一种新型荧光蛋白Frex体外检测血乳酸的方法
【专利摘要】一种新型荧光蛋白Frex体外检测血乳酸的方法，该方法是：以氧化型辅酶Ⅰ(NAD+)作氢受体，乳酸脱氢酶(LDH)催化L-乳酸和NAD+生成丙酮酸和NADH，荧光蛋白Frex特异性的与生成的NADH结合并激发荧光，荧光的强弱与乳酸的浓度成线性关系；通过记录荧光强度即可根据荧光强度推算出乳酸浓度，用已知浓度的乳酸测出的荧光强度，做出乳酸浓度标准曲线，未知浓度的乳酸样品就可从该标准曲线推算出来；它具有操作便捷，灵敏度高，检测更安全，有利于环境保护，线性范围宽等特点。
【专利说明】一种新型荧光蛋白Frex体外检测血乳酸的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种采用新型荧光蛋白Frex体外检测血乳酸的方法，属于医学检验 测定【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 乳酸是体内糖代谢的中间产物，主要由红细胞、横纹肌和脑组织产生，血液中的乳 酸浓度主要取决于肝脏及肾脏的合成速度和代谢率。在某些病理情况下（如呼吸衰竭或 循环衰竭时），可引起组织缺氧，由于缺氧可引起体内乳酸升高。另外，体内葡萄糖代谢过 程中，如糖酵解速度增加，剧烈运动、脱水时，也可引起体内乳酸升高。体内乳酸升高可引起 乳酸中毒。检查血乳酸水平，可提示潜在疾病的严重程度。同时，血乳酸测定对指导重症监 护患者救治有非常重要的作用，尤其是处理心肌梗塞、心功能不全、血流不足引起的组织缺 氧。因此，要求通过快速反应，在较短时间内提交具有诊断价值的检测结果。
[0003] 我们获得了微生物来源经改造的遗传编码荧光探针Frex，该探针特异性结合 NADH后，其开放的二聚体构象转化为封闭构象，同时在激发波长500nm，发射波长530nm有 最强荧光强度。荧光探针Frex能够精确测定人体细胞不同亚细胞结构内自由NADH分布水 平，并实时动态看到人类等哺乳动物细胞内葡萄糖代谢、线粒体呼吸链功能、氧化还原调控 条件下NADH代谢情况，并发现NADH可以自由跨膜进入细胞内调控多种生命活动。Frex荧 光探针可以特异性的高度灵敏地监测到细胞内和线粒体中微小的NADH变化，通过与能量 代谢相关的各种脱氢酶（糖酵解、三羧酸循环、磷酸戊糖途径等）相偶联，开发出新型的检 测血乳酸试剂盒。Frex只特异性的与NADH结合后发生强荧光激发，通过荧光强度可以定 量NADH的水平。Frex并不与NADH类似物如NAD+，ADP，ATP，NADP+和NADPH结合并激发荧 光，这是本发明的基础及关键。
[0004] 目前普遍使用的血乳酸测定方法有分光光度法。分光光度法是在NAD存在下，LDH 催化L-乳酸脱氢，氧化成丙酮酸。加入硫酸肼使丙酮酸不断被转换消除，并促进反应完成。 反应完成后生成的NADH与乳酸为等摩尔，在340nm波长下测定NADH的量来计算乳酸的含 量。该方法的的不足之处在于：1.线性范围窄，对于高浓度样品需经稀释后测定，带来一定 的不便。2.测试所需时间长。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，而提供一种特异性强、灵敏度高、适 用范围广，便于普及和安全的荧光蛋白Frex体外检测血乳酸浓度的方法。
[0006] 本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：以氧化型辅酶I (NAD+)作氢受体， 乳酸脱氢酶（LDH)催化L-乳酸和NAD+生成丙酮酸和NADH，荧光蛋白Frex特异性的与生成 的NADH结合并激发荧光，荧光的强弱与乳酸的浓度成线性关系；通过记录荧光强度即可根 据荧光强度推算出乳酸浓度；用已知浓度的乳酸测出的荧光强度，做出乳酸浓度标准曲线， 未知浓度的乳酸样品就可从该标准曲线推算出来。
[0007] 本发明进一步的技术方案是：所述乳酸浓度标准曲线根据如下试剂、按照表一和 表二制作而成，并根据标准曲线进行如下的推算：
[0008] 1.试剂：
[0009] ①50mmol/L乳酸标准母液；
[0010] ② 0· lmmol/L Tris-HCl 缓冲液（ρΗ8· 6);
[0011] ③ 6mmol/L NAD+溶液；
[0012] ④ 3mmol/L NADH 溶液；
[0013] ⑤终浓度为45 μ g/mL Frex蛋白溶液；
[0014] ⑥活力为3600U/L乳酸脱氢酶（LDH);
[0015] 2).检测程序：
[0016] 2). 1标准曲线的制备：
[0017] 按照以下表一和表二进行加样，加样的单位为uL;加好样后室温反应5min后检测 荧光强度（Em530/Ex500)，由此得到两条标准曲线，分别标柱为标准曲线一和标准曲线二。
[0018] 表一
[0019]
【权利要求】
1. 一种新型荧光蛋白Frex体外检测血乳酸的方法，其特征在于该方法是： 以氧化型辅酶I (NAD+)作氢受体，乳酸脱氢酶（LDH)催化L-乳酸和NAD+生成丙酮酸 和NADH，荧光蛋白Frex特异性的与生成的NADH结合并激发荧光，荧光的强弱与乳酸的浓度 成线性关系；通过记录荧光强度即可根据荧光强度推算出乳酸浓度，用已知浓度的乳酸测 出的荧光强度，做出乳酸浓度标准曲线，未知浓度的乳酸样品就可从该标准曲线推算出来。
2. 根据权利要求1所述的荧光蛋白Frex体外检测血乳酸的方法，其特征在于所述乳酸 浓度标准曲线根据如下试剂、按照表一和表二制作而成，并根据标准曲线进行如下推算：
1. 试剂： ① 50mmol/L乳酸标准母液； ② 0· lmmol/L Tris-HCl 缓冲液（ρΗ8· 6); ③ 6mmo1 /T, NAD+ 溶液； ④ 3mmol/L NADH 溶液； ⑤ 终浓度为45 μ g/mL Frex蛋白溶液； ⑥ 活力为3600U/L乳酸脱氢酶（LDH); 2).检测程序： 2. 1)标准曲线的制备： 按照以下表一和表二进行加样，加样的单位为μ L ;加好样后室温反应5min后检测突 光强度（Em530/Ex500)，由此分别得到两条标准曲线，分别标注为标准曲线一和标准曲线 --〇 表一
表一
2. 2)样品检测： 按表三进行加样，加样单位为μ L,总反应体积为lOOyL; 表二：
3).反应5min后测荧光强度，根据样品的激发荧光与Frex本底荧光的差值，在标准曲 线中可得出其在100 μ L反应体系中的乳酸浓度，再由公式求出原溶液的乳酸浓度：乳酸浓 度(mmol /1,) = X*100/a。
【文档编号】G01N21/64GK104155269SQ201410293387
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年6月25日 优先权日:2014年6月25日
【发明者】欧文斌, 严子琴, 孟凡国, 刘丽, 刘俊, 李海龙 申请人:浙江清华长三角研究院, 嘉兴博泰生物科技发展有限公司