基于adp检测的发光磷酸转移酶或atp水解酶测定的制作方法

基于adp检测的发光磷酸转移酶或atp水解酶测定的制作方法
【专利摘要】本发明提供用于测定或检测酶活性的组合物和方法，所述酶包括磷酸转移酶例如激酶(例如蛋白激酶、脂质激酶和糖激酶)和ATP水解酶(例如ATP酶，例如HSP90)，所述方法使用ATP作为底物而形成ADP作为产物通过监测ADP的变化来测定或检测酶活性。
【专利说明】基于ADP检测的发光磷酸转移酶或ATP水解酶测定
[0001] 本申请为分案申请，原申请的申请日为2009年7月20日，申请号为200980138112.0 (PCT/US2009/051170)，发明名称为“基于ADP检测的发光磷酸转移酶或ATP水解酶测定”。
_2] 相关申请的交叉引用
[0003]本申请要求于2008年7月22日申请的美国专利申请顺序号61/082，775和2009年4月17日申请的美国专利申请顺序号61/170，308和2009年5月29日申请的美国专利申请顺序号61/182，372的权益，这些申请的公开内容通过引用结合到本文中
[0004]直量
[0005]因为转移酶、尤其是激酶的生理相关性、多样性和普遍存在，它们成为生化和医学研究中最重要并被广泛研究的一类酶家族。研究表明蛋白激酶和脂质激酶是许多细胞功能的关键性调节剂，所述功能包括信号转导、转录调节、细胞运动、细胞分裂以及细胞对药物、毒素和病原体的反应。
[0006]蛋白激酶在多种细胞事件的调节中起到至关重要的作用。这些酶的作用是通过将磷酸残基转移至某些胞内多肽的氨基酸，使这些蛋白质底物活化并发动包括生长、分化和细胞分裂在内的活化控制事件级联。在肿瘤生物学领域已经深入研究了蛋白激酶。据信，细胞中激酶受控活性的缺失导致形成肿瘤。制药业一直在研究靶向这些激酶的药物，以有助于治疗各种肿瘤。有超过500种蛋白激酶(大约占2-2.5%的人类基因组)涉及细胞功能的调节。它们以跨膜酶和胞质溶胶酶形式存在，并且它们使丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸氨基酸残基磷酸化。根据这样的底物特异性，可将激酶分为2组:丝氨酸/苏氨酸激酶和酪氨酸激酶。
[0007]丝氨酸/苏氨酸激酶包括环状AMP和环状GMP依赖型蛋白激酶、钙和磷脂依赖型蛋白激酶、钙和钙调蛋白依赖型蛋白激酶、酪蛋白激酶、细胞周期蛋白激酶等。这些激酶通常是胞质酶或可能通过锚定蛋白与特定细胞部分缔合。
[0008]酪氨酸激酶使酪氨酸残基磷酸化。这些特定激酶的存在数量非常少，但在细胞调节中却起到同样重要的作用。这些激酶包括某些可溶性酶例如蛋白激酶src家族和生长因子受体，例如表皮生长因子受体、胰岛素受体、血小板衍生的生长因子受体等。研究表明，许多酪氨酸激酶是跨膜蛋白，其受体结构域位于胞外，而其激酶结构域在胞内。
[0009]脂质激酶在胞内信号转导中也起到重要作用，可以分为4大类。示例性的脂质激酶包括PI3激酶和磷脂酰肌醇4-激酶。
[0010]糖激酶和其它磷酸转移酶在细胞代谢、增殖和细胞凋亡中也起到主要作用。
[0011]因为磷酸化事件涉及如此之多的细胞功能和疾病，所以鉴定激酶活性就特别重要。目前用于检测激酶活性的测定类型包括荧光共振能量转移(FRET)测定、荧光偏振(FP)测定和基于放射性的测定例如闪烁亲近测定(SPA)。用于检测激酶活性的FRET测定是利用与荧光分子连接的蛋白质或肽底物和另一荧光标记的探针。这两个荧光分子仅当底物被磷酸化并被标记探针识别后，才会邻近。因此，当被激酶磷酸化时，标记的能量通过共振传递给荧光分子(受体)。能量从较高能量供体荧光团直接传递到较低能量受体分子的能力，导致受体分子的敏化荧光并同时猝灭供体荧光。在此情况下，供体荧光因邻近受体被“猝灭”，而供体能量以非放射性方式传递给受体。依照福斯特方程，能量转移效率取决于供体和受体生色团之间的距离。在大多数情况下，在距离大于100埃时，未观察到FRET，因此FRET的存在是邻近的良好指示。因此，在利用与荧光分子连接的蛋白质或肽底物和另一荧光标记的探针而检测激酶活性的FRET测定中，如果激酶被抑制，两个荧光分子仍然分开，则不发生 FRET。
[0012]基于FRET的测定有很多缺陷，包括大量的假命中，例如因为对所测化合物的荧光干扰、狭窄的动态范围和测定所用抗体相关的表现情况。
[0013]FP测定是基于高亲和力结合剂(例如抗体、螯合原子等)与荧光标记分子的结合。例如，与磷酸化荧光标记肽结合、而不与非磷酸化荧光标记肽结合的抗体可用于激酶测定。其它方法利用与ADP(其它激酶反应的产物)结合的荧光标记抗体监测激酶活性。当荧光标记被平面偏振光激发，就以同一偏振面发射光，只要荧光标记在整个激发态保持稳定(激发态的持续时间随荧光团的不同而不同，对于萤光素(fluOToscein)为4毫微秒)。如果偏振光用于激发荧光团，可同时在与偏振面平行的平面(激发面)和与偏振面垂直的平面上监测发射光强度。FP测定需要能够以高特异性与荧光标记分子结合的高亲和性结合剂，例如抗体。当使用抗体时，抗体与特异性荧光标记分子例如肽结合所耗费的时间和成本优化是需要的。另外，在FP测定中，对于磷酸化蛋白和其它反应组分例如脂质和去垢剂而言，具有干扰偏振的潜力。
[0014]采用放射性标记的激酶测定包括SPA。在SPA中，修饰的配体特异性分子或配体捕获分子偶联于突光微球体(fIuoromicrosphere),其是灌注有物质的固相支持颗粒或小珠，所述物质当被放射性标记分子激发时可发射能量。当加入到在含有非磷酸化肽的混合物中的修饰配体例如放射性标记的磷酸肽时，仅磷酸肽被捕获到荧光微球体上，使任何结合的放射性标记肽足够邻近，以允许辐射能发射而激化荧光微球体并发射光能。如果荧光微球体的浓度是优化的，仅来自与靶标结合的放射性标记配体的信号被检测到，而无需对结合配体和游离配体进行任何分离。可在液体闪烁计数器上测量所发射的光能水平，并且该水平表示配体与靶标的结合程度。SPA需要荧光微球体因重力或经离心而沉降，为测定增加了额外的步骤和时间。另外，因为该测定所用32P的高能量，所以大部分放射性穿过而未被荧光微球体捕获。
[0015]也已经开发了其它方法用于检测激酶活性，所述方法是基于发光检测，无论是生物发光还是化学发光。通常，这些方法依赖于特异性底物和抗体、微芯片和荧光标记探针的使用、样品中的底物浓度、多步骤和试剂的使用(美国专利号6，599，711)或局限于特定激酶(Sala-Newby 等，1992)。
[0016]许多目前可用的激酶测定使用在反应期间消耗大量ATP的酶而运行良好，但对检测ATP量的少量变化而言则不够灵敏，这限制了具有低ATP周转率的激酶，例如生长因子受体激酶。相比之下，可分析这类酶的可用的测定对于激酶亚类是特异性的和/或不够敏感而不能用于大范围的激酶。
[0017]发明概沭
[0018]本发明提供用于测定或检测酶活性的组合物和方法，所述酶包括磷酸转移酶例如激酶(例如蛋白激酶、脂质激酶和糖激酶)和ATP水解酶(例如ATP酶，例如HSP90)，所述方法使用ATP作为底物而形成ADP作为产物通过监测ADP的变化来测定或检测酶活性。为了监测ADP的形成，ADP转化为ATP并使用ATP依赖型生物发光反应例如萤光素酶/萤光素反应，以检测ATP。在需要ATP的生物发光反应例如萤光素酶介导的反应，以及通过核苷酸激酶例如ADP到ATP转化酶催化的ADP到ATP的转化之前，在激酶或ATP酶反应之后的ATP剩余量基本上减少到例如是所形成的ADP或反应混合物最初存在的ATP量的小于2%、I %,0.75%,0.5%,0.25 %,0.1 %,0.075%,0.05 %,0.025 0.02 %,0.01 %,0.001 %、0.0001%或以下，或消除。在一个实施方案中，使用腺苷酸环化酶例如细菌腺苷酸环化酶以将剩余ATP转化为cAMP，cAMP是对ADP转化酶反应或ATP依赖型生物发光反应没有作用或没有明显作用的一种产物。一旦剩余ATP减少到最少量或消除时，使用能将ADP转化为ATP的酶例如腺苷酸激酶(肌激酶)、肌酸激酶或丙酮酸激酶等，将激酶或ATP酶反应中所形成的ADP转化为ATP。在某些实施方案中，在将溶液中的ADP转化为ATP或进行生物发光反应之前，将ATP转化为非ADP产物的酶的活性受到抑制。当在此情况下，将ATP转化为非ADP产物的酶将不会干扰从ADP生成ATP或用生物发光反应来检测ATP。然后使用由生物发光反应所生成的光来检测新形成的ATP，例如用发光计来测量。一般而言，将ADP转化为ATP、再将ATP转化为光的方法包括:将包含生物发光产生酶、生物发光底物、ADP到ATP转化酶和任选(如果需要的话)ADP到ATP转化酶的底物的组合物，加入到具有由激酶或ATP酶反应所产生的ADP的反应混合物中；所述生物发光产生酶例如萤光素酶例如天然或重组萤光素酶例如萤火虫或叩头虫的萤光素酶，所述生物发光底物例如作为萤光素酶底物的萤光素或萤光素衍生物，所述ADP到ATP转化酶例如激酶。在使用前，通过将包含并非萤光素酶的试剂的溶液加入到冻干萤光素酶中，来混合所述组合物。在另一个实施方案中，在使用前，通过将包含并非萤光素酶和萤光素或萤光素衍生物的试剂的溶液加入到冻干萤光素酶和冻干萤光素或其衍生物中，来混合所述组合物。
[0019]本领域技术人员知道，生物发光反应表明溶液中ADP的存在与否或者提供溶液中ADP的度量。当需要检测溶液中的ADP时，可将生物发光反应结果与一个或多个标准或对照反应进行比较。
[0020]本发明也提供用于检测样品中磷酸转移酶活性例如激酶活性或ATP水解酶活性例如ATP酶活性的组合物和试剂盒。在一个实施方案中，本发明提供组合物或试剂盒，所述组合物或试剂盒包含将ATP转化为非ADP底物的分离的酶，例如将ATP转化为cAMP的腺苷酸环化酶和焦磷酸酶。所述试剂盒还可包含一种或多种激酶、激酶的底物、将ADP转化为ATP的酶例如丙酮酸激酶、可被将ADP转化为ATP的酶使用的磷酸供体例如磷酸烯醇式丙酮酸、萤光素酶和/或萤光素酶的底物例如萤光素或其衍生物。
[0021 ] 所述试剂盒可任选包含将ATP转化为ADP的磷酸转移酶或ATP水解酶的一种或多种抑制剂、或有效量的腺苷酸环化酶活化剂。
[0022]可用于本文所述的方法、试剂盒或组合物的示例性的腺苷酸环化酶包括但不限于:细菌腺苷酸环化酶，例如来自以下细菌的那些:百日咳博德特氏菌(Bortedellapertussis)、炭疽芽抱杆菌(Bacillus anthracis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、大肠杆菌(Escherchia coli)、蛭弧菌(Bdellovibrio spp.)、弧菌(Vibrio spp.)、耶尔森菌(Yersinia spp.)、欧文氏菌(Erwinia spp.)、肠杆菌(Enterobacter spp.)或希瓦氏菌(Shewanella spp.)或具有腺苷酸环化酶活性的全长细菌腺苷酸环化酶的片段，例如具有腺苷酸环化酶活性的细菌腺苷酸环化酶的重组片段(例如参见图4);真核生物腺苷酸环化酶，例如钙调蛋白激活的真核腺苷酸环化酶；藻类腺苷酸环化酶，例如钝顶螺旋藻(Spirulina platenis)腺苷酸环化酶；猪、非人类灵长类、狗、牛、啮齿类或人类的腺苷酸环化酶，例如ADCY1、ADCY2、ADCY3、ADCY4、ADCY5、ADCY6、ADCY7、ADCY8、ADCY9 或 ADCYlO 或腺苷酸环化酶同种型 1、III 和 VIII (其受Ca2+/钙调蛋白的刺激)或同种型V和VI (其被Ca2+以钙调蛋白非依赖型方式抑制)，或其具有腺苷酸环化酶活性的片段。
[0023]在一个实施方案中，所述组合物或试剂盒包含一种或多种激酶抑制剂。在一个实施方案中，所述组合物或试剂盒包含一种或多种ATP酶抑制剂。在另一个实施方案中，如果所述组合物不包含磷酸转移酶例如激酶或ATP水解酶例如ATP酶的抑制剂时，可通过其它方式使磷酸转移酶或ATP水解酶的活性失活，例如在添加腺苷酸环化酶之前加热。然而，可无需让磷酸转移酶或ATP水解酶失活，以便进行本发明。在一个实施方案中，所述组合物或试剂盒包含分离的细菌腺苷酸环化酶，例如可被活化剂例如钙调蛋白活化的一种酶。在一个实施方案中，所述组合物或试剂盒包含分离的钙调蛋白刺激的细菌腺苷酸环化酶、星孢素、焦磷酸酶和任选钙调蛋白。合适的焦磷酸酶包括酵母焦磷酸酶。在另一个实施方案中，所述组合物或试剂盒包含一种或多种激酶或ATP酶的抑制剂、焦磷酸酶和腺苷酸环化酶活化剂。在一个实施方案中，所述试剂盒可包含第一组合物和第二组合物，所述第一组合物包含一种或多种激酶或ATP酶的抑制剂、焦磷酸酶和腺苷酸环化酶活化剂，而所述第二组合物包含腺苷酸环化酶。所述试剂盒可在单独容器中装有各种试剂或可在容器中合并两种以上试剂。
[0024]还提供包含腺苷酸环化酶抑制剂和任选分离的将ADP转化为ATP的ADP到ATP转化酶的组合物或试剂盒，所述抑制剂即ATP结合位点竞争者例如ATP类似物，或催化结构域抑制剂例如PMEA(9-(2-磷酰甲氧基乙基)-腺嘌呤)或PMEApp类似物。在一个实施方案中，所述组合物或试剂盒包含活化细菌腺苷酸环化酶的抑制剂，例如钙调蛋白活化的细菌腺苷酸环化酶或其具有腺苷酸环化酶活性的片段的抑制剂，以及至少一个ADP到ATP转化酶、例如腺苷酸激酶、肌酸激酶或丙酮酸激酶。在一个实施方案中，所述组合物或试剂盒包含腺苷酸环化酶抑制剂和分离的ADP到ATP转化酶的底物。在一个实施方案中，所述组合物或试剂盒还包含分离的ADP到ATP转化酶。在一个实施方案中，所述组合物或试剂盒还包含生物发光酶例如萤光素酶和生物发光酶的底物例如D-萤光素。
[0025]另外，本发明提供这样的组合物:所述组合物包含ADP到ATP转化酶、包括去垢剂在内的并能使腺苷酸环化酶失活的有效量的用于生物发光酶介导反应的试剂以及任选的ADP到ATP转化酶的底物。
[0026]还提供在包含ADP和ATP的混合物中将ATP转化为cAMP和PPi或cAMP和Pi的方法。在一个实施方案中，所述方法包括:提供用于将ATP转化为ADP的磷酸转移酶例如激酶或ATP水解酶例如ATP酶的第一反应混合物，所述第一反应混合物包含ATP和怀疑具有磷酸转移酶或ATP水解酶的样品；并且使第一反应混合物与一定量的分离的活性腺苷酸环化酶和焦磷酸酶以及任选的磷酸转移酶或ATP水解酶的一种或多种抑制剂接触，其数量能有效得到第二反应混合物，所述第二反应混合物包含cAMP、Pi和如果所述样品中存在磷酸转移酶或ATP水解酶的话，ADP0在一个实施方案中，所述方法包括:提供用于将ATP转化为ADP的激酶或ATP酶的第一反应混合物，所述第一反应混合物包含ATP和怀疑具有激酶或ATP酶的样品；并且使第一反应混合物与一定量的分离的活性腺苷酸环化酶和任选的激酶或ATP酶的一种或多种抑制剂接触，其数量能有效得到第二反应混合物，所述第二反应混合物包含cAMP、PPi和如果所述样品中存在激酶或ATP酶的话，ADP。所产生的Pi或PPi的量基本上不抑制ADP到ATP转化酶反应或ATP依赖型生物发光酶反应。在一个实施方案中，使所述第二反应混合物与腺苷酸环化酶抑制剂、ADP到ATP转化酶、任选ADP到ATP转化酶的底物、还任选生物发光酶及其底物接触，而得到第三反应混合物。因此，在加入生物发光酶及其底物例如萤光素酶和萤光素之后，或者在腺苷酸环化酶抑制剂和ADP到ATP转化酶的同时，或者在加入腺苷酸环化酶抑制剂和ADP到ATP转化酶之后，检测第三反应混合物中的发光。在一个实施方案中，将用于将ADP转化为ATP的反应混合物和生物发光酶合并在一个溶液中。对照反应包括不含磷酸转移酶或ATP水解酶的反应。
[0027]另外，本发明提供用于将ATP转化为ADP的磷酸转移酶例如激酶或ATP水解酶例如ATP酶的调节剂的鉴定方法。所述方法包括提供第一反应混合物，所述混合物包含一种或多种测试剂、一种或多种将ATP转化为ADP的磷酸转移酶或ATP水解酶例如一种或多种分离的激酶或细胞表达的重组激酶或其裂解物、以及ATP ;使第一反应混合物与一定量的至少一种分离的活性腺苷酸环化酶和至少一种焦磷酸酶、和任选一种或多种磷酸转移酶或ATP水解酶的一种或多种抑制剂接触，得到包含cAMP、Pi和ADP的第二反应混合物。使第二反应混合物与腺苷酸环化酶的一种或多种抑制剂、一种或多种ADP到ATP转化酶、生物发光酶及其底物例如萤光素酶和萤光素接触，得到第三反应混合物。因此，在加入生物发光酶及其底物之后，或者在腺苷酸环化酶抑制剂和ADP到ATP转化酶的同时，或者在加入腺苷酸环化酶抑制剂和ADP到ATP转化酶之后，检测第三反应混合物中的发光。在一个实施方案中，将用于将ADP转化为ATP的反应混合物和生物发光酶反应合并在一个溶液中。对照反应包括不含磷酸转移酶或ATP水解酶的反应或者可包含磷酸转移酶或ATP水解酶的已知抑制剂或活化剂的反应。
[0028]例如，如果在所述试剂存在时激酶或ATP酶活性小于所述试剂不存在时激酶或ATP酶活性，则在所述方法中测试的试剂就可鉴定为激酶或ATP酶的抑制剂。在一个实施方案中，如果在所述试剂存在时激酶或ATP酶活性小于所述试剂不存在时激酶或ATP酶活性的95%，则所测试剂就鉴定为激酶或ATP酶的抑制剂。在一个实施方案中，如果在所述试剂存在时激酶或ATP酶活性小于所述试剂不存在时激酶或ATP酶活性的80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%、5%、2%、1%或以下时，则所测试剂就鉴定为激酶或ATP酶的抑制剂。在还一个实施方案中，如果在所述试剂存在时激酶或ATP酶活性小于所述试剂不存在时激酶或ATP酶活性的50%，则所测试剂就鉴定为激酶或ATP酶的抑制剂。
[0029]在另一个实施方案中，如果在所述试剂存在时激酶或ATP酶活性大于所述试剂不存在时激酶或ATP酶活性，则所测试剂就鉴定为激酶或ATP酶的活化剂。在一个实施方案中，如果在所述试剂存在时激酶或ATP酶活性大于所述试剂不存在时激酶或ATP酶活性的10%，则所测试剂就鉴定为激酶或ATP酶的活化剂。在一个实施方案中，如果在所述试剂存在时激酶或ATP酶活性大于所述试剂不存在时激酶或ATP酶活性的20 %、30 %、40 %、50 %、75%、100%或200%，则所测试剂就鉴定为激酶或ATP酶的活化剂。在又一实施方案中，如果在所述试剂存在时激酶或ATP酶活性大于所述试剂不存在时激酶或ATP酶活性的至少50%,则所测试剂就鉴定为激酶或ATP酶的活化剂。
[0030]本发明因此提供用于检测样品中的磷酸转移酶例如激酶或ATP水解酶例如ATP酶活性的方法、组合物和试剂盒。在某些实施方案中，方法、组合物和试剂盒是不含抗体的，并且本文所述的均质方法是快速、灵敏、简便和非放射性的。所述方法是方便的并可与任何仪器平台一起使用。可以相对容易地设计并可容易地合成所需试剂。所述试剂可便于在许多样品中以高通量模式、长时间测定活性，因为发光反应产生高的信号稳定性，因此无需具有试剂注射器的发光计并且允许以分批模式处理多个样品。
[0031]在一个实施方案中，本发明的方法可在多孔板中的单个孔中进行，使其适用于高通量筛选方法。所述方法可在不同反应温度下用于不同量的ATP、激酶或ATP酶、测试剂或其任何组合。本发明的方法可用于检测宽范围的ADP或ATP浓度的活性，通常从大约ΙμΜ以下至大约5mM以上的ADP或ATP。在某些实施方案中，采用本文所述的方法、组合物或试剂盒可检测低至 0.5 μ Μ、0.25 μ Μ、0.I μ M、0.01 μ Μ、1ηΜ、0.1ηΜ、0.0lnM, IpicoM 以下的 ADP或ATP浓度。在某些实施方案中，可检测在IOmicoliters溶液中的20nM ADP (0.2pM ADP)。例如所述方法可用于在通常低于5 μ M ATP的低浓度ATP以及大约ImM至大约5mM ATP的范围内检测激酶活性。尽管本发明的方法可用于实际含有任何量的ADP或ATP样品。
[0032]本发明的试剂盒经设计用于检测和定量检测样品中的磷酸转移酶例如激酶或ATP水解酶例如ATP酶的活性，或者检测测试剂例如文库例如组合文库中的那些对磷酸转移酶例如激酶或ATP水解酶例如ATP酶的活性的作用。在一个实施方案中，用于检测样品中的激酶或ATP酶活性的试剂盒可在一个容器中包含冻干的萤光素酶或冻干的萤光素酶和萤光素，而另一容器含有一种或多种ADP到ATP转化酶或其底物、或腺苷酸环化酶抑制剂或其组合的重配缓冲液。所述试剂盒也可提供镁或其它阳离子例如锰或钙。为了便于使用已知浓度的ADP或ATP或者激酶或ATP酶的对照试验，在所述试剂盒中还可提供装有ADP、ATP、分离的激酶或分离的ATP酶的容器。所述试剂盒也可提供例如在溶液中抑制激酶或ATP酶活性的化合物(例如星孢素)。包含激酶或ATP酶抑制剂的组合物可包含不止一种抑制剂。因此，所述试剂盒可提供一种或多种分离的ADP到ATP转化酶及任选底物，其是磷酸基团供体(例如磷酸肌酸、磷酸烯醇式丙酮酸或多磷酸)或其它分离的酶例如分离的腺苷酸环化酶，或焦磷酸酶。
[0033]在一个实施方案中，所述试剂盒包含装有缓冲液的容器，所述缓冲液例如大约PH6.0至大约pH8.0,具有分离的腺苷酸环化酶、任选一种或多种激酶或ATP酶抑制剂和任选焦磷酸酶。所述试剂盒还可额外包含装有冻干萤光素酶的单独容器，或任选包含装有腺苷酸环化酶抑制剂、激酶和任选ADP到ATP转化酶的底物的单独容器。在一个实施方案中，装有冻干萤光素酶的容器还装有作为萤光素酶底物的冻干萤光素或其衍生物。任选所述试剂盒还包含用于测定ADP的试剂盒使用说明书。
[0034]附图简沭
[0035]图1是ADP检测测定方案，其中在检测步骤之前使用腺苷酸环化酶(AC)以除去ADP形成反应之后剩余的ATP。
[0036]图2显示AC耗尽反应中存在的所有ATP的效力。
[0037]图3显示用两种细菌百日咳博德特氏菌和炭疽芽孢杆菌的AC耗尽ATP。
[0038]图4显示重组全长AC(170Kd)和催化结构域(43Kd)具有类似活性。[0039]图5显示4种钙调蛋白拮抗剂对AC的抑制。
[0040]图6显示卡米达佐(calmidazolium)对AC的抑制结果。
[0041]图7显示在ATP存在下，对检测不同浓度ADP的测定灵敏度。
[0042]图8显示在PKA激酶反应之后，当来自两种不同细菌的AC用于ADP检测测定所得的结果。
[0043]图9显示激酶或ATP酶抑制剂的任选使用，以终止激酶或ATP酶反应。
[0044]图10显示使用本发明组合物的蛋白激酶PKA滴定结果。
[0045]图11显示使用本发明组合物的PKA底物(肯普肽(kemptide))滴定结果。
[0046]图12显示使用本发明组合物，在PKA激酶反应中的ATP滴定结果。
[0047]图13显示不同抑制剂对PKA活性的作用结果。
[0048]图14显示使用本发明组合物的脂质激酶PI3滴定结果。
[0049]图15显示在使用本发明组合物的PI3脂质激酶反应中的ATP滴定结果。
[0050]图16显示使用本发明组合物的PI3脂质激酶底物(磷脂酰肌醇)滴定结果。
[0051]图17显示使用本发明组合物,渥曼青霉素(wortmanin)诱导的对PI3脂质激酶抑制的结果。
[0052]图18显示使用本发明组合物的鞘氨醇激酶(SPHK)滴定结果。
[0053]图19显示使用本发明组合物的受体酪氨酸激酶EGFR滴定结果。
[0054]图20显示使用本发明组合物，在EGFR激酶反应中的ATP滴定结果。
[0055]图21显示使用蛋白底物(MBP)和本发明组合物的MAP激酶ERK2滴定结果。
[0056]图22显示使用葡萄糖作为底物和本发明组合物的糖激酶己糖激酶滴定结果。
[0057]图23显示在使用本发明组合物的Hsp70ATP酶反应中的ATP和酶滴定结果。
[0058]图24显示在使用本发明组合物的ATP依赖型DNA酶反应中的线状DNA底物滴定研究结果。
[0059]图25显示使用本发明组合物的Na+/K+ATP酶滴定研究结果。
[0060]图26-27显示使用本发明组合物，在抑制剂和活化剂药物存在下，P-糖蛋白(Pgp)活性滴定研究结果。
[0061]图28显示使用本发明组合物的SV40大T抗原固有的解螺旋酶活性滴定的结果。
[0062]图29显示在2或3步骤中进行测定的能力并具有类似结果。
[0063]图30显示在ADP到ATP转化步骤中，肌酸磷酸激酶的使用。
[0064]图31显示在ADP到ATP转化步骤中，腺苷酸激酶(肌激酶)的替代使用。
[0065]图32显示本发明的替代使用，以便在检测细胞ATP含量之前，耗尽溶液中污染的游离ATP。
[0066]图33提供腺苷酸环化酶的示例性序列(SEQ ID NO:1_9 ；NCBI检索号.Y00545、M24074、YP016473、NP652900、AP003604、AAO1202, P15318 和 Q57506)，以及 ADP 到 ATP 转化酶的示例性序列(SEQ ID NO:10-15 ;NP_067248、NP_031736、AAC31758、AAF06820 和NP_077352)。
[0067]发明详沭
[0068]定义
[0069]除非另有说明，否则所有科技术语都具有本发明所属领域的技术人员公知的含义。所有引用的专利和出版物都通过引用全部结合到本文中，除非另有说明。
[0070]“分离的”或“纯化的”酶例如腺苷酸环化酶、激酶、ATP酶或萤光素酶是已经鉴定和分离和/或从其天然环境的成分中回收的那些。
[0071]本文所用的术语“样品”以其最广泛的含义加以使用。样品是使用本发明来分析的怀疑具有激酶或ATP酶活性的组合物。尽管通常样品是已知含有或怀疑含有激酶或ATP酶活性，任选在生长培养基或细胞裂解物中，但样品也可以是怀疑具有激酶或ATP酶活性的固体表面(例如拭子、膜、滤器、颗粒)。已经提出，对于所述固体样品，通过将固体加入到本发明的试剂组合物或另一种添加本发明试剂组合物的含水溶液中，制备含水样品。
[0072]本文所用的术语“检测”是指定量或定性检测样品中某组分的存在与否。
[0073]氨基酸序列同一性”定义为当两个序列最佳比对时，一个序列中的氨基酸残基与第二序列中的氨基酸残基在重叠区域内的相同、一致或相对的百分数。为了测定％氨基酸同一性，局部比对序列并在必要时引入空位以达到最大％的序列同一性；当计算序列同一性时，保守取代不计。测定％同一性的氨基酸序列比对程序是本领域技术人员众所周知的。公众可得的计算机软件例如BLAST软件(NCBI在www.ncb1.nlm.nih.gov/BLAST/)可用于比对肽序列。本领域技术人员可确定用于测定比对的合适算法和参数，包括得到两个氨基酸序列最佳比对所需的任何算法和参数。
[0074]当进行氨基酸序列比对时，给定氨基酸序列A与给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(也可表示为给定氨基酸序列A具有或包括与给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性)可计算如下:
[0075]%氨基酸序列同一性=(X/Y).100
[0076]其中X是通过序列比对程序或算法而在A和B最佳比对中记为相同匹配的氨基酸残基数，Y是所比对的总氨基酸位数。
[0077]本文所用的术语“发光”包括生物发光(即由活体产生光)、化学发光(当进行化学反应时产生光)和电化学发光。当所涉及的酶为发光而通过自然选择在生物体中进化，或者所涉及的酶是所述酶的突变衍生物时，发光反应也称为“生物发光反应”，所涉及的酶也称为“生物发光酶”。生物发光酶的实例包括但不限于萤火虫萤光素酶、花虫(Renilla)萤光素酶、海萤(Cypridina)萤光素酶、水母(Aequorin)发光蛋白、Gaussia萤光素酶、Oplophorus萤光素酶、奥贝林(Obelin)发光蛋白等。
[0078]本文所用的术语“发光分子(luminogenic molecule) ”是指能通过化学或生化反应而发光的分子(例如萤光素、腔肠荧光素(coelenterazine)或其功能类似物)。萤光素酶的合适的发光分子或底物包括萤光素、腔肠荧光素以及萤光素和腔肠荧光素的功能类似物。在某些实施方案中，萤光素和腔肠荧光素的功能类似物包括修饰的萤光素和腔肠荧光素，包括这些化合物的衍生物。示例性的化合物包括公开于W003/040100、W02004/027378和美国公开申请2009-0075309中的那些。
[0079]通常，发光分子是高能分子(例如稳定的二氧杂环丁烷)或它可通过化学反应转化成高能分子。化学反应通常是通过氧、超氧化物或过氧化物的氧化。在每种情况下，发光分子内的能量通过化学反应而释放。尽管这些能量中的至少某些是作为光的光子而释放，能量也可以其它形式例如热的形式释放出来。不发光的发光分子通过通常称为“暗途径”的替代方式而分散其能量。[0080]本文所用的术语“萤光素衍生物”是指具有D-萤光素基本结构并作为萤光素酶底物的一类发光分子或化合物，例如在美国申请顺序号11/444，145，Branchini等(1989)中公开的氨基萤光素或萤光素酶底物，例如在Branchini等(2002)，和Branchini (2000)中公开的萘基和喹啉基衍生物，所述文献的公开内容都通过引用结合到本发明中。
[0081]术语“抑制剂”是指能通过包括但不限于直接或间接灭活、抑制、变性或掩蔽等的任何机制而基本上减少或终止样品中的酶活性的分子、化合物或物质。
[0082]本文所用的术语“基本上将溶液中的所有ATP减少成非ADP底物”是指溶液中ATP的量减少到这样的量:允许检测溶液中从ADP产生的ATP的存在与否或测定ATP的量。在某些实施方案中，溶液中的ATP量减少到溶液中最初ATP量的不足2%，例如1%、0.75%、0.5%,0.25%,0.1%,0.075%,0.05%,0.025%,0.02%,0.01%,0.001%或 0.0001%或更低。
[0083]本文所用的术语“基本上除去所有PPi ”是指溶液中PPi的量减少到这样的量:使得生物发光反应可以检测溶液中从ADP产生的ATP的存在与否或测定ATP的量。在某些实施方案中，溶液中的PPi的量减少到溶液中最初PPi量的不足5 %，例如4 %、3 %、2 %、1%,0.75%,0.5%,0.25%,0.1 %,0.075%,0.05%,0.025%,0.02%,0.01%,0.001% 或0.0001%或更低。在某些实施方案中，用酶例如焦磷酸酶除去PPi。
[0084]本发明示例性组合物和方法
[0085]本发明提供组合物和使用这些组合物的方法，所述方法在抑制激酶或ATP酶并将任何剩余ATP转化为cAMP之后，通过检测激酶或ATP酶催化的ADP形成，而检测样品中的激酶或ATP酶活性。所形成的ADP再转化为ATP，用于生物发光反应，例如与萤光素酶介导的反应结合，任选在单个步骤中，然后再通过检测所发的光。在一个实施方案中，使用本发明组合物与样品而产生的光具有延长的持续时间，即减少到每小时小于约50%，相对于最后的组合物刚与样品混合之后的发光而言。
[0086]用于所述方法的样品可包含细胞、细胞裂解物、裂解物的亚细胞部分例如膜部分，或无细胞样品，并包括生理样品。本发明范围之内的细胞包括原核细胞和真核细胞，包括植物细胞和脊椎动物细胞，例如哺乳动物细胞包括但不限于:人、非灵长类的人类(non-primate human)、牛、马、绵羊、猪、山羊、猫、狗、紹、B齿齿类或禽类的细胞。包含细胞的样品可经处理，使样品中的细胞渗透或裂解。渗透、裂解或破碎细胞或其亚细胞部分的方法是本领域众所周知的。各种仪器可用于机械破碎，包括超声波仪(超声波发生器)、杜恩斯勻衆器(dounce)、研钵和乳钵、或法式压榨(French press)。可通过渗压振荡,通过例如一系列冻融循环或快速改变环境离子强度等处理，或者通过使用直接破坏细胞膜的试剂(例如溶菌酶等酶，或化学试剂例如去垢剂或表面活性剂例如两性离子型和非离子型去垢剂或阳离子型去垢剂DTAB或CTAB，以及抗菌药物例如多粘菌素B和氯己定)，来破碎细胞(产生细胞裂解物)。
[0087]样品中的细胞，例如在包括真核细胞例如酵母细胞、禽类细胞、植物细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞在内的样品中的细胞，包括但不限于人、猿、鼠、狗、牛、马、猫、绵羊、山羊或猪的细胞，原核细胞，来自两种以上不同生物体的细胞，或细胞裂解物，可以是未经重组技术的遗传修饰(非重组细胞)，或者可以是重组细胞，其可以是用重组DNA和/或用重组DNA稳定扩增的基因组瞬时转染的细胞，或者其基因组已经修饰以破坏基因例如破坏启动子、内含子或可读框，或用另一 DNA片段置换一个DNA片段。重组DNA或置换DNA片段可编码可用本发明方法检测的激酶或ATP酶，改变所检测激酶或ATP酶的水平或活性的一部分，和/或与改变激酶或ATP酶的水平或活性的分子或部分无关的基因产物。
[0088]在一个实施方案中，本发明减少到检测样品中的激酶或ATP酶活性所需操作的2步骤，在发光检测之前。在所述方法中，至少一部分激酶或ATP酶反应产物与腺苷酸环化酶和焦磷酸酶反应的必要成分混合，其中在激酶或ATP酶反应之后剩余的ATP转化为cAMP，而且焦磷酸被降解。至少一部分具有cAMP的反应混合物的产物与ADP到ATP转化酶反应和生物发光反应的所有必须成分混合，所述成分例如包括以下在内的成分:腺苷酸环化酶抑制剂、一种或多种ADP到ATP转化酶及其任选底物、和ATP依赖型生物发光产生酶(例如萤光素酶)以及相应发光分子。
[0089]在3步法中，至少一部分激酶或ATP酶反应产物(包括ADP和ATP)与腺苷酸环化酶和焦磷酸酶反应的必要成分混合，产生cAMP和磷酸。至少一部分所述反应产物与ADP到ATP转化酶反应的必要成分混合。至少一部分ADP到ATP转化酶反应产物与ATP依赖型生物发光酶介导的反应的必要成分混合。
[0090]用于检测、或用于筛选激酶或ATP酶的调节剂的示例性激酶和ATP酶提供如下。
[0091]表1
[0092]
【权利要求】
1.用于检测溶液中腺苷二磷酸(ADP)的存在与否或测定其含量的方法，所述方法包括: (a)使用将ATP转化为非ADP产物的酶，基本上将溶液中的所有ATP减少成非ADP产物； (b)使用能够将ADP转化为ATP和磷酸基团供体的酶，将溶液中的ADP转化为ATP;和 (c)采用生物发光反应，检测(a)中所产生的ATP的存在与否或测定其含量。
2.权利要求1的方法，所述方法还包括: (d)在(b)或(c)之前，基本上除去(a)中产生的所有焦磷酸(PPi)。
3.权利要 求1或2的方法，所述方法还包括: (e)在(b)或(c)之前，抑制将ATP转化为非ADP产物的酶。
4.权利要求1-3中任一项的方法，其中通过产生ADP的酶在溶液中产生ADP，而且所述生物发光反应提供对产生ADP的酶的度量。
5.权利要求4的方法，其中所述产生ADP的酶是将ATP转化为ADP的酶。
6.权利要求5的方法，其中所述将ATP转化为ADP的酶是激酶或ATP水解酶。
7.权利要求6的方法，所述方法还包括: (f)在(a)之前，在激酶反应或ATP水解酶反应的已知或推定抑制剂的存在或不存在下，进行所述激酶反应或ATP水解酶反应。
8.权利要求1-7中任一项的方法，其中所述将ATP转化为非ADP产物的酶是腺苷酸环化酶。
9.权利要求1-8中任一项的方法，其中所述能够将ADP转化为ATP的酶是丙酮酸激酶。
10.权利要求1-9中任一项的方法,其中所述生物发光反应包含萤光素酶和所述萤光素酶的底物。
11.权利要求2-10中任一项的方法，其中(d)用焦磷酸酶来进行。
12.用于检测溶液中的ADP的试剂盒，所述试剂盒包含: (i)将ATP转化为非ADP产物的酶； (?)能够将ADP转化为ATP的酶； (iii)磷酸基团供体； (iv)萤光素酶；和 (V)所述萤光素酶的底物。
13.权利要求12的试剂盒，所述试剂盒还包含一种或多种以下成分:(vi)焦磷酸酶； (vii)一种或多种去垢剂； (viii)—种或多种缓冲液；和/或 (ix)一种或多种盐。
14.权利要求12或13的试剂盒，其中所述将ATP转化为非ADP产物的酶是腺苷酸环化酶，所述能够将ADP转化为ATP的酶是丙酮酸激酶和/或所述磷酸基团供体是磷酸烯醇式丙酮酸。
【文档编号】G01N21/76GK103983634SQ201410211148
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2009年7月20日 优先权日:2008年7月22日
【发明者】S.A.格利, H.泽佐蒂 申请人:普罗美加公司