一种用于检测待测溶液中瘦肉精含量的方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于检测待测溶液中瘦肉精含量的方法，包括：使用三聚氰胺分子修饰工作电极；合成三聚氰胺分子包裹的纳米颗粒；通过瘦肉精分子与多个三聚氰胺分子间的氢键作用，将纳米颗粒固定于电极表面；通过纳米颗粒自身的电化学性质、催化性质或其他性质，得到特定的电化学信号，从而确定瘦肉精分子的浓度。该方法简单方便，且检测灵敏度高，检测成本低廉，有望进行大规模推广应用。
【专利说明】一种用于检测待测溶液中瘦肉精含量的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及电化学检测【技术领域】，特别涉及一种检测待测溶液中瘦肉精含量的电化学检测方法。
【背景技术】
[0002]瘦肉精是一类β2-受体激动剂，能选择性兴奋β2_肾上腺素受体，如莱克多巴胺、克罗特伦、沙丁胺醇等。这类分子可以松弛支气管平滑肌，一直肥大细胞释放组织胺等炎症介质。因此，在临床上，可以将其用于支气管哮喘等疾病的治疗。但它们也有一定的毒副作用，可能引起心肌缺血或心律失常，骨骼肌振颤，返跳性支气管痉挛等症状。
[0003]由于β2-受体激动剂可以促进动物生长，导致蛋白质合成增加，显著提高瘦肉率，因此被推广至各国，作为动物生长促进剂使用，俗称“瘦肉精”，但由于它在动物体内容易蓄积残留，容易引发食品安全事故，因此在我国已经禁止在动物养殖业中非法滥用克罗特伦等β2_受体激动剂。2002年，我国最高人民法院和最高人民检察院发布公告(法释[2002]26号)，明确“瘦肉精”非法生产、销售与使用的量刑标准。然后，目前仍然有许多不法经营者在使用瘦肉精。
[0004]对于瘦肉精的检测方法，目前主要分仪器确认方法和免疫分析方法两大类。仪器确认方法包括液相色谱-质谱联用技术，气相色谱-质谱联用技术，高效液相色谱法、毛细管电泳法等。免疫分析方法主要是基于抗原-抗体的特异性结合，包括免疫层析法，电化学免疫传感器等。这些方法都有不足之处，即它们依赖于大型仪器，依赖于昂贵的试剂，因此仍然需要开发方便灵敏低成本的检测瘦肉精的新方法。
【发明内容】
[0005]针对上述不足之处，本发明的目的在于提供一种操作简便、灵敏度高、成本低廉的基于三聚氰胺分子与瘦肉精分子特异性识别的电化学检测方法。
[0006]本发明提供一种用于检测待测溶液中瘦肉精含量的方法，包括以下步骤:
[0007]步骤I)分别将三聚氰胺分子修饰于多个工作电极表面；
[0008]步骤2)合成纳米颗粒，并将三聚氰胺分子修饰于纳米颗粒表面，随后将纳米颗粒配成浓度为I?50ηΜ的溶液待用；
[0009]步骤3)分别将每个修饰有三聚氰胺分子的工作电极浸入三个或三个以上已知浓度的瘦肉精标准液中，三聚氰胺分子与瘦肉精分子间形成多个氢键，从而将瘦肉精分子捕获到工作电极表面；
[0010]步骤4)将步骤3)所得的每个捕获有瘦肉精分子的工作电极分别浸入步骤2)所得的纳米颗粒溶液中，纳米颗粒表面的三聚氰胺分子与工作电极上的瘦肉精分子部分空余基团形成氢键，从而将纳米颗粒固定于工作电极表面；
[0011]步骤5)检测每个固定有纳米材料的工作电极的电化学响应，确定瘦肉精标准液的浓度与电化学信号的关系，绘制瘦肉精浓度与电化学信号的标准曲线图；[0012]步骤6)将步骤I)得到的修饰有三聚氰胺分子的工作电极依次浸入待测溶液和步骤2)所得的纳米颗粒溶液中，检测工作电极的电化学响应，并与标准曲线图比较从而获知待测溶液中瘦肉精的含量。
[0013]优选的是，所述的用于检测待测溶液中瘦肉精含量的方法，所述工作电极为金电极或碳电极。
[0014]优选的是，所述的用于检测待测溶液中瘦肉精含量的方法，所述步骤2)中纳米颗粒为半导体量子点或金属纳米颗粒。
[0015]优选的是，所述的用于检测待测溶液中瘦肉精含量的方法，所述金属纳米颗粒为金纳米颗粒或银纳米颗粒或钼纳米颗粒。
[0016]优选的是，所述的用于检测待测溶液中瘦肉精含量的方法，所述步骤2)中纳米颗粒的合成方法为水热法或微波法。
[0017]优选的是，所述的用于检测待测溶液中瘦肉精含量的方法，所述步骤2)中的纳米颗粒在合成出之后、修饰有三聚氰胺分子之前进行纯化处理，纯化方法为离心或透析。
[0018]优选的是，所述的用于检测待测溶液中瘦肉精含量的方法，所述电化学响应通过循环伏安法或差分脉冲伏安法或交流阻抗法或线性扫描伏安法测得。
[0019]本发明的有益效果是:将三聚氰胺-瘦肉精分子识别体系与电化学技术有机结合，用于瘦肉精分子的定量检测，它不仅检测灵敏度高、操作方便，还克服了对大型昂贵仪器的依赖，避免了抗原抗体等昂贵试剂的使用，极大地降低了检测成本，有助于相关疾病的早期诊断。
【专利附图】
【附图说明】
[0020]图1为本发明所述的用于检测待测溶液中瘦肉精含量的电化学检测方法的流程图，其中，图中下方长方条代表电极。
[0021]图2为本发明采用循环伏安法所得检测结果图，其中，(a)三聚氰胺分子修饰电极直接浸泡纳米颗粒溶液、(b)三聚氰胺分子修饰电极先浸泡InM克罗特伦溶液后浸泡纳米颗粒溶液、(c)仅有三聚氰胺分子修饰电极的循环伏安图。
[0022]图3为本发明采用线性扫描伏安法检测不同浓度的克罗特伦的线性扫描伏安图。
[0023]图4为本发明所测得的电化学信号与克罗特伦的浓度曲线图。
[0024]图5为本发明所测的不同物质的电化学响应值，其说明了该电化学检测方法的抗干扰能力。
【具体实施方式】
[0025]下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
[0026]请参见图1，其表示了本发明的总流程，本发明提供一种用于检测待测溶液中瘦肉精含量的方法，包括以下步骤:
[0027]步骤I)分别将三聚氰胺分子修饰于多个工作电极表面待用，工作电极优选为金电极或碳电极；三聚氰胺分子可以与金自组装，三聚氰胺的氨基可以与金、银等金属表面发生共价反应；当使用碳电极作为工作电极时，要先对碳电极表面进行修饰，进行活化处理，如可以先浸泡于浓酸中，表面羧基化，随后与三聚氰胺中的氨基缩合；或者采用羧基化石墨烯物理吸附的方法来修饰碳电极。
[0028]步骤2)合成纳米颗粒，并将三聚氰胺分子修饰于纳米颗粒表面，随后将纳米颗粒配成溶液待用；纳米颗粒优选为半导体量子点或金属纳米颗粒，金属纳米颗粒优选为金纳米颗粒或银纳米颗粒或钼纳米颗粒。纳米颗粒的合成方法优选为水热法或微波法。纳米颗粒在合成出之后、修饰有三聚氰胺分子之前优选进行纯化处理，纯化方法为离心或透析，以保证纳米颗粒的纯度，提高检测精度。三聚氰胺修饰到纳米颗粒表面的原理同上所述，三聚氰胺可以与纳米颗粒自组装，三聚氰胺的氨基可以与半导体量子点或金属纳米颗粒上的金属发生共价反应。
[0029]步骤3)分别将步骤I)得到的每个修饰有三聚氰胺分子的工作电极浸入三个或三个以上已知浓度的瘦肉精标准液中，三聚氰胺分子会与瘦肉精分子间形成多个氢键，从而将瘦肉精分子捕获到工作电极表面。
[0030]步骤4)将步骤3)所得的每个捕获有瘦肉精分子的工作电极分别浸入步骤2)所得的纳米颗粒溶液中，纳米颗粒表面的三聚氰胺分子与工作电极上的瘦肉精分子部分空余基团形成氢键，从而将纳米颗粒固定于工作电极表面。
[0031]步骤5)检测每个固定有纳米材料的工作电极的电化学响应，确定瘦肉精标准液的浓度与电化学信号的关系，绘制瘦肉精浓度与电化学信号的标准曲线图；当纳米颗粒固定在工作电极表面后，电极表面的电化学环境发生改变，从而使得电极的电化学响应性能发生改变，而这一改变又和纳米颗粒的含量，进一步的说是和瘦肉精的含量呈正相关，本案正是利用这一点提出了瘦肉精检测的新方法。电化学响应可优选通过循环伏安法、差分脉冲伏安法、交流阻抗法或线性扫描伏安法测得。电化学信号其实质是反应底物得失电子的过程，而纳米颗粒在反应底物得失电子的过程中可充当催化剂的作用，例如，当使用钼纳米颗粒时，钼纳米颗粒固定在电极表面，工作电极插入双氧水溶液中，钼纳米颗粒就可以发挥催化剂的功能，把双氧水分解为水和氧气，这个过程中，电子得失的过程可以被工作电极捕获到，从而产生电化学响应。同样的，当使用银纳米颗粒时，电化学信号来自于银纳米颗粒的固态Ag/AgCl反应过程。
[0032]步骤6)将步骤I)得到的修饰有三聚氰胺分子的工作电极依次浸入待测溶液和步骤2)所得的纳米颗粒溶液中，检测工作电极的电化学响应，并与标准曲线图比较从而获知待测溶液中瘦肉精的含量。
[0033]实施例
[0034]本实施例中使用的电极为金电极，纳米颗粒为银纳米颗粒，瘦肉精为克罗特伦。
[0035]1.1、三聚氰胺分子修饰工作电极的制备
[0036]a、打磨金电极,步骤包括砂纸研磨，不同颗粒大小的三氧化二招衆研磨，乙醇/水超声，50%硝酸浸泡，0.5M硫酸电化学清洗等。
[0037]b、金电极浸泡入ImM三聚氰胺溶液中，反应6小时，然后去离子水清洗电极。
[0038]1.2、银纳米颗粒制备
[0039]制备IOOmL浓度为0.25mM的硝酸银、柠檬酸三钠溶液，并与3mL浓度为IOmM硼氢化钠溶液混合，剧烈搅拌30分钟，然后静置过夜，12000g离心30分钟，去除杂质，得到表面覆盖有分散作用的柠檬酸三钠的银纳米颗粒。然后与三聚氰胺混合，其浓度为0.1禮，反应24小时，最后12000g离心30分钟，去除杂质。
[0040]1.3、制标准曲线
[0041]配制浓度分别为0、0.01,0.0464,0.215、1.0,4.64,21.5、IOOnM 的瘦肉精(克罗特
伦)标准液，将三聚氰胺分子修饰电极浸泡入瘦肉精标准液中，孵育30分钟，将电极清洗干净，随后将电极浸泡入修饰后的银纳米颗粒中，反应30分钟并清洗干净。上述电极作为工作电极，使用钼丝电极作为对电极，饱和甘汞电极作为参比电极，构建三电极系统。利用线性扫描伏安法，测得信号，将多组数据制成电信号-浓度标准曲线图。
[0042]1.4、检测克罗特伦
[0043]将三聚氰胺分子修饰电极浸泡入待检测溶液中，孵育30分钟，清洗干净，随后浸泡入修饰后的银纳米颗粒中，反应30分钟并清洗干净。上述电极作为工作电极，使用钼丝电极作为对电极，饱和甘汞电极作为参比电极，构建三电极系统。利用线性扫描伏安法，测得信号，与标准曲线图对比后得出克罗特伦的浓度。
[0044]图谱表征结果说明:
[0045]图2为本发明采用循环伏安法所得检测结果图，其中，(a)三聚氰胺分子修饰电极直接浸泡纳米颗粒溶液、(b)三聚氰胺分子修饰电极先浸泡InM克罗特伦溶液后浸泡纳米颗粒溶液、(c)仅有三聚氰胺分子修饰电极的循环伏安图。由图可知，只有在克罗特伦存在情况下，将银纳米颗粒固定于电极表面之后，线性扫描伏安图中才会有明显的电流峰(Ag/AgCl反应过程)。
[0046]图3为本发明采用线性扫描伏安法检测不同浓度的克罗特伦的线性扫描伏安图，图中曲线从上至下依次代表0、0.01,0.0464,0.215,1.0,4.64,21.5、IOOnM的克罗特伦。由图可知，克洛特伦浓度越大，固定在电极表面的银纳米颗粒越多，从而得到的峰电流值也越大。
[0047]图4为本发明所测得的电化学信号与克罗特伦的浓度曲线图。由图可知，在一定的浓度范围内，峰电流值与克罗特伦浓度的对数值呈线性相关。
[0048]图5为本发明所测的不同物质的电化学响应值，其说明了该电化学检测方法的抗干扰能力。由图可知，糖类、盐、蛋白质、氨基酸等物质对于瘦肉精分子的检测不造成明显干扰。
[0049]尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。
【权利要求】
1.一种用于检测待测溶液中瘦肉精含量的方法，其特征在于，包括以下步骤: 步骤I)分别将三聚氰胺分子修饰于多个工作电极表面； 步骤2)合成纳米颗粒，并将三聚氰胺分子修饰于纳米颗粒表面，随后将纳米颗粒配成浓度为I~50nM的溶液待用； 步骤3)分别将每个修饰有三聚氰胺分子的工作电极浸入三个或三个以上已知浓度的瘦肉精标准液中，三聚氰胺分子与瘦肉精分子间形成多个氢键，从而将瘦肉精分子捕获到工作电极表面； 步骤4)将步骤3)所得的每个捕获有瘦肉精分子的工作电极分别浸入步骤2)所得的纳米颗粒溶液中，纳米颗粒表面的三聚氰胺分子与工作电极上的瘦肉精分子部分空余基团形成氢键，从而将纳米颗粒固定于工作电极表面； 步骤5)检测每个固定有纳米材料的工作电极的电化学响应，确定瘦肉精标准液的浓度与电化学信号的关系，绘制瘦肉精浓度与电化学信号的标准曲线图； 步骤6)将步骤I)得到的修饰有三聚氰胺分子的工作电极依次浸入待测溶液和步骤2)所得的纳米颗粒溶液中，检测工作电极的电化学响应，并与标准曲线图比较从而获知待测溶液中瘦肉精的含量。
2.根据权利要求1所述的用于检测待测溶液中瘦肉精含量的方法，其特征在于，所述工作电极为金电极或碳电极。
3.根据权利要求1所述的用于检测待测溶液中瘦肉精含量的方法，其特征在于，所述步骤2)中纳米颗粒为半导体量子点或金属纳米颗粒。
4.根据权利要求3所述的用于检测待测溶液中瘦肉精含量的方法，其特征在于，所述金属纳米颗粒为金纳米颗粒或银纳米颗粒或钼纳米颗粒。
5.根据权利要求1所述的用于检测待测溶液中瘦肉精含量的方法，其特征在于，所述步骤2)中纳米颗粒的合成方法为水热法或微波法。
6.根据权利要求1所述的用于检测待测溶液中瘦肉精含量的方法，其特征在于，所述步骤2)中的纳米颗粒在合成出之后、修饰有三聚氰胺分子之前进行纯化处理，纯化方法为离心或透析。
7.根据权利要求1所述的用于检测待测溶液中瘦肉精含量的方法，其特征在于，所述电化学响应通过循环伏安法或差分脉冲伏安法或交流阻抗法或线性扫描伏安法测得。
【文档编号】G01N27/26GK104020202SQ201410300939
【公开日】2014年9月3日 申请日期:2014年6月27日 优先权日:2014年6月27日
【发明者】缪鹏, 王弼陡, 韩坤, 孙海旋, 唐玉国 申请人:中国科学院苏州生物医学工程技术研究所