一种检测羊肚菌菌丝的胶体金免疫试纸条的制作方法
【专利摘要】一种检测羊肚菌菌丝的胶体金免疫试纸条，涉及一种生产食用菌检测的改进，其特征是：在塑料衬板上依次贴附有样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水纸，将胶体金标记的抗羊肚菌抗体喷涂或浸泡金标垫上，将用PBS缓冲液稀释的山羊抗鼠IgG包被在质控线上，将用PBS缓冲液稀释的抗羊肚菌兔血清多克隆抗体包被在检测线上，在质控线和检测线外表包被有NC膜。有益效果是：具有检测周期短（1小时内出结果）；操作简便，不需要专业人员及仪器设备检测；成本低（每个检样花费需要几元至十几元）；定性检测结果准确。本方法可解决羊肚菌人工栽培中菌种是否是羊肚菌菌种，以及栽培后培养料中生长的菌丝是否是羊肚菌菌丝的监测，可以减少损失。
【专利说明】
一种检测羊肚菌菌丝的胶体金免疫试纸条
【技术领域】
[0001]本发明属于生化【技术领域】，涉及一种生产食用菌检测的改进。
【背景技术】
[0002]羊肚菌是一种珍稀的食用菌，其以美味著称。近年来的研究还发现其具有丰富的保健价值。由于人工栽培技术还不成熟，产品基本靠野生资源的采集，价格居高不下。实现羊肚菌的人工栽培具有巨大的商业价值。我们知道，在羊肚菌人工栽培时，如果栽培的菌种不是羊肚菌或是在栽培过程中培养基被杂菌污染，这种情况是栽培不出羊肚菌的。在羊肚菌的人工栽培实践过程中，从菌种培养到子实体(菇体)的採收大约需要4至6个月时间，一般情况下，只有出菇才能证明接种的菌种是羊肚菌菌种，这也是传统的形态学检定方法，这种鉴定方法的好处是直接、客观；最大的缺陷是周期过长，而且由于羊肚菌栽培、出菇受多种因素影响而不易出菇，这种方法羊对肚菌的人工栽培过程的早期及期中检测上受到限制。另外一种检定羊肚菌的方法是在实验室条件下的提取羊肚菌的DNA，通过核酸序列检测比对来鉴定，该方法的优势是精准，缺点是需要专业的检测实验室，检测周期长(数天)，费用昂贵。
[0003]参考文献:
(1)孟盟，曹池，陈汉忠，等.水牛伊氏锥虫病免疫胶体金试纸条的研制及初步应用[J].畜牧兽医学报，2011，42 (7):988-933.(2)王一东，刘建.一株抗羊肚菌单克隆抗体及其制备方法:中国，200910218152.8[P],2010-06-09.(3)马帅，陈华林，王雅文，等.免疫酶染色法对羊肚菌菌丝特异性靶位的初步定位与分析[J].菌物研究，2014，12 (2):115-118.
【发明内容】
[0004]本发明的目的是:提供一种检测羊肚菌菌丝的胶体金免疫试纸条，它可简便、快捷、准确地检测羊肚菌。
[0005]本发明的技术方案是:在塑料衬板上依次贴附有样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水纸，将胶体金标记的抗羊肚菌抗体喷涂或浸泡金标垫上，将用PBS缓冲液稀释的山羊抗鼠IgG包被在质控线上，将用PBS缓冲液稀释的抗羊肚菌兔血清多克隆抗体包被在检测线上，在质控线和检测线外表包被有NC膜。
[0006]山羊抗鼠IgG用PBS缓冲液做1/100、1/200、1/500、1/1000和1/2000稀释包被质控线。
[0007]将浓度为4.22 ug/ul的抗羊肚菌兔血清多克隆抗体用PBS缓冲液做1、2、3、4、5和6倍稀释包被检测线。
[0008]本发明的制备方法是:
(I)胶体金标记抗羊肚菌抗体(单克隆抗体、多克隆抗体)的制备经硫酸铵沉淀法纯化的单克隆抗体(C6A8细胞株)及兔多克隆抗体的蛋白浓度分别为2.91 ug/ul,4.22 ug/ul。C6A8单抗的效价为1: 1280，兔血清的效价:1:2560。胶体金溶液pH在8.5左右，C6A8单抗加入胶体金溶液中使其终浓度为0.58 ug/ml时，可以将胶体金较好的标记在抗羊肚菌单克隆抗体C6A8上。将胶体金标记的抗羊肚菌抗体或喷涂或浸泡金标垫，将金标垫37°C lh，烘干，备用。
(2)质控线抗体与检测线抗体包被浓度
检测线包被抗体(使用的是纯化的兔抗羊肚菌多抗)蛋白浓度为:62.lug/ml,质控线包被抗体(山羊抗鼠IgG (H+L))蛋白浓度为:6.4ug/ml。将上述试剂用喷或涂或点样的方式包被到硝酸纤维素膜(NC膜)对应位置上，37°C lh，烘干。将包被好的硝酸纤维膜浸泡于1%的牛血清白蛋白(BSA)中封闭，37°C lh，烘干。备用。
(3)试纸条的装配及试纸条检验结果判定。
[0009]如图1所示，依次将样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水纸贴于塑料衬板上，切成
0.4cm宽的长条；
吸取适量经过研磨处理的待检样品，滴加到试纸条的样品垫上，可见样品通过层析作用向前移行，在移行过程中NC膜上会出现肉眼町见的红色条带，于加样后10 min观察结果，T线和C线都显色.结果为阳性；C线显色，T线不显色，结果为阴性；若C线不显色，则试纸条无效。
[0010]本发明的有益效果是:具有检测周期短(I小时内出结果)；操作简便，不需要专业人员及仪器设备检测；成本低(每个检样花费需要几元至十几元);定性检测结果准确。本方法可解决羊肚菌人工栽培中菌种是否是羊肚菌菌种，以及栽培后培养料中生长的菌丝是否是羊肚菌菌丝的监测，可以减少损失。
【专利附图】
【附图说明】
[0011]图1是本发明结构图。
【具体实施方式】
[0012]下面结合附图对本发明作进一步描述:
实施例1
如图所示，I是VC底板P、2是样品垫、3是胶体金垫、4是NC膜、5是吸水滤纸、6是质控线、7是检测线。
[0013]羊肚囷囷种，编号:51589，购于中国农业微生物囷种保减中心；
鼠源抗羊肚菌单克隆抗体(C6A8杂交瘤细胞株)、/兔源抗羊肚菌多克隆抗体，及由长春理工大学生命科学技术学院生物工程系实验室制备，抗羊肚菌单抗杂交瘤细胞株现保存于该实验室；
胶体金溶液，上海金标生物科技有限公司；
金标垫、样品垫、吸水纸、硝酸纤维(NC)膜，上海金标生物科技有限公司；
牛血清白蛋白(BSA)，sigma公司分装；
HRP标记山羊抗鼠IgG (H+L)，HRP标记山羊抗兔IgG (H+L)购于北京中杉金桥生物技术有限责任公司； pH试纸，上海华美公司；
实验所需的主要仪器、设备=Mill1-Q超纯水系统制备，磁力搅拌器，恒温培养箱，冷冻离心机，酶标仪，等。
[0014]I 方法
1.1试剂配制及玻璃器皿的处理
(1)0.1%碳酸钾溶液:准确称取0.1 g碳酸钾+超纯水100 ml配制成溶液；
(2)PBS缓冲液(0.01 mol/L磷酸盐缓冲液):准确称取氯化钠8 g，氯化钾0.2 g，磷酸二氢钾0.2 g，磷酸氢二钠2.9 g，加蒸馏水定容至1000 ml;
(3)包被抗原稀释液；0.01 mol/L PBS pH7.4;
(4)重悬液(含1%BSA的PB液):将0.2 mol/L的磷酸二氢钠0.53 ml和0.2mol/L的磷酸氢二钠9.47mL,混合后加入BSA至终浓度为1%。
所用玻璃器皿先用清洁剂清洗干净，然后用盐酸洗液浸泡24 h，再用蒸馏水浸泡24h、最后蒸馏水、双蒸水洗3?4次，烘干后备用[1]。
1.2单克隆抗体的纯化及效价和蛋白浓度的测定
用硫酸铵沉淀法[2]分别纯化抗羊肚菌的单克隆抗体C6A8、以及多克隆抗体。纯化后的抗体分别用ELISA方法测定其效价，将抗体稀释20、40、80......5120倍分别加入1_9孔，
1Ul孔SP2/0作为阴性对照。考马斯亮蓝法测其蛋白浓度。
1.3胶体金标记最适pH的确定
用0.lmol/L的碳酸钾和0.lmol/L的盐酸将胶体金溶液调至不同的梯度，取pH为7、
8、8.5、9、10的胶体金溶液各10ul，分别加入Iul浓度为1.14 mg/mL的纯化好的抗体，混合均匀，室温下放置15 min,分别加入2ul浓度为10%的NaCl溶液，混合均匀，室温下放置3h。不适合的pH值组溶液颜色由红色变为蓝色，甚至变黑、无色，观察颜色变化最小的组为稳定组，该pH值为最适标记酸碱度。
1.4胶体金标记最适蛋白浓度的确定
用0.lmol/L的碳酸钾和0.lmol/L的盐酸溶液将胶体金溶液调节到最适pH，在每10ul胶体金溶液中分别加入1.2,0.9,0.6,0.3,0.1,0.05ul单抗，室温作用5 min，分别加入10%的NaCl溶液5ul，混匀后静置3h[4]。观察颜色变化较小的小组，记录加入单克隆抗体的量，该蛋白两即为最适标记浓度。
1.5胶体金标记抗体的制备及检测
取10uL胶体金溶液，匀速搅拌作用下，加入适量0.lmol/L的碳酸钾，调节胶体金溶液至最适pH,将单抗溶液逐滴加入胶体金溶液中，大约5 min加完,勻
速搅拌30 min ;室温放置15 min，逐滴加入10% BSA至终浓度为1%，将标记的胶体金溶液以3 000r/min离心20 min,弃去沉淀。12 000 r/min离心60 min,吸弃上清液；用含I %牛血清白蛋白的PB液充分溶解沉淀。4°C保存备用[5]。
为了检测单克隆抗体是否与胶体金结合上，我们采用直接法，即将有阳性的抗原和山羊抗鼠IgG (二抗)分别包被于硝酸纤维膜上后浸泡于标记抗体的胶体金溶液中，二十分钟后去硝酸纤维膜并观察其显色结果。
1.6质控线抗体与检测线抗体包被浓度的确定
将实验室已有的山羊抗鼠IgG用PBS缓冲液做1/100、1/200、1/500、1/1000和1/2000稀释包被质控线。浸泡于标记抗体的胶体金溶液中，二十分钟后观察其显色情况，选择适合浓度包被NC膜。
确定二抗包被浓度后，将浓度为4.22 ug/ul的抗羊肚菌兔血清多克隆抗体用PBS缓冲液做1、2、3、4、5和6倍稀释包被检测线，组装试纸条，做阳性和阴性样品检测，观察显色情况，选择最佳浓度的抗体包被NC膜。
1.7检测线与质控线的封闭
用最适检测线与质控线包被浓度包被于硝酸纤维膜后，将包被好的硝酸纤维膜浸泡于1%的牛血清白蛋白中封闭，放置于37度恒温箱中，一小时后取出，烘干。
1.8试纸条的装配
依次将样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水纸贴于塑料衬板上，切成0.4cm
宽的长条；在硝酸纤维素膜的指定位置用一定浓度的山羊抗鼠IgG(质控线)和兔血清多克隆抗体(检测线)点样包被。
1.9试纸条检验结果判定
吸取适量待检样品滴加到试纸条的样品垫上，可见样品通过层析作用向前移行，在移行过程中NC膜上会出现肉眼町见的红色条带，于加样后10 min观察结果，T线和C线都显色.结果为阳性；C线显色，T线不显色，结果为阴性；若C线不显色，则试纸条无效。
[0015]2实验结果
2.1纯化后单抗和多抗效价及蛋白浓度的测定
纯化后的抗羊肚菌单克隆抗体W8C9、C6A8及多克隆抗体兔血清用ELISA间接法测得W8C9的效价为320，C6A8的效价为1280，兔血清的效价为2560。
用考马斯亮蓝法牛血清白蛋白做标准曲线，测得单克隆抗体W8C9、C6A8及多克隆抗体兔血清蛋白浓度分别为:2.28 ug/ul,2.91 ug/ul,4.22 ug/ul。
由于纯化后C6A8的效价还是高于W8C9的效价，所以本实验选用C6A8单克隆抗体标记胶体金。
2.2胶体金的最适标记条件
经观察比较，胶体金溶液pH=8.0时，其颜色变化最小，所以确定胶体金标记最适pH为
8.0。实验结果表明，将抗体加入胶体金溶液中使其终浓度为0.58 ug/ml时效果最佳，所以本实验选用0.58 ug/ml为最佳抗体标记浓度。
2.3 I父体金标记的结果
包被有阳性抗原的硝酸纤维膜浸泡于标记了抗体的胶体金溶液中后，观察到包被抗原的地方有明显的红色出现，说明单克隆抗体已经于抗体结合上。
2.4最适质控线包被浓度的确定
经过实验确定质控线山羊抗鼠二抗1/500稀释时实验效果最佳。
2.5特异性结果
我们将上述以建立的ELISA夹心法检测到的十种不同的阳性菌丝抗原样本包被于硝酸纤维膜(检测线)，山羊抗鼠IgG (二抗)作为质控线包被，然后浸泡于标有抗体的胶体金溶液中，二十分钟后观察，结果如下表:
表2-1胶体金法特异性实验编号 12 3 4 5 6 7 8 9 10 样品 4 "22 5—1 4 --4 3~1 3~2 4—3 5*?2 3?.3 5?~5 5-3 结果 + + ++++ + + ++
注:1.样品为不同种及同种的不同培养(液体)批次的羊肚菌菌丝处理液。
2.样品的处理方法是，去适量菌丝，加入适量无菌海沙，在研钵中研磨20分钟，上清液既是。
[0016]可见，用双抗体ELISA夹心法能检测出来的羊肚菌菌丝抗原样本用胶体金法也能检测其阳性，即胶体金免疫层析法与双抗体ELISA夹心法检测结果相符合。
[0017]而采用该法检测不同浓度的木耳、金针菇、金顶侧耳、香菇、平菇、滑子蘑、双孢菇的食用菌菌丝处理液时，其结果与阴性对照值相同，表明该方法对羊肚菌菌丝抗原的检测具有良好的特异性。
[0018]3试纸条使用方法
3.1检样的处理:取适量(Ig左右)的含有疑似羊肚菌菌丝的菌种或含有疑似羊肚菌菌丝的培养料样本(可以混有培养基)，加入2g左右的无菌海沙和适量的纯净水(可以用干净的市售矿泉水)，在研钵内研磨1020分钟，静置5分钟，液体的上部较清澈的部分即可作为检样。
3.2检测:将检样滴入试纸条的样品垫上I至2滴(或是组装的试纸条的样品孔中)，室温下静置20分钟，观察检测结果。
3.3结果的判断:
如果检测线(离加样点近的)和质控线(离加样点远的)都出现红色条线，判定样品为阳性，既样品中含有羊肚菌；
如果只有质控线出现红色条线，判定样品为阴性，既样品中不含有羊肚菌；
如果检测线与质控线均不出现或是只有检测线出现红色条线，判定为试纸条失效。
【权利要求】
1.一种检测羊肚菌菌丝的胶体金免疫试纸条，其特征是:在塑料衬板上依次贴附有样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水纸，将胶体金标记的抗羊肚菌抗体喷涂或浸泡金标垫上，将用PBS缓冲液稀释的山羊抗鼠IgG包被在质控线上，将用PBS缓冲液稀释的抗羊肚菌兔多克隆抗体也包被在检测线上，将包被有质控线和检测线的NC膜经含有1%的牛血清白蛋白的PBS缓冲液中封闭。
2.如权利要求1所述的一种检测羊肚菌菌丝的胶体金免疫试纸条,其特征是:胶体金溶液PH在8.08.5，抗羊肚菌单克隆抗体C6A8加入胶体金溶液中使其终浓度为0.58 ug/ml时，将胶体金标记在抗羊肚菌单克隆抗体C6A8上。
3.如权利要求1所述的一种检测羊肚菌菌丝的胶体金免疫试纸条，其特征是:山羊抗鼠IgG用PBS缓冲液稀释成蛋白浓度为6.4ug/ml包被质控线。
4.如权利要求1所述的一种检测羊肚菌菌丝的胶体金免疫试纸条，其特征是:将用PBS缓冲液稀释成蛋白浓度为62.lug/ml的抗羊肚菌兔多克隆抗体包被检测线。
【文档编号】G01N33/558GK104165989SQ201410327203
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2014年7月10日 优先权日:2014年7月10日
【发明者】王一东, 张强 申请人:长春理工大学