一种化学发光-胶体金免疫层析试纸条的构建及应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种化学发光-胶体金免疫层析试纸条的构建方法及应用，特别涉及一种高灵敏、可定量的化学发光-胶体金免疫层析试纸条的构建方法及应用。所述方法是将化学发光和胶体金免疫层析方法相结合，包括：将胶体金的表面同时偶联上检测抗体和酶，形成胶体金-酶-抗体复合物，再依次将胶体金-酶-抗体复合物、包被抗体分别喷在样品结合垫和膜上，通过免疫层析反应，基于胶体金的颜色深浅实现定性检测，基于酶催化的化学发光反应的光强度实现定量检测，从而构建得到化学发光-胶体金免疫层析试纸条；将所述试纸条应用于生物大分子和小分子的检测。本发明可同时实现定性、定量和高灵敏的检测，适合现场检测和家庭个性化诊断。
【专利说明】一种化学发光-胶体金免疫层析试纸条的构建及应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及免疫检测分析领域，具体涉及一种免疫层析试纸条的构建方法及应用，尤其涉及一种化学发光-胶体金免疫层析试纸条的构建及应用。
【背景技术】
[0002]实现农兽药残留、传染性的动植物致病菌、病毒以及临床样品中目标物的快速、灵敏、低成本的检测和诊断对保护人类健康及生命安全、保障环境和国门安全、维护社会稳定具有重要的意义。
[0003]目前比较成熟的检测方法主要包括仪器分析法、微生物检测法、分子生物学和免疫学检测等方法。
[0004]仪器分析法具有灵敏度高，稳定性好等优点，但仪器分析法需要复杂的样品前处理，仪器比较昂贵，检测成本也比较高，不适合大规模的样品筛查和现场快速检测。例如CN102928531A公开了一种鸡肉中喹啉黄的仪器分析法。
[0005]微生物检测方法简单、易行，但由于其检测灵敏度低、耗时长，无法达到现场和快速检测的要求。CN102353779A公开了一种微生物检测方法，仍无法达到高灵敏、快速检测的要求。
[0006]分子生物学方法主要是基于PCR的分析方法，具有检测灵敏度高，特异性好等优点，但需要昂贵的仪器和较高的专业技术人员操作，因此其应用受到一定的限制。
[0007]免疫学方法主要包括酶联免疫分析和免疫层析试纸条的方法，酶联免疫方法具有简单、灵敏度比较高、成本低等优点，适合于大规模样品筛查，但其需要多步洗涤，比较耗时耗力，因此其使用也受到一定的限制。
[0008]胶体金免疫层析方法将免疫层析快速分离和反应的优势和胶体金优异的光学性能结合起来，具有快速、简单、低成本等优点，在食品安全，环境监测和临床诊断等领域得到了广泛地应用，是一种特别适合现场、快速和床边诊断的分析方法，但其灵敏度相对比较低，不能实现定量检测。提高其灵敏度，实现定量化检测将是胶体金免疫层析方法重要的发展方向。
[0009]化学发光反应具有灵敏度高，抗干扰能力很强，特别适合于生物样品中痕量目标物的检测，特别是化学发光属于自发光，因此不需要特殊、昂贵的仪器来激发其发光，所以将化学发光作为检测信号具有其特有的优势。目前，基于辣根过氧化物酶(HRP)催化的鲁米诺化学发光免疫分析系统在食品安全、环境监测、临床诊断等领域得到了广泛地应用。
[0010]目前常用的方法主要是将胶体金法和化学发光免疫法联合使用。如“胶体金法和化学发光免疫法联合检测血HCG分析”，菜爱玲等，中国误诊学杂志，第12卷第4期，第799页，2012年；“化学发光法联合胶体金法检测血清b-HCG”，陈仲平，放射免疫学，第20卷第I期，2007年；都公开了分别采用胶体金和化学发光免疫法先后检测血HCG，利用该方法仍然是两种方法单独进行检测，依然存在检测成本高、耗时耗力的缺陷。CN101113980A公开了一种检测猪胸膜肺炎抗体的胶体金化学发光免疫分析方法，该方法是在ELISA的基础上，用胶体金作为一种标记物，并用强酸溶解后，生成AuC14_离子，再利用化学发光进行检测。该方法仍无法同时实现定性和定量检测，检测步骤较复杂。
【发明内容】
[0011]本发明的目的在于提供一种既可定性又可定量的免疫层析试纸条的构建及应用，特别是一种化学发光-胶体金免疫层析试纸条的构建及应用。基于酶的化学发光反应和免疫层析反应，实现了化学发光免疫分析和胶体金免疫层析的有机结合，它具有灵敏度高，既可定性又可定量的特点。
[0012]为达到此发明的目的，本发明采用以下技术方案:
[0013]一种化学发光-胶体金免疫层析试纸条的构建方法，其特征在于，具体步骤如下:
[0014]I)将检测抗体和酶分子按比例加到胶体金溶液中，使胶体金的表面同时偶联上检测抗体和酶分子，形成胶体金-酶-抗体复合物溶液，将所述复合物溶液喷在结合物垫上；
[0015]2)将包被抗体液喷到膜上形成检测线1，将羊抗小鼠二抗液喷到膜的另一区域形成控制线2 ；
[0016]3)将样品垫、步骤I)所制得的结合物垫、步骤2)所制得的膜、吸水垫依次粘贴在塑料底衬上，组装成化学发光-胶体金免疫层析试纸条。
[0017]本发明采用将胶体金的表面同时偶联上检测抗体和酶分子，一方面，胶体金的颜色深浅可以作为一种可视化的信号分子；另一方面，由于胶体金的比表面积大，其表面可以偶联大量的酶分子，不仅能够实现信号的放大，而且其表面偶联的酶分子量也可以作为一种可定量的催化化学发光的信号分子，因而本发明实现了定性和定量的同时检测。
[0018]图2中的图a表示样品中没有目标物时，检测线I没有化学发光信号和胶体金条带颜色信号，而控制线2有化学发光信号和胶体金条带颜色信号；图b表示样品中有目标物存在的情况下，通过抗体-抗原的识别作用，会形成双抗夹心结构。胶体金-酶-抗体复合物会被捕获在检测线I上，检测线I上的胶体金的被捕获量与样品中目标物的含量呈正相关，进而化学发光强度和胶体金条带颜色的信号与目标物的含量成一定的正相关，从而同时实现了定性和定量检测。
[0019]作为优选技术方案，步骤I)所述酶选自辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(ALP)，优选为辣根过氧化物酶(HRP)。
[0020]作为优选技术方案，步骤I)所述的胶体金-酶-抗体复合物的制备包括以下步骤:
[0021 ] 调节胶体金溶液的pH值，然后加入抗体和酶，在室温下振荡反应，然后加入BSA溶液封闭多余的位点，反应并离心后，去掉上清，加入PBS溶液，重悬，再离心，该步骤重复2-3次，最后得到表面既修饰有抗体，同时偶联有酶的复合物，在4°C冰箱保存。
[0022]优选地，所述胶体金溶液的pH值调整为7.0-9.0，例如可以是7.0、7.1、7.3、7.5、
7.8,8.0,8.2,8.5,8.7 或 9.0 ;优选为 7.1-8.5 ;更优选为 8.5。
[0023]优选地，所述酶和抗体的偶联比例为100-1:1，例如可以是95-1:1、90_1:1、85-1:1、80-1:1、75-1:1、70-1:1、65-1:1、60-1:1、55-1:1、40-1:1、30-1:1、20-1:1、15-1:1、10:1 ;优选为80-5:1，更优选为10:1。
[0024]优选地，所述BSA溶液的浓度为3% ;所述PBS溶液的浓度为0.01M, pH值为7.4。
[0025]优选地，所述室温下振荡反应时间为1-2小时；加入BSA溶液封闭位点后的反应时间为0.5-1小时；所述离心时间为10-20分钟；所述离心转速为10000-12000r/min。
[0026]优选地，所述胶体金、酶和抗体偶联的方式包括静电吸附偶联，或者先构建胶体金-链霉亲和素复合物，同时制备生物素化的抗体和酶分子，通过生物素-链霉亲和素这个信号放大系统，实现胶体金-抗体-酶分子复合物的构建。
[0027]作为优选技术方案，步骤I)所述的结合物垫为玻璃纤维、聚酯纤维膜或人造纤维中的任意一种，优选为玻璃纤维。
[0028]作为优选技术方案，步骤2)所述的膜为硝酸纤维素膜(NC)、偏氟乙烯均聚物膜(PVDF)或者尼龙膜，优选为硝酸纤维素膜(NC)。
[0029]一种同时实现定性和定量检测的试纸条使用方法，采用权利要求1-7任一项所述的试纸条，包括如下步骤:
[0030]I)将待测样品加到所述试纸条上,免疫层析反应5-10min ;
[0031]2)肉眼观察所述试纸条上检测线(I)上胶体金颜色的深浅，得到所述试纸条定性检测样品的结果；
[0032]3)然后在原来的试纸条上添加化学发光底物，并用化学发光仪采集化学发光信号，化学发光强度和酶分子的量成正相关，而酶分子的量和待检抗原成线性相关，因此，通过化学发光强度得到定量检测样品的结果。
[0033]将本发明的化学发光-胶体金免疫层析试纸条用于检测生物大分子和/或小分子的应用。
[0034]作为优选技术方案，将本发明的化学发光-胶体金免疫层析试纸条用于蛋白的检测，优选甲胎蛋白(AFP)、胎癌蛋白(CEA)和/或尿液中甲基安非他明的检测。
[0035]与现有技术相比，本发明具有以下有益效果:
[0036](I)本发明基于胶体金优异的光学性质和比表面积大的优势，结合化学发光高灵敏，定量检测技术，构建了一种灵敏度高，既可定性同时可定量的免疫层析分析方法，在实现定量的同时，灵敏度可以提高I个数量级，不需要任何特殊的仪器设备，操作简单。
[0037](2)本发明的化学发光-胶体金免疫层析试纸条具有普遍的适用性，可以检测生物大分子(细菌、病毒和蛋白质等)，也可以检测小分子(农兽药残留，尿液中的毒品等小分子)，适合现场检测和家庭个性化诊断。
【专利附图】
【附图说明】
[0038]图1是传统的胶体金免疫层析试纸条示意图
[0039]图2是高灵敏、可定量的化学发光-胶体金免疫层析试纸条原理
[0040]图3是化学发光-胶体金试纸条可视化检测甲胎蛋白(AFP)的结果图
[0041]图4是化学发光-胶体金试纸条定量检测AFP的结果图
[0042]图5是化学发光-胶体金试纸条可视化检测胎癌蛋白(CEA)的结果图
[0043]图6是化学发光-胶体金试纸条定量检测胎癌蛋白(CEA)的结果图
[0044]图7是化学发光-胶体金试纸条同时检测甲胎蛋白(AFP)和胎癌蛋白(CEA)的结果图
[0045]图8是化学发光-胶体金试纸条同时定量检测甲胎蛋白(AFP)和胎癌蛋白(CEA)的结果图
[0046]其中:1-检测线；2_控制线；3_加样区域；4_观察区域。
【具体实施方式】
[0047]下面结合附图并通过【具体实施方式】来进一步说明本发明的技术方案。
[0048]实施例中所用的试剂、仪器和设备来源如下:
[0049]I甲胎蛋白、胎癌蛋白及相关的抗体:北京热景生物技术有限公司；
[0050]2化学发光底物购自Millipore公司；
[0051]3胶体金构建的相关试剂购自sigma公司；
[0052]4硝酸纤维素膜:默克密理博；
[0053]5三维平面划膜仪和三维平面喷金仪:上海金标生物科技有限公司；
[0054]6冷冻干燥机:北京博医康实验仪器有限公司；
[0055]7切条机:上海金标生物科技有限公司；
[0056]8PVC胶板、吸水纸、玻璃纤维膜和卡壳:上海金标生物科技有限公司。
[0057]实施例1
[0058]图1和图2分别是免疫层析试纸条示意图和化学发光-胶体金免疫层析试纸条的构建原理图。该化学发光-胶体金免疫层析试纸条构建具体步骤如下:
[0059]I)胶体金-酶-抗体复合物的制备:
[0060]将1mL的胶体金溶液pH值调至8.5,然后分别加入0.0lmg的检测抗体和0.2mg的辣根过氧化物酶(HRP)，所述酶和抗体的偶联比例为10:1，在室温下轻轻地振荡反应1-2小时，然后加入3mL浓度为3%的BSA溶液封闭多余的位点，反应0.5-1小时，然后离心10-20分钟，离心力为10000-12000r/min，去掉上清，加入2mL浓度为0.01M, pH值为1.4的含0.1 % BSA的PBS溶液，重悬，再离心，该步骤重复2-3次，最后得到表面既修饰有检测抗体，同时偶联有酶分子的复合物，将ImL上述制备得到的胶体金-酶-抗体复合物喷在结合物垫上。
[0061]2)将0.1mg包被抗体喷到硝酸纤维素膜上形成检测线1，将0.2mg羊抗小鼠二抗液喷到膜的另一区域形成控制线2。
[0062]3)化学发光-胶体金免疫层析试纸条的构建:
[0063]将塑料底衬、样品垫、步骤I)所制得的结合物垫、步骤2)所制得的膜、吸水垫进行粘贴，组装成化学发光-胶体金免疫层析试纸条。
[0064]在本发明化学发光-胶体金免疫层析试纸条的检测线I上富集的胶体金颜色深浅作为定性的标准，同时胶体金表面偶联的酶分子催化化学发光反应而发光，并且发光强度和酶分子的量成正比，通过所述的发光强度实现定量检测。
[0065]实施例2
[0066]检测甲胎蛋白(AFP)。
[0067]实验步骤如下:
[0068](I)用 PBS 缓冲溶液构建成浓度为 200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、20ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、Ing/mL和Ong/mL的AFP溶液，然后分别添加到化学发光_胶体金免疫层析试纸条上，免疫层析反应5-10min ；
[0069](2)肉眼观察试纸条上胶体金颜色的深浅，并用相机拍照，得到可视化检测AFP的结果;
[0070](3)在原来的试纸条上，添加化学发光底物，并用化学发光仪对其结果进行定量检测。
[0071]图3是化学发光-胶体金试纸条可视化检测甲胎蛋白(AFP)的结果，从图3胶体金的颜色可以看出，该试纸条对AFP的最低检出限为10ng/mL。
[0072]图4是化学发光-胶体金试纸条定量检测甲胎蛋白(AFP)的结果，从图4胶体金的颜色可以看出，该试纸条对AFP的最低检出限可以达到Ing/mL，并且化学发光的强度和AFP待检抗原的含量在一定范围内呈线性关系，实现了定量检测。
[0073]经过该对比实验可以得出:采用化学发光-胶体金模式的试纸条灵敏度提高了 10倍。并且同时实现了定性和定量检测。
[0074]实施例3
[0075]检测血清中的胎癌蛋白(CEA)。
[0076]实验步骤如下:
[0077](I)用 PBS 缓冲溶液构建成浓度为 200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、20ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、Ing/mL和Ong/mL的CEA溶液，然后分别添加到化学发光_胶体金试纸条上，免疫层析反应5-10min ；
[0078](2)肉眼观察试纸条上胶体金颜色的深浅，并用相机拍照，得到可视化检测CEA的结果;
[0079](3)在原来的试纸条上，添加化学发光底物，并用化学发光仪对其结果进行定量检测。
[0080]图5是化学发光-胶体金试纸条可视化检测胎癌蛋白(CEA)的结果，从图5胶体金的颜色可以看出，该试纸条对CEA的最低检出限为10ng/mL。
[0081]图6是化学发光-胶体金试纸条定量检测胎癌蛋白(CEA)的结果，从图6胶体金的颜色可以看出，该试纸条对CEA的最低检出限可以达到Ing/mL，并且化学发光的强度和CEA待检抗原的含量在一定范围内呈线性关系，实现了定量检测。
[0082]经过该对比实验可以得出:采用化学发光-胶体金模式的试纸条灵敏度提高了 10倍。并且同时实现了定性和定量检测。
[0083]实施例4
[0084]同时检测血清中的甲胎蛋白(AFP)和胎癌蛋白(CEA)。
[0085]实验步骤如下:
[0086](I)将一系列不同浓度的 AFP 溶液(200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、20ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、Ong/mL)和 CEA 溶液(200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、20ng/mL、I Ong/mL、2ng/mL、Ong/mL)等体积混合在一起,将混合液滴加在化学发光-胶体金试纸条的加样垫上，免疫层析反应5-10min ；
[0087](2)肉眼观察试纸条上胶体金颜色的深浅，并用相机拍照，得到可视化同时检测AFP和CEA的结果；
[0088](3)然后在原来的试纸条上，添加化学发光底物，用化学发光底物观察化学发光的信号，并用化学发光仪对其结果进行定量检测。
[0089]图7是化学发光-胶体金试纸条同时检测甲胎蛋白(AFP)和胎癌蛋白(CEA)的结果，图8是化学发光-胶体金试纸条定量同时检测甲胎蛋白(AFP)和胎癌蛋白(CEA)的结果，经过该对比实验可以得出:化学发光-胶体金试纸条检测的灵敏度提高了 10倍，并且化学发光的强度分别和AFP或CEA待检抗原的含量在一定范围内呈线性关系，从而实现了定性和定量检测。
[0090]实施例5
[0091]检测尿液中的甲基安非他明。
[0092]实验步骤如下:
[0093](I)将一系列不同浓度的甲基安非他明(500ng/mL、200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、20ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、Ing/mL、Ong/mL)滴加到化学发光-胶体金试纸条的加样垫上，免疫层析反应5-10min ；
[0094](2)肉眼观察试纸条上胶体金颜色的深浅，并用相机拍照，得到可视化检测甲基安非他明的结果；
[0095](3)然后在原来的试纸条上添加化学发光底物，用化学发光底物观察化学发光的信号，并用化学发光仪对其进行定量分析检测。
[0096]对比实验结果显示:化学发光-胶体金试纸条检测的灵敏度提高了 10倍，并且同时实现了定性和定量检测。
[0097] 申请人:声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属【技术领域】的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
【权利要求】
1.一种化学发光-胶体金免疫层析试纸条的构建方法，其特征在于，具体步骤如下: 1)将检测抗体和酶分子按比例加到胶体金溶液中，使胶体金的表面同时偶联所述抗体和酶分子，形成胶体金-酶-抗体复合物溶液，并将所述复合物溶液喷在结合物垫上； 2)将包被抗体液喷到膜上形成检测线(I)，将羊抗小鼠二抗液喷到膜的另一区域形成控制线⑵； 3)将样品垫、步骤I)所制得的结合物垫、步骤2)所制得的膜、吸水垫依次粘贴在塑料底衬上，组装成化学发光-胶体金免疫层析试纸条； 在所述试纸条中，检测线(I)上胶体金颜色的深浅作为定性的依据，同时胶体金表面偶联的酶分子数量作为化学发光定量的依据。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤I)所述的酶为辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(ALP)，优选为辣根过氧化物酶(HRP)。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤I)所述的胶体金-酶-抗体复合物的制备方法包括如下步骤: 调节胶体金溶液的PH值，然后加入检测抗体 和酶分子，在室温下振荡反应，然后加入BSA溶液封闭多余的位点，反应并离心后，去掉上清液，加入含0.1% BSA的PBS溶液，重悬，再离心，该步骤重复2-3次，得到表面既修饰有检测抗体，同时偶联有酶分子的复合物，在4 °C冰箱保存。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述胶体金溶液的pH值调整为7.0-9.0,优选为7.1-8.5 ;更优选为8.5 ； 优选地，所述酶分子和检测抗体的偶联比例为100-1:1，优选为80-5:1，更优选为10:1 ； 优选地，所述BSA溶液的浓度为3% ;所述PBS溶液的浓度为0.01M, pH值为7.4 ; 优选地，所述室温下振荡反应时间为1-2小时；加入BSA溶液封闭位点后的反应时间为0.5-1小时；所述离心时间为10-20分钟；所述离心转速为10000-12000r/min。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，步骤I)所述胶体金、酶分子和检测抗体偶联的方式包括:静电引力吸附偶联或者先构建胶体金-链霉亲和素复合物，同时制备生物素化的抗体和酶分子，通过生物素-链霉亲和素这个信号放大系统，实现胶体金-酶-抗体复合物的制备。
6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，步骤I)所述的结合物垫为玻璃纤维、聚酯纤维膜或人造纤维中的任意一种，优选为玻璃纤维。
7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，步骤2)所述的膜为硝酸纤维素膜(NC)、PVDF膜或者尼龙膜，优选为硝酸纤维素膜(NC)。
8.一种同时实现定性和定量检测的试纸条使用方法，其特征在于，采用权利要求1-7任一项所述的试纸条，包括如下步骤: 1)将待测样品加到所述试纸条上，免疫层析反应5-10min； 2)肉眼观察所述试纸条上检测线(I)上胶体金颜色的深浅，得到所述试纸条定性检测样品的结果； 3)然后在原来的试纸条上添加化学发光底物，并用化学发光仪采集化学发光信号，化学发光强度和酶分子的量成正相关，而酶分子的量和待检抗原成正相关，因此，通过化学发光强度得到定量检测样品的结果。
9.根据权利要求1-7任一项所述方法得到的化学发光-胶体金免疫层析试纸条在检测生物大分子和/或小分子中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，将所述的化学发光-胶体金免疫层析试纸条用于蛋白的检测，优选甲胎蛋白(AFP)、胎癌蛋白(CEA)和/或尿液中甲基安非他明的检测。
【文档编号】G01N33/543GK104076140SQ201410325350
【公开日】2014年10月1日 申请日期:2014年7月9日 优先权日:2014年7月9日
【发明者】蒋兴宇, 陈翊平, 曹丰晶, 张晓青, 张伟, 查瑞涛 申请人:国家纳米科学中心