到正常组织上。VB3-011抗原被归类为具有聚糖改性的“不能印迹的”抗原，这是由于CSA的原因。。
[0310]由于CSA分子的特征在于是(1-4) GlcNAc/葡糖醛酸结构，因此它们类似由红血球凝聚素(HA)识别的外源凝集素-NeU5AC(a 2 — 6)Gal(i3 I — 4)葡糖醛酸。一种用重组HA生成的能够使基于外源凝集素的纯化得以进行的新的试剂被固定到抗-HA抗体上作为纯化试剂。细胞膜制备物用固定的HA进行亲和性纯化，洗出液进行SDS-PAGE和WB分析，然后用VB3-011抗体进行探测。VB3-011在ID-PAGE上探测出~50kDa的蛋白质，其进一步在2D-PAGE分析中解开成~36kDa的带。ID和2D印迹的LC-MS/MS分析确认了哺乳动物的Scratch是分子量为36kDa的抗原(1D-PAGE的WB分析观察到~50kDa的)，因此将剩余的归结于聚糖的存在，4-硫酸盐化的，Neu5Ac(a2 —6)Gal(i3 1 —4)葡糖醛酸。在2D-PAGE上探测到的36kDa的印迹符合哺乳动物的Scratch的分子量和等电点[(pl)，1.e.,9.7±0.2]特征。
[0311]由MS/MS碎片化分析进行的从头测序恢复的蛋白质序列获得了 17个肽中16个的67%的覆盖，显示出与数据库中的哺乳动物的Scratch序列(gi 113775236)的100%的同源性。对应于肽质量 2134.985448 的肽 RFLAAFLAAAGPFGFALGPSSV (SEQ ID NO: 2)显示出与边侧序列100%的同源性，但与中间的序列不同，这表明确定出了一种新的序列。这种序列的存在仅解释了蛋白质上可存在的跨膜区，并将Scratch置于细胞表面上而不是细胞溶质中。这是对哺乳动物的Scratch作为细胞表面的肿瘤抗原的首次报道。
[0312] 实施例2 =Scratch的与癌症相关的表汰
[0313]使用HD福尔马林固定的TMA’ s对显示出对哺乳动物的Scratch具有特异性的抗体进行肿瘤特异性测试。表3中为正常组织，表4为对肿瘤特异的细胞膜结合。在正常组织的细胞膜上没有探测到Scratch抗原。然而在各类肿瘤组织中发现了强的阳性细胞膜着色。
[0314]实施例3:作为癌症诊断的Scratch的定位
[0315]Scratch蛋白质的异常定位作为癌症的指示:如Nakakura等人，2001的描述，野生型Scratch蛋白质在细胞核内具有有限的表达模式。然而，本
【发明者】们已在细胞膜上和细胞质内建立了在肿瘤组织类型和癌细胞类型中的表达。使用现有技术已知的技术如:流式细胞术、免疫组织化学和细胞膜部分的蛋白质印迹法，可在癌细胞的细胞膜上和细胞质内建立起Scratch蛋白质和其变异体的异常表达。这种在位置上的改变可用作癌症的诊断指
/Jn ο
[0316]变异体Scratch蛋白质的细胞膜表达已由流式细胞术和细胞膜部分的蛋白质印迹法从如U-87Mg、A375、MDA-MB-435S和U118-MG的癌细胞类型中得到建立。这示于表1和图3，4和15中。
[0317]实施例4:变异mRNA的的探测作为癌症的指示
[0318]用于灵敏探测含跨膜区域的哺乳动物的Scratch的变异体mRNA的RT-PCR法:从不同类型的肿瘤细胞中分离出信使RNA，使用逆转录酶和oligo dT引物合成第一条互补DNA(cDNA)。接着利用以下引物通过PCRjf cDNA用于检测野生型Scratch的mRNA和可能的变异体，具体地跨膜突变体的表达:
[0319]5’弓丨物1:用于Wt和变异体(对应于核苷酸51-82)
[0320]5，-GCC GAC CTG GAG AGC GCC TAC GGA CGC GCC(SEQ ID NO:26)
[0321]5’引物2:用于贯穿细胞膜变异体(对应于核苷酸76-105)
[0322]5，-CGC GCC CGC TTXl TTX2 GCX3 GCX3 TTXl TTX2 GCX3 (SEQ ID NO:27)
[0323]其中Xl是T或C;X2是A或G;以及X3是A、G、C或T
[0324]3’引物:(对应于核苷酸183-210)
[0325]5’ -TGC GTA CAT GGG CTC CGG CGA CGG CCC(SEQ ID NO:28)
[0326]PCR反应包括50 μ L的反应体积，其中含有:
[0327]

【权利要求】
1.分离的抗体或抗体片段，其结合包含SEQID NO:1的氨基酸序列的蛋白质。
2.权利要求1的抗体片段，其中所述抗体片段选自Fab、Fab’、F(ab’)2、scFv、dsFv、ds-scFv、二聚体、微抗体(minibody)、双价抗体(diabody)和它们的多聚体以及双特异性的抗体片段组成的组。
3.权利要求1的分离的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段连接到不透射线的或放射性同位素、酶、荧光团、发色团、显象剂或金属离子。
4.一种组合物，其包含权利要求1-3任一项所述的分离的抗体或抗体片段和药学上可接受的赋形剂、载体、缓冲剂或稳定剂。
5.诊断癌症的试剂盒，其包含权利要求1-3任一项的分离的抗体或抗体片段和其诊断癌症的使用说明。
6.改性的bouganin与特异性识别肿瘤细胞表面上的哺乳动物的Scratch蛋白质的抗体偶联得到的免疫偶联物VB6-011，其中哺乳动物的Scratch蛋白质由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成。
7.一种组合物，其包含权利要求6的免疫偶联物和药学上可接受的赋形剂、载体、缓冲剂或稳定剂。
8.权利要求6的免疫偶联物或权利要求7的组合物在制备用于治疗或预防癌症的药物中的用途。
【文档编号】G01N33/68GK104072611SQ201410210188
【公开日】2014年10月1日 申请日期:2006年12月21日 优先权日:2005年12月21日
【发明者】弗兰西娜·C·查海尔, 格伦·麦克唐纳, 吉恩尼克·西兹尔尤 申请人:维文蒂阿生物公司