一种用于hplc检测的水稻种胚中寡糖的提取方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于HPLC检测的水稻种胚中寡糖的提取方法，包括：取种胚，研磨后加入浓度为75～85％的乙醇溶液进行振荡提取，振荡提取结束后离心，得第一上清液和残渣；向所述的残渣中加入浓度为75～85％的乙醇溶液进行超声提取，超声提取结束后，离心，得第二上清液；合并所述的第一上清液和第二上清液，浓缩干燥。本发明需要样品少，损耗溶剂少，提取速度快，提高了检测效率。
【专利说明】一种用于HPLC检测的水稻种胚中寡糖的提取方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分析化学【技术领域】，尤其涉及一种用于HPLC检测的水稻种胚中寡糖 的提取方法。
【背景技术】
[0002] 遇连绵阴雨或者高温高湿天气，杂交水稻种子会出现含水量过高，甚至穗发芽现 象，穗发芽极大降低种子质量，含水量过高将增加种子加工的成本。因此在种子成熟后期合 理适度的脱水是必要的。
[0003] 脱水耐性强的种子和不耐脱水种子所含糖的种类和数量差别很大，而且脱水耐性 的变化与发育阶段和成熟程度存在显著的相关性。糖含量的多寡同脱水细胞的玻璃化进程 相关，因此研究种子脱水耐性，需要对寡糖进行仔细的研究。
[0004] 长期以来对寡糖的检测方法有：薄层色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法。薄层 色谱法具有成本低、速度快、展开时间短的优点，但同气相色谱和液相色谱比，具有测量误 差较大、不易进行定量分析的缺点。气相色谱具有高效、高速、高灵敏度和样品用量少的优 点，但进样口的高温有时会使糖的衍生物分解、甚至被进样口残留物催化。高效液相色谱因 为重现性好、检测限低、分离效果好等优点被广泛应用。而好的样品预处理方法是成功利用 HPLC分析待测物的关键环节。
[0005] 当前用于种子寡糖前处理的方法较为复杂，如VINEET KUMAR等（VINEET KUMAR, ANITARANI, et al. Sucrose and Raffinose Family Oligosaccharides(RFOs)in Soybean Seeds As Influenced by Genotype and Growing Location. J. Agric. Food Chem. 2010, 58, 5081 - 5085)在提取大豆种子中的寡糖时，需先将大豆种子在己烷中处理3 小时，处理后的种子在80%的乙醇中水浴浸提4小时，提取液用醋酸铅纯化两次，最后得到 的上清液经浓缩过滤后进行HPLC检测。该种提取方法所需时间长，且提取过程中用到己 烷、醋酸铅等大量的有毒试剂，另外，大豆种子与水稻种子的成分差异很大。因此，提供一种 快速、经济环保的水稻种子寡糖提取方法显得十分必要。
【发明内容】
[0006] 本发明提供了一种用于HPLC检测的水稻种胚中寡糖的提取方法，适用于样品量 较少的情况，快速、准确、环保。
[0007] -种用于HPLC检测的水稻种胚中寡糖的提取方法，包括：
[0008] (1)取种胚，研磨后加入浓度为75?85%的乙醇溶液进行振荡提取，振荡提取结 束后离心，得第一上清液和残渣；
[0009] (2)向所述的残渣中加入浓度为75?85%的乙醇溶液进行超声提取，超声提取结 束后，离心，得第二上清液；
[0010] (3)合并所述的第一上清液和第二上清液，浓缩干燥。
[0011] 本发明提取水稻种胚中的寡糖时，先用乙醇溶液进行振荡提取，然后再采用超声 进一步提取，能够尽可能多的提取出水稻种胚中的寡糖，保证检测的准确性，且振荡提取和 超声提取相配合，能够大大的缩短提取时间，且所需的样品量少，同时也能够满足HPLC检 测的样品要求。本发明所述的寡糖为蔗糖、棉子糖、果糖和葡萄糖中的一种或几种。
[0012] 适宜的固液比有利于种胚中寡糖的提取，优选的，所述振荡提取时，固液比（或料 液比）为1 :1〇〇?200,更优选为1 :150。优选的，所述超声提取时，固液比为1 :50?100， 更优选为1 :100。
[0013] 本领域人员可以理解，固液比为种胚的质量（g)与乙醇溶液的体积（ml)之比。
[0014] 提取温度和时间也会影响种胚中寡糖的释放，从而影响提取效果，温度过低，分子 运动慢，寡糖释放慢，温度过高则容易导致寡糖发生降解，另外，时间过短则不能完全的将 寡糖提取出来，而时间过长则会使杂质浸出量增加，增加对后续HPLC检测的干扰。
[0015] 优选的，所述振荡提取的温度为75?85°C，时间为25?35min。更优选的，所述 振荡提取的温度为80°C，时间为30min。
[0016] 优选的，所述超声提取的温度为15?25°C，时间为25?35min。更优选的，所述 超声提取的温度为20°C，时间为30min。超声提取时，超声功率一般为50?100W。
[0017] 合并的第一上清液和第二上清液即为含寡糖的溶液，通常需要浓缩干燥，以利于 定容进行HPLC分析，所述浓缩干燥的方法为氮气吹干。氮气吹干适用于本发明样品量较少 的溶液干燥，避免寡糖在干燥过程中发生较大的损失。所述氮气吹干的温度为35?45°C。
[0018] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0019] 本发明采用振荡提取和超声提取相结合的方式，所需样品少。不使用污染性的有 机溶剂，在降低成本的同时也更加环保。更重要的是，本发明可大大节省提取时间。
[0020] 本发明的提取方法可靠，可同时准确的提取分子量大小不同的蔗糖、棉子糖、果糖 和葡萄糖四种寡糖，能够满足高效液相色谱对样品处理的要求。
【具体实施方式】
[0021] 下面结合【具体实施方式】进一步阐释本发明。
[0022] 本发明所用仪器包括：氮吹仪，超声振荡仪、恒温水浴震荡器、高速离心机。
[0023] 对比例1
[0024] (1)第一次提取上清液：取授粉后22天采收的水稻新鲜种胚10粒，与80%乙醇溶 液混合研磨，固液比（水稻种胚质量g :乙醇溶液体积ml)为1 :150 ;研磨后，将混合液置于 80°C恒温水浴震荡器中振荡提取30min，然后16000r/min离心15min，得到第一次提取上清 液和固体残渣；
[0025] (2)第二次提取上清液：将第一次提取后的固定残渣与80%乙醇溶液混合均匀， 固液比为1 :100,80°C振荡提取30min后16000r/min离心15min，得到第二次提取上清液和 固体残渣；
[0026] (3)第三次提取上清液：将第二次提取后的固定残渣与80%乙醇溶液混合均匀， 固液比为1 :50,80°C振荡提取30min后16000r/min离心15min，得到第三次提取上清液和 固体残渣；
[0027] (4)合并三次提取的上清液，室温下氮气吹干后，得寡糖粉末；
[0028] (5)向寡糖粉末中加入超纯水溶解，0. 45 μ m滤膜过滤后用HPLC法测定寡糖（蔗 糖、棉子糖、果糖、葡萄糖）的含量。
[0029] 色谱条件：WATERS2410示差折光检测器检测，Xtimate Sugar-Ca色谱柱，流动相 为去离子水，柱温80°C，流速0. 5ml/min，进样体积为50μ 1。
[0030] 采用多次乙醇溶液提取的方法，整个寡糖的提取过程需要5. 0小时，HPLC测定结 果显示，该提取方法测得水稻种胚中蔗糖含量为14. 920 μ g/粒，棉子糖为2. 739 μ g/粒， 果糖为0. 780 μ g/粒，葡萄糖为0. 312 μ g/粒。若将第一次提取液直接氮气吹干后，溶解 过滤检测，测得水稻种胚中蔗糖含量为12. 681 μ g/粒，棉子糖为2. 314 μ g/粒，果糖为 0. 487 μ g/粒，葡萄糖为0. 253 μ g/粒，说明虽然仅经过一次提取能够缩短提取时间，但是 提取的寡糖量少，不能够准确反映水稻种子中的寡糖含量。
[0031] 实施例1
[0032] (1)取10粒授粉后22天采收的水稻新鲜种胚，称重后常温下研磨成粉末状，力口 80%乙醇溶液lml (固液比为1 :150)研磨均匀，然后置于80°C恒温振荡水浴锅中振荡提取 30min。振荡提取结束后，将混合物放至常温后，16000r/min离心15min，得第一次提取上清 液和固体残渣。
[0033] (2)向第一次提取后的固体残渣中加80%乙醇溶液0. 5ml (固液比为1 :100)，混 合均勻后置于超声振荡仪中萃取30min，超声功率为80W，超声萃取结束后，16000r/min离 心15min，得第二次提取上清液。
[0034] (3)合并两次提取上清液，室温下氮气吹干（约两个小时），得寡糖粉末。
[0035] (4)向寡糖粉末中加去离子水定容至100 μ 1，0. 45 μ m滤膜过滤后用HPLC法测定 寡糖（蔗糖、棉子糖、果糖、葡萄糖）的含量。
[0036] 步骤（2)中，超声波温度设了 10°C、2(TC和45°C共3个水平分别进行提取。
[0037] 色谱条件：WATERS2410示差折光检测器检测，Xtimate Sugar-Ca色谱柱，流动相 为去离子水，柱温80°C，流速0. 5ml/min，进样体积为50μ 1。
[0038] 结果如表1所示，超声温度为20°C对寡糖的提取效果较好，提取出的寡糖含量与 实施例1结果无显著差异，但是提取时间大大缩短，用时缩短约3小时。
[0039] 表1超声温度对水稻种胚寡糖提取的影响
[0040]
【权利要求】
1. 一种用于HPLC检测的水稻种胚中寡糖的提取方法，其特征在于，包括： (1) 取种胚，研磨后加入浓度为75?85%的乙醇溶液进行振荡提取，振荡提取结束后 离心，得第一上清液和残渣； (2) 向所述的残渣中加入浓度为75?85%的乙醇溶液进行超声提取，超声提取结束 后，离心，得第二上清液； (3) 合并所述的第一上清液和第二上清液，浓缩干燥。
2. 如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述振荡提取时，固液比为1 :100? 200。
3. 如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述振荡提取的温度为75?85°C，时 间为25?35min。
4. 如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述超声提取时，固液比为1 :50? 100。
5. 如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述超声提取的温度为15?25°C，时 间为25?35min。
6. 如权利1所述的提取方法，其特征在于，所述浓缩干燥的方法为氮气吹干。
7. 如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述氮气吹干的温度为35?45°C。
8. 如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述的寡糖为蔗糖、棉子糖、果糖和葡 萄糖中的一种或几种。
【文档编号】G01N30/02GK104090049SQ201410320770
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2014年7月7日 优先权日:2014年7月7日
【发明者】胡晋, 朱丽伟, 关亚静, 王齐天, 胡琦娟, 胡伟民 申请人:浙江大学