一种免疫球蛋白侧向层析检测系统的制作方法
【专利摘要】本发明涉及医药领域，具体涉及基于侧向层析分离技术的用于免疫球蛋白测定试纸条及其应用，该方法灵敏度高、特异性强。
【专利说明】一种免疫球蛋白侧向层析检测系统
【技术领域】
[0001]本发明涉及医药领域，具体涉及基于侧向层析分离技术的用于免疫球蛋白测定侧向层析检测系统。
【背景技术】
[0002]免疫球蛋白(immunoglobulin, Ig)是一组具有抗体活性的蛋白质,Ig由楽;细胞产生，主要存在于生物体血液和其他体液(包括组织液和外分泌液)中，约占血浆蛋白总量的20%;还可分布在b细胞表面。人血浆内的免疫球蛋白大多数存在于丙种球蛋白(Y-球蛋白)中。免疫球蛋白可以分为IgG、IgA、IgM、IgD、IgE五类，其中IgG是血清主要的抗体成分，约占血清Ig的75%。
[0003]IgA (immunoglobulin A)在正常人血清中的含量仅次于IgG,占血清免疫球蛋白含量的10?20%。从结构来看，IgA有单体、双体、三体及多聚体之分。按其免疫功能又分为血清型及分泌型两种。血清型IgA存在于血清中，其含量占总IgA的85%左右。血清型IgA虽有IgG和IgM的某些功能，但在血清中并不显示重要的免疫功能。分泌型IgA存在于分泌液中，如唾液、泪液、初乳、鼻和支气管分泌液、胃肠液、尿液、汗液等。分泌型IgA是机体粘膜局部抗感染免疫的主要抗体。故又称粘膜局部抗体。因此，特异的IgA变化与某些粘膜疾病相关，如EB病毒VCA抗原特异性IgA升高与鼻腔疾病密切相关。
[0004]IgM占血清免疫球蛋白总量的5% -10%，血清浓度约lmg/ml。单体IgM以膜结合型(mlgM)表达于细胞表面，构成B细胞抗原受体(BCR)。分泌型IgM为五聚体，是分子量最大的Ig，沉降系数为19S，称为巨球蛋白，一般不能通过血管壁，主要存在于血液中。五聚体IgM含10个Fab段，有很强的抗原结合能力；含5个Fe段，比IgG更易激活补体。天然的血型抗体为IgM，血型不符的输血可致严重溶血反应。IgM是个体发育过程中最早合成和分泌的抗体，在胚胎发育晚期的胎儿即能产生IgM，故脐带血IgM升高提示胎儿有宫内感染(如风疹病毒或巨细胞病毒等感染)。IgM也是初次体液免疫应答中最早出现的抗体，是机体抗感染的“先头部队”;血清中检出IgM提示新近发生感染，可用于感染的早期诊断。膜表面IgM是B细胞抗原受体的主要成分。只表达mlgM是未成熟B细胞的标志。在感染过程中IgM首先出现，但持续时间不长，是近期感染的标志。因此，特异性IgM测定对感染性疾病的早期判定，以进行早期治疗有重要的临床诊断价值。
[0005]免疫球蛋白E(IgE)是一类具有δ链的亲同种细胞抗体，是参与过敏性鼻炎、过敏性哮喘和湿疹等发病机制调节的主要抗体。自1966年日本学者Ishizaka发现IgE以来，有关IgE的研究已取得重大进展，并先后在肥大细胞、嗜碱细胞、嗜酸细胞和巨噬细胞表面发现了 IgE受体,还分别从各种过敏性疾病患者包括过敏性哮喘患者血清中分离出针对多种花粉、尘螨、霉菌和动物皮毛的特异性IgE，近年证实许多细胞因子如IL-4、Y-干扰素均参与了 IgE合成的调节。IgE抗体既能启动速发相过敏反应,也可诱发迟发相过敏反应。
[0006]血液中特异的免疫球蛋白含量测定方法有免疫比浊法、侧向层析法、ELISA等，其中，免疫比浊法简单经济，可自动化，需时短；ELISA法检测敏感度高、特异好，但是两种方法均需相应的仪器设备，而侧向层析法则可直接进行结果判定，使用更为方便、灵活。
[0007]侧向层析技术，按其原理可分为两类，一类是以酶促反应显色为基础，以显色高度来定量；另一类则使用着色标记物如乳胶微粒、胶体硒、胶体金以及脂质体等，层析时，标记物与待测物反应形成的复合物被相应的固定在层析材料上的配体捕获而富集显色，根据层析材料上显色条带的有无或多少来定性或定量。以酶促反应显身手为基础的免疫层析技术由于待测物的定量是以试纸条上以酶活性为依据，故其测量结果受酶稳定性以及样品基质、PH值、温育时间和温度等环境因素的影响。
[0008]免疫胶体金技术是继三大标记技术(荧光素、放射性同位素和酶)后发展起来的固相标记免疫测定技术。80年代出现在临床诊断领域的胶体金免疫层析(colloidal goldimmunochromatography assay, GI CA)快速诊断试纸条是建立在金标免疫渗滤基础上的一种免疫检测技术。它具有简单快速、结果明确、无需复杂操作技巧和特殊设备、敏感度高、携带方便等优点，己成为临床实验诊断领域发展的一个新方向。但是，在IgM、IgA、IgD、IgE测试过程中，由于血液中高浓度的IgG竞争结合抗原，影响IgM、IgA、IgD、IgE测试的准确测定，因此欲实现对IgM、IgA、IgD、IgE的任一测定都需除去或降低IgG的干扰。
[0009]例如，肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae,Mp)大小为200nm,呈多种形态,菌落开始呈“桑葚状”，多次传代后可成“煎荷包蛋”形状，即表面隆起，中心致密，边缘不整齐的微小集落。Mp可在不含组织或细胞，而在含酵母浸出液及20%马血清的琼脂培养基中生长良好。在厌氧环境下生长缓慢。该菌能发酵葡萄糖，在含葡萄糖的培养基中可生长而产酸。此外，Mp可同时进行DNA/RNA复制，呈对半分裂增殖。Mp膜抗原能刺激人体产生补体结合抗体和生长抑制抗体。Mp细胞膜上的某些成分能同瓦塞尔(Wasserman)反应阳性血清、链球菌MG和人类红细胞I型抗原抗血清起交叉反应。
[0010]肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae, Mp)是人类支原体肺炎(或称原发性非典型性肺炎)的病原体，主要经飞沫传染，潜伏期2-3周，发病率以青少年和儿童较高。临床症状较轻或无症状，若有也只是头痛、咽痛、发热、咳嗽等一般的呼吸道症状，多在秋冬时节发生。
[0011]肺炎支原体的诊断方法主要依靠分离培养和血清学试验，其中血清学试验常用补体结合试验、酶联免疫吸附试验(ELISA)等。
[0012]人体感染肺炎支原体后，能产生特异性IgM、IgG、IgA抗体。IgM抗体出现早，一般在感染后I周出现，3-4周达高峰，以后逐渐降低。由于肺炎支原体感染的潜伏期为2-3周，当患者出现症状而就诊时，IgM抗体已达到相当高的水平，因此IgM抗体阳性可作为急性期感染的辅助诊断。在传统的侧向层析系统中，通过用特定的IgG封阻剂(如高浓度抗IgG抗体)理处样本垫，样本垫IgG封阻剂可以封闭IgG抗原结合位点，降低特异性抗体与Mp结合，但是在此系统中由于IgG封阻剂与血清目标IgM—起泳动，血清中未封闭完全的Mp特异的IgG会竞争结合金标结合物(GC-Mp)，干扰IgM的测定。此外，由于IgG封阻剂通常结合人IgG保守区而对可变区结合能力很低，因此其封阻效率也会严重影响IgM的测定。因此，开发肺炎支原体IgM测试试纸条在肺炎支原体感染的辅助诊断中有重要价值。
[0013]综上所述。能够适应临床快速准确测定特异性免疫球蛋白的方法是迫在眉睫的。
【发明内容】
[0014]为了解决上述技术问题，本发明提供了一种特别的侧向层析检测系统，其原理是具有网状结构的样本垫可以固定特定粒径的乳胶微粒，进而将通过共价健与乳胶微粒结合的ant1-1gG固定于样本垫。利用样本垫上固定的anti_IgG捕获样本中的IgG,使IgG与IgM、IgA、IgE分离，然后再利用金标侧向层析系统测定特定的IgM、IgA、IgE，有效降低IgG的干扰。该方法操作简便、快速、敏感度高、特异性好。
[0015]本发明是通过以下技术方案实现的:
[0016]本发明一种用于免疫球蛋白侧向层析检测系统，包括固定有干扰物质清除试剂活化的乳胶微粒的样本垫、结合垫、NC膜，所述的免疫球蛋白为IgM、IgA、IgE中一种或一种以上。
[0017]本发明的一种用于免疫球蛋白测定侧向层析检测系统还包括吸水垫、PVC衬板及卡盒。
[0018]本发明的一种用于免疫球蛋白测定的侧向层析检测系统，包括但不限于侧向层析检测仪、侧向层析试纸、侧向层析检测板、测定试纸条等。优选为测定试纸条。
[0019]本发明所述的干扰物质清除试剂活化的乳胶微粒是指抗人IgG抗体活化的乳胶微粒(LP-ant1-1gG)。
[0020]本发明所述固定化的LP-ant1-1gG为抗人IgG抗体(anti_IgG)。
[0021]本发明所述固定化的LP-ant1-1gG为抗人IgG抗体anti_IgG与活性乳胶微粒LP通过共价偶联而得，用以与人源样本中IgG结合。优选所述固定化的LP-ant1-1gG为抗人IgG抗体ant1-1gG与活性乳胶微粒LP通过1_ (3- 二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)法价偶联而得。
[0022]本发明所述的样本垫为网状的纤维膜(Fusion5，GE)，捕获粒径2.0-2.6um乳胶微
粒，将其固定。
[0023]所述的固定的乳胶微粒可以捕获样本中IgG将其与IgM、IgA、IgE任一个分离,有效降低测定中IgG干扰，提高检测的敏感性。
[0024]本发明所述样品垫固定的ant1-1gG是羊抗人IgG全蛋白抗体ant1-whole IgG或羊抗人IgG Fe区域的抗体ant1-Fc IgG。优选所述样品垫固定的ant1-1gG是羊抗人IgG全蛋白抗体ant1-whole IgG。
[0025]优选所述的样本垫固定LP-ant1-1gG浓度为0.02-2.0mg/cm2,优选浓度为0.2-2.0mg/cm2,最佳浓度为 0.2mg/cm2。
[0026]本发明所述的免疫球蛋白优选为IgM、IgA、IgE中一种或一种以上。
[0027]本发明所述的结合垫是指涂布有胶体金标记的Mp抗原的结合垫，具体指有胶体金颗粒Colloidal Gold, CG标记的Mp抗原的结合垫,其中CG-Mp可以与样本中特异的IgM结合形成复合物。本发明所述的结合垫可以用于Mp特异性IgM结果的判定。
[0028]本发明所述的NC膜是指包被有抗人IgM(ant1-1gM)抗体的T线和抗Mp抗体的C线的NC膜分别与IgM-金标结合物和金标结合物结合。本发明所述的NC膜可以用于Mp特异性IgM结果的判断。
[0029]本发明所述的结合垫、NC膜，当测定其它特异性IgM、IgA、IgE中时，只需将抗原、特异性抗体和抗人IgM抗体替换为相应的抗原、特异性抗体和抗人IgM或IgA或IgE即可。
[0030]判定方法[0031]由于肺炎支原体IgG与IgM在血液中共存,为了降低IgM测定过程中IgG的干扰，提高敏感性，因此试纸条选用抗人IgG抗体与乳胶微粒用1-(3-二甲基氨基丙基)-3_乙基碳二亚胺(EDC)法共价偶联，形成稳定的共价化学键，获得活性乳胶微粒。将一定量的活性乳胶微粒处理样本垫，特定材料的样本垫可以固定特定粒径的乳胶微粒，活化的乳胶微粒会固定于样本垫。在样本检测的侧向层析中，由于样本中的IgG与ant1-1gG的亲和结合作用，进而与IgM分离，然后IgM通过与金标结合物结合、T线和C线的捕获，最后根据T线和C线的显色程度来判定结果。
[0032]有益效果
[0033]为了更好的说明本发明的有益效果，通过下述试验例加以说明。本发明对样本垫包被ant1-1gG种类和浓度、金标结合物和T线蛋白种类等方面进行了选择。
[0034]试验例I用涂布ant1-1gG的样本垫组装的试纸条与用固定有LP-ant1-1gG的样本垫组装的试纸条测定临床样本(100例)对比试验
[0035]1.1gM 测定
[0036]分别用涂布ant1-1gG的样本垫组装的试纸条和用固定有LP-ant1-1gG的样本垫组装的试纸条测定临床样本各100例，米用EUROIMMUN Medizinische LabordiagnostikaAG生产的抗肺炎支原体抗体IgM检测试剂盒(酶联免疫吸附法)(国食药监械(进)字2013第3404814号 )进行阴阳性判定)，计算检测系统的敏感度、特异性、阳性符合率、阴性符合率及总符合率，结果见表1。
[0037]筛选方法如下:
[0038]I)分别选用ant1-1gG涂布样本垫，LP_anti_IgG包被样本垫；
[0039]2)层析试纸条制备方法按照实施例1制备；
[0040]3)分别加入100 μ L稀释样本，室温反应15min ；
[0041]4)据显色程度判定结果，即无色为阴性，红色为阳性。
[0042]表1不同样本垫包被物的敏感度和特异性
[0043]
样本垫包被物~敏感度特异性阳性符合率阴性符合率总符合率 ant1-1gG 84% 98%97%91%93%
LP-ant1-1gG 100% 98%97%100%99%
[0044]通过表1可见,用固定有LP-ant1-1gG的样本垫组装的试纸条测定临床样本在敏感度、特异性和总有符合率都高于涂布ant1-1gG的样本垫组装的试纸条。
[0045]2.1gA 测定:
[0046]分别用涂布ant1-1gG的样本垫组装的试纸条和用固定有LP-ant1-1gG的样本垫组装的试纸条测定临床样本各100例(采用同昕生物生产的EB病毒衣壳抗原(VCA) IgA抗体检测试剂盒(酶联免疫法)(国食药监械(准)字2013第3400467号)进行阴阳性判定)，计算检测系统的敏感度、特异性、阳性符合率、阴性符合率及总符合率，结果见表2。
[0047]筛选方法如下:
[0048]I)分别选用ant1-1gG涂布样本垫，LP_anti_IgG包被样本垫；[0049]2)层析试纸条制备方法按照实施例3制备；
[0050]3)分别加入100 μ L稀释样本，室温反应15min ；
[0051]4)据显色程度判定结果，即无色为阴性，红色为阳性。
[0052]表2不同样本垫包被物的敏感度和特异性
[0053]
【权利要求】
1.一种用于免疫球蛋白侧向层析检测系统，其特征在于，包括固定有干扰物质清除试剂活化的乳胶微粒的样本垫、结合垫、NC膜，所述的免疫球蛋白为IgM、IgA、IgE中一种或一种以上。
2.如权利要求1所述的侧向层析检测系统，其特征在于，所述的干扰物质清除试剂活化的乳胶微粒是指抗人IgG抗体活化的乳胶微LP-ant1-1gG。
3.如权利要求2所述的侧向层析检测系统，其特征在于，所述的固定化的LP-ant1-1gG为抗人IgG抗体ant1-1gG与活性乳胶微粒LP通过共价偶联而得，用以与人源样本中IgG结合 。
4.如权利要求3所述的侧向层析检测系统，其特征与活性乳胶微粒在于，所述的固定化的LP-ant1-1gG为抗人IgG抗体ant1-1gG LP通过1_ (3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)法价偶联而得。
5.如权利要求1所述的侧向层析检测系统，其特征在于，所述的样本垫为网状的纤维膜，捕获粒径2.0-2.6um乳胶微粒，将其固定。
6.如权利要求3或4所述的侧向层析检测系统，其特征在于:所述的ant1-1gG是羊抗人IgG全蛋白抗体ant1-whole IgG或羊抗人IgG Fe区域的抗体anti_Fc IgG。
7.如权利要求2-4任意一项所述的侧向层析检测系统，其特征在于，所述的样本垫固定 LP-ant1-1gG 浓度为 0.02-2.0mg/cm2。
8.如权利要求7所述的侧向层析检测系统，其特征在于，所述的样本垫固定LP-ant1-1gG 浓度为 0.2mg/cm2。
9.如权利要求1所述的侧向层析检测系统，其特征在于，所述的结合垫是指涂布有胶体金标记的抗原。
10.如权利要求1所述的侧向层析检测系统，其特征在于，所述NC膜为包被有特异性抗体的T线和抗人IgM或IgA或IgE抗体的C线的NC膜。
【文档编号】G01N33/558GK103983792SQ201410234215
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2014年5月29日 优先权日:2014年5月29日
【发明者】肖智, 焦守恕, 李全 申请人:同昕生物技术（北京）有限公司