一种河鲀毒素阳性质控样品及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种河鲀毒素阳性质控样品的制备方法，步骤为将鲜红鳍东方鲀取肌肉组织后均质，测定其中河鲀毒素的含量，验证是否含有河鲀毒素，若为阳性样品，将含有毒素的阳性样品用阴性样品和分散剂稀释混匀，继续测定其中毒素的含量，达到要求后，将样品分装，适当温度下保存，对样品进行均匀性验证和稳定性分析；若为阴性样品，将河鲀毒素标准溶液添加到阴性样品中，加入分散剂混匀，测定其中河鲀毒素的含量，达到要求后，将样品分装，适当温度下保存，对样品进行均匀性验证和稳定性分析。本发明所述的质控样品制备简单，具有足够的稳定性和均匀性；保存时间长，可用于实验室质量控制。
【专利说明】一种河鈍毒素阳性质控样品及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种河飩毒素(TetiOdotoxin，TTX)阳性质控样品及其制备方法，属于食品安全检测【技术领域】。
【背景技术】
[0002]东方飩(包括红鳍东方飩(Fugu rubripes)和暗纹东方飩(Fugu obscurus)等)是目前大规模人工养殖飩类鱼种，鱼肉中的蛋白和脂类含量丰富，去毒处理后即为珍贵的美味佳肴。为了监测不同季节河飩鱼毒性，快速、准确地测定河飩鱼组织中TTX含量，区分有毒河飩和无毒河飩,实时了解常见河飩鱼的毒性差异及变化情况,十分必要建立一种快速便捷、灵敏度高、可操作性强的TTX检测方法，而制备实用的河飩毒素阳性质控样品，可在TTX检测过程中与实际样品同时检测，以衡量河飩鱼基质中河飩毒素检测结果的可靠性，对提高河飩鱼的食用安全性以便打开国内外河飩鱼市场具有重要意义；也为食品安全、环境监测、卫生检验检疫等方面的测量和研究工作提供技术支撑和量值溯源保障。
[0003]河飩鱼肉味鲜美，营养丰富，生食、烹调、加工皆宜，但由于含有剧毒的河飩毒素(Tetrodotoxin, TTX)，至今不能成为大众餐桌上的食品。河飩毒，即河飩体内含有的一种剧毒神经性毒素，亦存在于蝾螈、斑足蟾以及腹足类动物体内，是目前自然界中发现的最毒非蛋白物质之一，其毒性相当于剧毒药品氰化钾的1250倍，只需0.48mg即能致人死命，与石房蛤毒素、肉毒鱼毒素合称海洋三大公害毒素。随着渔业的发展，近年来河飩鱼中毒事件的屡见报端。在日本、中国大陆、台湾省和一些东南亚国家食用河飩鱼和腹足类动物的中毒事件时有发生，在中国尤其是食用小型腹足类动物织纹螺等中毒事件多有报道，并导致多人死亡而成为严重的公共卫生问题(P.A.Hwang et al，2007)。欧盟法规《Regulation853/2004/EC》和《Regulation854/2004/EC》规定有毒的河飩鱼及类似品种禁止在欧盟市场销售。
[0004]阳性质控样品是一种与待测样料相同或相似的，但带有溯源性确认并具有规定测量不确定度标准值的材料，在贮存量值和传递量值方面具有实物量具的特性。因而阳性质控样品对于保证检测结果的可靠性和有效性，保证检测标准在实验室间得到有效实施具有重要作用。
[0005]目前已有河飩毒素标准物质，例如国家海洋局第三研究所研制的河飩毒素标准样品(实为不含河純鱼组织基质的提纯标准品)，但河純毒素的基质标准样品尚未见研究制备的报道，
[0006]由于河飩毒素的性质微溶于水(含在脏器中的毒素能溶于水)、乙醇，浓酸，易溶于稀酸，不溶于任何中性有机溶剂，包括乙醚、甲醇、乙醇、丙酮、N，N’-二甲基甲酰胺、二甲亚砜、苯、氯仿和乙腈等。这种不易溶于任何一种中性有机溶剂的物理化学特性，以及河飩鱼组织复杂的基质效应的存在，使得河飩毒素的定量测定一直是食品检测、生态学以及医学研究领域的一个挑战。为保证检测结果的可靠性和有效性，目前亟待基体TTX阳性质控样品的研制。
【发明内容】
[0007]本发明所要解决的技术问题是:提供一种基体TTX阳性质控样品，所述的质控样品具有足够的稳定性和均匀性。
[0008]为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是:
[0009]本发明提供一种河飩毒素阳性质控样品的制备方法，包括阳性样品稀释和阴性样品标准物质添加两种方案，包括下列步骤:将鲜红鳍东方飩取肌肉组织后均质，测定其中河飩毒素的含量，验证是否含有河飩毒素，若为阳性样品，将含有毒素的阳性样品用阴性样品和分散剂稀释混匀，继续测定其中毒素的含量，达到标识含量要求后，将样品分装，适当温度下保存，对样品进行均匀性验证和稳定性分析；若为阴性样品，将河飩毒素标准溶液添加到阴性样品中，加入分散剂混匀，测定其中河飩毒素的含量，达到要求后，将样品分装，适当温度下保存，对样品进行均匀性验证和稳定性分析。
[0010]上述所述的河飩毒素阳性质控样品的制备方法，具体包括下列步骤:
[0011](I)取鲜红鳍东方飩取肌肉组织，均质机均质，均质过程中压强为25-35Mpa，均质时间采用梯度时间法，共均质三次，每次的时间分别为15-20min、10-15min、5-10min ；
[0012](2)将均质好的样品进行毒素测定，采用常规方法测定即可，根据是否含有毒素，制备方法分为阳性样品稀释和阴性样品标准添加两种；
[0013]1.阳性样品稀释:将含有毒素的阳性样品用阴性样品和分散剂稀释混匀，分散剂重量占阳性样品和阴性样品总重量的8-12%，稀释混匀采用分步稀释法，将阴性样品和分散剂平均分成3-5份，加入一份阴性样品和分散剂后均质一次，每次均质时间为3-5min ；
[0014]2.阴性样品标准添加:将河飩毒素标准溶液添加到经测定不含河飩毒素的鲜红鳍东方飩肌肉组织中，然后平均分3-5次加入分散剂混匀，每加一次分散剂均质一次，每次均质时间为3-5min，加入分散剂的总量占阴性样品总量的8-12%。
[0015](3)测定步骤(2)中样品的毒素含量；
[0016](4)毒素含量达到标识含量要求后，将样品分装，适当温度保存，对样品进行均匀性验证和稳定性分析。
[0017]优选的，步骤⑴中，肌肉组织在均质机中均质之前，将肌肉组织加热到40_50°C，均质时均质温度控制在30-40°C。肌肉组织在均质机中均质之前加热和均质过程中保持一定温度，可以更好的将毒素溶出。
[0018]所述分散剂为C18，石墨化碳、白炭黑、硅藻土中的一种或二种的组合。加入分散剂可有利于降低样品基质粘度，便于TTX毒素均匀分散在基质中，使样品稳定；也与样品检测过程中前处理过程保持一致，在样品测定过程中具有吸附杂质，净化提取液的特点。(作用原理GCB表面的碳原子之间皆为SP2杂化，有单电子对和活泼离子，并具有六边形的微观结构，使得它对于平面分子或者含有平面芳香环的分子具有强烈的吸附作用，能去除具有共轭结构的苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸和组氨酸等杂质；GCB表面总体表现为憎水性，可吸附非极性与弱极性化合物；其次表面存在一些极性位点使它能够作为离子交换剂或吸附极性化合物，在本实验的提取条件下可吸附河飩鱼风味成分谷氨酸、精氨酸、天门冬酸等，表现为广谱的吸附性能；C18也是一种非极性广谱性净化剂，能够有效吸附提取非极性杂质；而硅藻土则具有筛分作用、深层过滤和通过分子间力(范德华力)、Zeta电位和离子交换作用达到吸附杂质的效果。)
[0019]优选的，步骤(4)毒素含量达到标识含量要求后，可继续将样品冷冻干燥或烘干，做成粉状或湿粉状或浆状。
[0020]毒素的标识含量可标识为:1?10μ g/kg多个含量系列；样品量分别相当于Ig样品、2g样品、3g样品、4g样品、5g样品等，以便于与实际操作称样量一致。
[0021]优选的，样品保存条件为4°C、低温或超低温保存。
[0022]本发明还提供一种利用所述的河飩毒素阳性质控样品的制备方法获得河飩毒素阳性质控样品。(这一句是什么意思？)
[0023]本发明所述质控样品中基质河飩毒素(TTX)的天然来源包括自然生成的含毒河飩鱼或织纹螺等生物机体，但不局限于这几种。
[0024]所述质控样品中河飩毒素(TTX)来源为河飩毒素(TTX)标准物质(包括天然提纯和化学合成)。
[0025]本发明的有益效果是:
[0026]本发明所述的质控样品制备简单，具有足够的稳定性和均匀性；保存时间长，可用于实验室质量控制。所加入的分散剂具有分散、稳定、有助于分析检测程序中前处理过程的提取净化等功能。
【具体实施方式】
[0027]结合实施例对本发明作进一步具体描述，但不局限于此。
[0028]制备和配方实施例1 (空白基质标准添加法，配方为C18和石墨化碳粉末，此例中添加剂C18和石墨化碳比例为1:1)
[0029]I)取样并初步检测TTX含量取人工养殖的鲜红鳍东方飩，剪开背部表皮取肌肉部分并避免取到血液和内脏，得到400g肌肉组织，用分析研磨机(IKA A11B25)均质后分析测定，结果为该样品中不含有河飩毒素；2)加标混匀加入含有20 μ g TTX的标准溶液，混匀15min ；3)加入分散剂和稳定剂平均分3_5次加入分散剂(C18和石墨化碳粉末各20g)混勻，每加一次分散剂均质一次，每次均质时间为3-5min，加入分散剂的总量占阴性样品总量的10 %，充分混匀后用HPLC-MS/MS方法测定TTX含量，测定结果在可接受范围内，再测定进行均匀性检查；4)分装、冻存、稳定性检查准确称取1.1Og样品于50ml聚丙烯离心管中(相当于1.0Og河飩鱼肉样品)，加盖密封，于-20摄氏度保存，以I个月，2个月，半年，一年为间隔进行稳定性考查。
[0030]制备和配方实施例2 (空白基质标准添加法，配方为C18和石墨化碳粉末，此例中添加剂C18和石墨化碳比例为2:1)
[0031]I)取样并初步检测TTX含量取人工养殖的鲜红鳍东方飩，剪开背部表皮取肌肉部分并避免取到血液和内脏，得到400g肌肉组织，用分析研磨机(IKA A11B25)均质后分析测定，结果为该样品中不含有河飩毒素；2)加标混匀加入含有20 μ g TTX的标准溶液，混匀15min ；3)加入分散剂和稳定剂平均分3_5次加入分散剂(C18和石墨化碳粉末分别26.7和
13.3g)混匀，每加一次分散剂均质一次，每次均质时间为3-5min，加入分散剂的总量占阴性样品总量的10%，充分混匀后用HPLC-MS/MS方法测定TTX含量，测定结果在可接受范围内，再测定进行均匀性检查；4)分装、冻存、稳定性检查准确称取1.1Og样品于50ml聚丙烯离心管中(相当于1.0Og河飩鱼肉样品)，加盖密封,于-20摄氏度保存，以I个月，2个月，半年，一年为间隔进行稳定性考查。
[0032]配方实施例3 (配方为单一添加剂C18粉末)
[0033]I)取样并初步检测TTX含量取人工养殖的鲜红鳍东方飩，剪开背部表皮取肌肉部分并避免取到血液和内脏，得到400g肌肉组织，用分析研磨机(IKA A11B25)均质后分析测定，结果为该样品中不含有河飩毒素；2)加标混匀加入含有20 μ g TTX的标准溶液，混匀15min ；3)加入分散剂和稳定剂平均分3_5次加入分散剂(C1840g)混匀，每加一次分散剂均质一次，每次均质时间为3-5min，加入分散剂的总量占阴性样品总量的10%，充分混匀后用HPLC-MS/MS方法测定TTX含量，测定结果在可接受范围内，再测定进行均匀性检查；4)分装、冻存、稳定性检查准确称取1.1Og样品于50ml聚丙烯离心管中(相当于1.0Og河飩鱼肉样品)，加盖密封，于-20摄氏度保存，以I个月，2个月，半年，一年为间隔进行稳定性考查。
[0034]配方实施例4
[0035]添加剂配方为C18粉末，添加剂配方为C18、石墨化碳和硅藻土比例为2:2 ;1，但不局限于此。
[0036]运用实施例1
[0037]样品预处理
[0038]I)活河飩鱼冷冻处死，去皮，取其肌肉部分去筋经均质制样机充分粉碎。
[0039]2)称取试样(1.00±0.01)g于50mL聚丙烯离心管中，准确加入1%乙酸甲醇(I:99, v/v)溶液 5mL,均质 30s,于 50 °C 超声提取 25min.8000r/min*5min 离心，转移上清液至另一洁净离心管中；残渣用4mLl%乙酸甲醇溶液重复提取一次，合并上清液并于4°C 12000r/min离心5min,所得上清液待净化；
[0040]3)取1.0mL上清液于2mL EP (Eppendorf)管中，加入IOOmg石墨化碳黑(GCB)和IOOmg C18粉末剧烈润旋混合30s, 10000r/min离心5min,上层清液经0.22 μ m聚四氟乙烯-尼龙复合膜过滤后收集于塑料进样小瓶HPLC-MS/MS测定。
[0041]阳性质控样测定取50mL聚丙烯离心管包装的河飩毒素阳性质控样品(相当于河飩鱼肉基质(1.00±0.01)g)，准确加入1%乙酸甲醇(I:99, v/v)溶液5mL，均质30s，于50°C超声提取25min.8000r/min*5min离心，转移上清液至另一洁净离心管中；残渣用4mLl%乙酸甲醇溶液重复提取一次，合并上清液并于4°C 12000r/min离心5min，所得上清液待净化；其余处理同1.23)
[0042]均匀性与稳定性检验
[0043]均匀性考察
[0044]按标准样品工作导则(3)标准样品定值的一般原则和统计方法(GB/T15000.3-2008/IS0Guide35:2006)5.8进行均匀性研究，按总样本单元数N的2XN1/3随机抽取样本。
[0045]按《GB/T5009.206-2007鲜河飩鱼中河飩毒素的测定》和《高效液相色谱/串联质谱法测定河飩组织中TTX》检测，每个样品重复测试2次，;采用方差分析法(F-检验)检验样品的瓶间均匀性。样品均匀性检验结果见表I。
[0046]表I河飩毒素阳性质控样品均匀性检验结果(μ g/kg)[0047]
【权利要求】
1.河飩毒素阳性质控样品的制备方法，包括对阳性样品进行稀释和对阴性样品进行标准物质添加两种制备方案，其特征在于，包括下列步骤:将鲜红鳍东方飩取肌肉组织后均质，测定其中河飩毒素的含量，验证是否含有河飩毒素，若为阳性样品，将含有毒素的阳性样品用阴性样品和分散剂进行稀释混匀，继续测定其中毒素的含量，达到标识含量要求后，将样品分装，适当温度下保存，对样品进行均匀性验证和稳定性分析；若为阴性样品，将河飩毒素标准溶液添加到阴性样品中，加入分散剂混匀，测定其中河飩毒素的含量，达到标识含量要求后，将样品分装，适当温度下保存，对样品进行均匀性验证和稳定性分析。
2.根据权利要求1所述的河飩毒素阳性质控样品的制备方法，其特征在于，具体包括下列步骤: (1)取鲜红鳍东方飩取肌肉组织，均质机均质，均质过程中压强为25-35Mpa，均质时间采用梯度时间法，共均质三次，每次的时间分别为15-20 minUO-15 min、5_10 min ； (2)将均质好的样品进行毒素测定，采用常规方法测定即可，根据是否含有毒素，制备方法分为阳性样品稀释和阴性样品标准物质添加两种； 阳性样品稀释:将含有毒素的阳性样品用阴性样品和分散剂稀释混匀，分散剂重量占阳性样品和隐形样品总重量的8-12%，稀释混匀采用分步稀释法，将阴性样品和分散剂平均分成3-5份，加入一份阴性样品和分散剂后均质一次，每次均质时间为3-5min ； 阴性样品标准物质添加:将河飩毒素标准溶液添加到经测定不含河飩毒素的鲜红鳍东方飩肌肉组织中，然后平均分3-5次加入分散剂混匀，每加一次分散剂均质一次，每次均质时间为3-5min，加入分散剂的总量占阴性样品总量的8_12%， (3)测定步骤(2)中样品的毒素含量； (4)毒素含量达到标识要求后，将样品分装，适当温度保存，对样品进行均匀性验证和稳定性分析。
3.根据权利要求2所述的河飩毒素阳性质控样品的制备方法，其特征在于，步骤(I)中，肌肉组织在均质机中均质之前，将肌肉组织加热到40-50°C，均质时均质温度控制在30-40。。。
4.根据权利要求2所述的河飩毒素阳性质控样品的制备方法，其特征在于，所述分散剂为C18，石墨化碳、白炭黑、硅藻土中的一种或多种的组合。
5.根据权利要求2所述的河飩毒素阳性质控样品的制备方法，其特征在于，毒素含量达到标识要求后，将样品冷冻干燥或烘干，做成粉状或湿粉状或浆状。
6.根据权利要求2所述的河飩毒素阳性质控样品的制备方法，其特征在于:样品保存条件为4°C、低温或超低温保存。
7.一种利用权利要求2所述的河飩毒素阳性质控样品的制备方法获得的河飩毒素阳性质控样品。
8.权利要求7所述的河飩毒素阳性质控样品在河飩毒素检测过程中作为检测质量控制应用。
【文档编号】G01N1/28GK103983495SQ201410255502
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2014年6月10日 优先权日:2014年6月10日
【发明者】曹文卿, 林黎明, 吴振兴, 杨桂朋 申请人:山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心