一种基于化学发光法的萘胺化合物的检测方法
【专利摘要】一种基于化学发光法的萘胺化合物的检测方法，本发明属于分析化学和光学DNA生物传感【技术领域】，涉及一种采用G-DNA链的类过氧化物酶催化双氧水氧化鲁米诺体系产生化学发光，根据氨基萘对化学发光信号的影响实现对氨基萘的检测。具体的采用富含G结构的DNA链，在K+及hemin溶液的体系中形成四联体G-DNA结构，此结构具有类过氧化物酶催化活性可催化双氧水氧化鲁米诺产生化学发光，当体系中存在氨基萘化合物时会对化学发光产生淬灭作用，根据浓度变化对化学发光淬灭程度的影响从而实现对氨基萘的检测。该光学DNA生物传感器具有操作简单，测定周期短，响应时间快，稳定性好，高灵敏等优点。
【专利说明】一种基于化学发光法的萘胺化合物的检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分析化学和光学DNA生物传感【技术领域】，涉及采用一种基于G-DNA类 过氧化物酶的光学DNA生物传感方法对萘胺的检测方法，此方法能快速有效的实现对水中 萘胺的检测。
【背景技术】
[0002] 芳香胺是一类重要的环境污染物，已被列为优先监控的环境污染物之一。在工业 上芳香胺用途非常广泛，作为重要的化工原料和精细化工中间体，常被用于印染、制药、医 药、农药、塑料、橡胶、纺织、陶瓷上釉和油漆等工艺生产过程，尤其是印染工业，废水常含高 浓度的芳香胺中间体，而且部分染料经过复杂的化学反应和微生物作用最终也会释放出芳 香胺污染物，从而造成环境的污染。此外，芳香胺化合物进入人体后经过体内的酶的活化作 用可对DNA造成损害，引起DNA突变，从而诱发癌症等恶性疾病（如导致膀胱癌、输尿管癌、 肾癌），对人类的健康危害极大。
[0003] 芳香胺的分析检测方法有很多种，如气相色谱法、高效液相色谱法、毛细管电泳 法、气相色谱-质谱法、液相色谱-质谱法等，这些方法能同时定量测定多种芳香胺污染物， 具有高效灵敏等特点，但是具有设备昂贵、需专业技术人员操作、样品处理繁琐、测定费时 等缺点。随着电化学技术和DNA生物传感技术的发展，DNA生物传感器作为一种新型的检测 技术亦被用于检测芳香胺污染物。Wang等应用天然小牛胸腺DNA修饰的碳糊电极生物传感 器，实现了对2-氨基萘、1-氨基蒽、2-氨基蒽、9,10-二氨基菲、1-氨基批等芳香胺类污染 物的检测。Chiti等采用天然DNA和含人工合成的含23个碱基的DNA片段修饰的丝网石墨 印刷电极传感器，对-氨基萘、2-氨基蒽、1，2-二氨基蒽醌等化合物进行了检测。Prabhakar 等应用天然小牛胸腺DNA修饰的聚吡咯-聚氯乙烯磺酸盐/氧化铟膜电极传感器，用循环 伏安法对2-氨基蒽进行了检测。然而，以DNA作为分子识别主体对芳香胺类化合物的检测 多是采用DNA修饰电极的方法，虽然这些DNA生物传感器对芳香胺类污染物具有较高的灵 敏性，但其不足之处是电极制备周期时间较长，成本相对较高，测定结果波动性大。因此，建 立、完善和发展芳香胺污染物的分析方法具有重要的研究意义，也是环境综合治理的关键 环节之一。
[0004] G-DNA是一类具有类过氧化物酶的催化活性的DNA片段，其所形成的G-DNA结构 能催化双氧水氧化鲁米诺产生化学发光，具有响应时间快，专一性高等特点。本课题组在研 究中发现，当向上述体系中加入萘胺类化合物时会影响双氧水氧化鲁米诺的化学发光，且 化学发光强度与萘胺化合物的浓度存在一定关系。而到目前为止，应用G-DNA的催化特性 催化双氧水氧化鲁米诺化学发光进而对萘胺类化合物的检测还未见报道。此化学发光法与 DNA修饰固体电极式传感器方法相比，无需将DNA修饰到电极表面，大大缩短的测定周期， 同时降低了成本，提高了灵敏度，检测的响应速度亦明显提高。这种新的萘胺类污染物的检 测方法对完善现有检测技术手段具有重要意义和较好的应用价值。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种基于化学发光法的高效、稳定检测萘胺的方法。本发 明所提供的化学发光方法条件温和，操作简单，稳定性好，特别利于快速测定，并且运用此 法对萘胺类物质的检测具有灵敏、稳定、准确的优点。
[0006] 本发明的技术方案如下：
[0007] -种基于化学发光法的萘胺化合物的检测方法，包括以下步骤：
[0008] 1)将固体G-DNA用Tris_NaC104缓冲溶液溶解并稀释到一定浓度，用漩涡振荡器 混匀，静置于室温下4_6h，备用；
[0009] 2)取适量上述步骤1)配制的G-DNA溶液加到冻存管中，向其中加入一定浓度的K+ 及hemin溶液，放置l-2h，备用；
[0010] 3)将适量一定浓度的H202、鲁米诺溶液加到冻存管中，并加入不同浓度的萘胺化 合物，用Tris-NaC104缓冲溶液稀释到一定浓度；
[0011] 4)取适量上述步骤2)制备的G-DNA溶液加到上述步骤3)冻存管体系中，进行化 学发光测定。
[0012] 优选地，上述步骤2)中所述K+浓度为2-50mM。
[0013] 优选地，上述步骤2)中所述hemin浓度为2-50 μ Μ。
[0014] 优选地，上述步骤3)中所述Η202浓度为5-20mM。
[0015] 优选地，上述步骤3)中所述鲁米诺浓度为20-500 μ Μ。
[0016] 优选地，上述步骤4)中所述G-DNA浓度为10-500ηΜ。
[0017] 优选地，上述步骤1-4)中所述溶液pH值为6-11。
[0018] 与现有技术相比本专利技术具有以下优点：
[0019] 1.本发明所采用的具有类过氧化物酶活性的G-DNA对双氧水具有较高的催化活 性；
[0020] 2.本发明所采用的化学发光法对萘胺化合物的检测具有较高的灵敏性；
[0021] 3.本发明所采用的化学发光法对萘胺化合物的检测是在溶液体系中进行测定，实 验周期短，可靠性高，成本较低；
[0022] 4.本发明采用化学发光法对萘胺化合物进行测定，具有操作简单、响应速度快等 特点。
【专利附图】
【附图说明】
[0023] 附图为不同体系测定的化学发光光谱：含有鲁米诺、H202、1-氨基萘的 Tris-NaC104缓冲溶液体系（-);含有鲁米诺、H202、G-DNA、K+及hemin的Tris-NaC10 4缓冲 溶液体系（);含有鲁米诺、H202、1-氨基萘、G-DNA、K+及hemin的Tris-NaClO^^冲溶液 体系（····）。
【具体实施方式】
[0024] 以下实施实例对本发明做更详细的描述，但所述实施不构成对本发明的限制。
[0025] 实施例1
[0026] 1)以pH = 9. 0的20mM Tris-NaC104缓冲溶液将固体G-DNA溶解，用漩涡振荡器 混匀，然后向上述体系中加入一定浓度的K+及hemin溶液，放置l-2h，形成具有类过氧化物 酶活性的G-DNA结构；
[0027] 实施例2
[0028] 控制测定体系G-DNA浓度为ΙΟΟηΜ，K+浓度为10mM，hemin浓度为2 μ M，H202浓度 为51111，鲁米诺浓度为50〇4]\1，测定不同浓度1-氨基萘（1〇111]1〇1/]^、3〇111]1〇1/]^、5〇111]1〇1/]^、 100nmol/L、200nmol/L及400nmol/L)体系化学发光强度。化学发光强度见表1。
[0029] 表1与不同浓度1-氨基萘作用后化学发光强度
[0030]
【权利要求】
1. 一种基于化学发光法的萘胺化合物的检测方法，其特征在于包括以下步骤： 1) 将固体G-DNA用Tris-NaC104缓冲溶液溶解并稀释到一定浓度，用漩涡振荡器混匀， 静置于室温下4-6h，备用； 2) 取适量上述步骤1)配制的G-DNA溶液加到冻存管中，向其中加入一定浓度的K+及 hemin溶液，放置l-2h，备用； 3) 将适量一定浓度的H202、鲁米诺溶液加到冻存管中，并加入不同浓度的萘胺化合物， 用Tris-NaC10 4缓冲溶液稀释到一定浓度； 4) 取适量上述步骤2)制备的G-DNA溶液加到上述步骤3)冻存管体系中，进行化学发 光测定。
2. 如权利要求1所述的一种基于化学发光法的萘胺化合物的检测方法，其特征在于： 配制 G-DNA 溶液为 5-20mM Tris-NaC104 缓冲溶液，pH 为 6. 0-1L 0。
3. 如权利要求1所述的一种基于化学发光法的萘胺化合物的检测方法，其特征在于： G-DNA与K+及hemin溶液作用时间为l-2h。
4. 如权利要求1所述的一种基于化学发光法的萘胺化合物的检测方法，其特征在于： G-DNA 浓度为 10-500nM，K+ 浓度为 20-50mM，hemin 浓度为 2-50 μ M，H202 浓度为 5-20mM，鲁 米诺浓度为20-500 μ Μ。
5. 如权利要求1或2所述的一种基于化学发光法的萘胺化合物的检测方法，其特征在 于：所使用的DNA序列包含可以形成G-DNA结构的DNA序列。
6. 如权利要求1-4所述的检测方法，其特征在于：氨基萘为1-氨基萘，2-氨基萘。
【文档编号】G01N21/77GK104062288SQ201410323753
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2014年7月9日 优先权日:2014年7月9日
【发明者】刘新会, 梁刚, 巩文雯, 梁宝翠, 刘冠男, 成登苗 申请人:北京师范大学