福氏志贺菌o抗n-乙酰葡糖胺6位碳原子乙酰化修饰检测试剂及应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及福氏志贺菌O抗N-乙酰葡糖胺6位碳原子乙酰化修饰检测试剂及应用，本发明发现了福氏志贺菌乙酰基转移酶基因oacD基因介导了O抗N-乙酰葡糖胺6位碳原子乙酰化修饰，该修饰赋予O-抗原一种新的抗原表位，从而提供了针对福氏志贺菌oacD基因或O抗N-乙酰葡糖胺6位碳原子乙酰化修饰抗原表位的检测试剂在制备用于检测福氏志贺菌的O抗N-乙酰葡糖胺6位碳原子乙酰化修饰或进一步区分血清型的检测剂中的应用，还提供了所述的检测剂，检测福氏志贺菌O抗N-乙酰葡糖胺6位碳原子乙酰化修饰的方法，以及一种福氏志贺菌O抗N-乙酰葡糖胺6位碳原子乙酰化修饰检测用试剂盒。
【专利说明】福氏志贺菌O抗N-乙酰葡糖胺6位碳原子乙酰化修饰检测试剂及应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物技术检测福氏志贺菌血清型的领域，具体涉及针对福氏志贺菌O抗N-乙酰葡糖胺6位碳原子乙酰化修饰的检测试剂及相关应用。
【背景技术】
[0002]福氏志贺菌(Shigella flexneri)是发展中国家细菌性痢疾的主要病原菌。亚洲大约每年有1.25亿人发病，死亡14，000，其中大部分是5岁以下的儿童(Bardhan P，Faruque ASiNaheed A,Sack DA.2010.Decrease in shigellosis-related deaths withoutShigella spp.-specific intervent1ns, Asia.EmergInfectDis16:1718-1723.)。 月旨多糖(LPS)的0-抗原特异链即O-抗原在福氏志贺菌发病机理上起了很大的作用，它可以保护细菌免受血清补体的融菌作用，并且促进细菌与肠上皮细胞的粘附和内化(West NP， Sansonetti P， Mounier J， Exley RM, Parsot C， Guadagnini S， PrevostMC, Prochnicka-Chalufour A，Delepierre M，Tanguy M，Tang CM.2005.0ptimizat1nofvirulence funct1ns through glucosyIat1n ofShigella LPS.Science307:1313-1317 ；
[0003]Kohler H,Rodrigues SP,McCormick BA.2002.Shigella flexneri Interact1nswith the Basolateral Membrane Domain ofPolarized Model Intestinal Epithelium:Role of Iipopolysaccharide in Cell Invas1n and in Activat1n of theMitogen-Activated Protein Kinase ERK.1nfect Immun70:1150-1158 ；Hong M，PayneSM.1997.Effect ofmu tat1ns in Shigella flexneri chromosomal and plasmid-encodedlipopolysaccharide genes on invas1n and serum resistance.Mol Microb1l24:779-791.)。0-抗原的结构差异为福氏志贺菌血清型分型提供了基础。福氏志贺菌所有血清型(6型除外)都有一个由三个鼠李糖(Rhamnose，Rha)和一个N-乙酰葡糖胺(GlcpNAc)组成的四糖重复单位(O-单位)构成:
[0004][ — 2) - a -L-Rhapm- (I — 2) - a -L-Rhapn-(I — 3) - a -L-Rhap1- (I — 3) - β -D-GlcpNAc_(l — ](Perepelov AV，Shekht ME,Liu B,Shevelev SD，Ledov VA,Senchenkova SN，L1 Vov V L,Shashkov ASiFeng LiAparin PGiWang LiKnirel YA.2012.Shigella flexneriO-antigens revisited:final elucidat1n of the O-acetylat1n profiles and a surveyof the 0-antigen structure diversity.FEMS Immunol Med Microb1l66:201-210.)。
[0005]Y血清型具有基本的0-抗结构。在四糖骨架不同的糖基上添加不同的化学基团形成不同的O-抗结构，从而形成不同的血清型(Allison GE，Verma NK.2000.Serotype-converting bacter1phages and 0—antigen modificat1n in Shigellaflexner1.Trends Microb1l8:17-23)。 宿主对福氏志贺菌感染的免疫反应是血清型特异的，O-抗原修饰导致的抗原多样性可以帮助他们逃脱宿主防御(Allison GE，Verma NK.2000.Serotype-converting bacter1phages and 0-antigen modificat1ninShigella flexner1.Trends Microb1l8:17-23)。此外，一些修饰，比如在 GlcpNAc,RhaI和RhaII上的糖基化修饰促进了由III型分泌系统介导的侵袭宿主细胞作用(West NP， Sansonetti P， Mounier J， Exley RM, Parsot C， Guadagnini S， PrevostMC, Prochnieka-Chalufour A，Delepierre M，Tanguy M，Tang CM.2005.0ptimizat1nof virulence funct1ns through glucosylat1n ofShigella LPS.Science307:1313-1317)。因此阐明0-抗原修饰的机制对理解福氏志贺菌抗原性和致病性有很重要的作用。
[0006] 目前公认的福氏志贺菌的O-抗修饰类型包括:2-0-乙酰化修饰(2-0-acetylat1n)和糖基化修饰(glucosylat1n)(Allison GE，Verma NK.2000.Serotype-converting bacter1phages and 0-antigen modificat1n in Shigellaf lexner1.Trends Microb1l8:17-23)。2-0-acetylat1n 发生在血清型 lb，3a，3b，4b 和 7b的RhaI上，它赋予宿主6群和III型(在血清型3a和3b中)抗原决定簇(O-因子)(FosterRA,Carlin NI,Majcher M，Tabor H,Ng LK,Widmalm G.2011.Structural elucidat1n ofthe 0-antigen of the Shigella flexneri provis1nal serotype88-893:structuraland serological similarities with S.flexneri provis1nal serotype Y394(Ic).Carbohydr Res346:872-876 ；Kenne L， Lindberg B， Petersson K， KatzenellenbogenE，Romanowska E.1978.Structural studies of Shigella flexneri O-antigens.Eur J B1chem91:279-284)。一个温和噬菌体Sf6携带的0-乙酰基转移酶编码基因(0-acetyltransferase gene:oac)介导了 2-0-acetylat1n (Verma NK, Brandt JM，VermaDJ, Lindberg AA.1991.Molecular characterizat1n of the 0-acetyl transferasegene of converting bacter1phage SF6that adds group antigen6to Shigellaflexner1.Mol Microb1l5:71-75 ；Clark CA，Beltrame J，Manning PA.1991.The oacgene encoding a lipopolysaccharide 0-antigen acetylase maps adj acent to theintegrase—encoding gene on the genome of Shigella flexneri bacter1phage Sf6.Genel07:43-52) 。糖基化修饰发生于O-单位的一个或两个糖基的不同位置，它决定了不同血清型的型抗原决定簇I，1C，II，IV和V以及群7，8抗原决定簇(Allison GE，Verma NK.2000.Serotype-converting bacter1phages and 0-antigen modificat1n inShigella flexner1.Trends Microb1l8:17-23 ;Stagg RM,Tang SS,Carlin NI,TalukderKA，Cam PD，Verma NK.2009.A novel glucosyItransferase involved in 0-antigenmodificat1n of Shigella flexneri serotypelc.J Bacter1ll91:6612-6617)。三个基因，gtrA，gtrB，和gtr(型特异)负责福氏志贺菌中糖基化修饰；他们由6种嗷菌体(sfl，SfIC, SfII, SfIV, SfV 和 SfX)携带，被称为 gtr 基因族(Clark CA，Beltrame J，ManningPA.1991.The oac gene encoding a lipopolysaccharide 0-antigen acetylase mapsadj acent to the integrase—encoding gene on the genome of Shigella flexneribacter1phage Sf6.Genel07:43-52 ；Stagg RM, Tang SS, Carlin NI，Talukder KA, CamPD，Verma NK.2009.A novel glucosy I transferase involved in 0-antigen modificat1nofShigella flexneri serotypelc.J Bacter1ll91:6612-6617 ；Sun Q，Lan R，Wang Y，Wang J，Li P，Du P，Xu J.2013.1solat1n and genomic characterizat1n of Sfl,a serotype-converting bacter1phage of Shigella flexner1.BMC Microb1ll3:39 ；Mavris M，Manning PA，Morona R.1997.Mechanism of bacter1phage SfI1-mediatedserotype convers1n in Shigella flexner1.Mol Microb1l26:939-950 ;Guan S，Bastin DA，Verma NK.1999.Funct1nal analysis of the O antigen glucosylat1ngene cluster of Shigella flexneri bacter1phage SfX.Microb1logyl45:1263-1273 ；Allison GE，Angeles D, Tran-Dinh N，Verma NK.2002.Complete genomic sequenceof SfV, a serotype-converting temperate bacter1phage of Shigella flexner1.JBacter1ll84:1974-1987 ；Adhikari P，Allison G，Whittle B，Verma NK.1999.Serotypela 0-antigen modificat1n:molecular characterizat1n of the genes involved andtheir novel organizat1n in the Shigella flexneri chromosome.J Bacter1ll81:4711-4718 ；Adams MMiAllison GE，Verma NK.2001.Type IV 0 antigen modificat1n genesin the genome of Shigella flexneri NCTC8296.Microb1logyl47:851-860) 0 前两个基因是高度保守且可以在不同血清型间互换，第三个基因gtH型)是血清型特异的，编码一个负责在O-单位特定糖基上添加糖基团的葡糖基转移酶(Allison GEiVerma NK.2000.Serotype-converting bacter1phages and 0-antigen modificat1n in Shigellaflexner1.Trends Microb1l8:17-23)。Sf6和SfIC的基因组分别整合到细菌染色体中，分别位于保守基因 yfdC 和 yejO H比邻的 tRNA_argW(StaggRM，Tang SS, Carlin NI，TalukderKA，Cam PD，Verma NK.2009.A novel glucosyItransferase involved in 0-antigenmodificat1n of Shigella flexneri serotypelc.J Bacter1ll91:6612-6617 ；CasjensS， Winn-Stapley DA, Gilcrease EB, Morona R， Kuhlewein C， Chua JE, Manning PA，Inwood W, Clark AJ.2004.The chromosome of Shigella flexneri bacter1phageSf6 !complete nucleotide sequence，genetic mosaicism，and DNA packaging.J MolB1l339:379-394)。其它的噬菌体是整合在宿主菌保守基因proA和adrA之间tRNA-argW位点(Allison GEiVerma NK.2000.Serotype-converting bacter1phages and 0-antigenmodificat1n in Shigella flexner1.Trends Microb1l8:17-23 ；Sun Q，Lan R，Wang Y，Wang J，Luo X，Zhang S，Li P，Ye C，Jing H，Xu J.2011.Genesis of a novel Shigellaflexneri serotype by sequential infect1n of serotype-converting bacter1phagesSfXand Sfl.BMC Microb1lll:269-274)。
[0007]最近， 第三种福氏志贺菌的O-抗原修饰，即在RhaIII或RhaII或两者的3位碳原子上添加磷酸乙醇胺(PEtN)基团被发现，这种修饰赋予宿主MASF IV-KE1037)抗原表位，这种抗原表位在新命名的血清型Xv，4av和Yv中出现(Sun Q，Y.A.Knirel, R.Lan,J.Wang, S.N.Senchenkova，D.Jin, A.S.Shashkov，S.Xia AV, Perepelov，Q.Chen, Y.Wang,H.Wang,J.JX.2012.A novel plasmid-encoded serotype convers1n mechanism throughaddit1n of phosphoethanolamine to the 0-antigen of Shigella flexner1.PLoS0ne7:e46095 ；Sun Q，Lan R，Wang J，Xia S，Wang Y，Jin D，Yu B，Knirel YA，Xu J.2013.1dentificat1n and characterizat1n of a novel Shigella flexneri serotypeYv in China.PLoS 0ne8:e70238 ；Perepelov AV, L ' vov V L, Liu B，SenchenkovaSN，Shekht ME，Shashkov AS，Feng L, Aparin PG, Wang L, Knirel YA.2009.A newethanolamine phosphate-containing variant ofthe 0-antigen of Shigella flexneritype4a.Carbohydr Res344:1588-1591 ；Knirel YA, Lan R，Senchenkova SN，Wang J，Shashkov AS，Wang Y，Perepelov AV, X1ng Y，Xu J，Sun Q.2013.0-antigen structureof Shigella flexneri serotype Yv and effect ofthe Ipt-O gene variat1n onphosphoethanolamine modificat1n of S.flexneri O-antigens.Glycob1logy23:475-485)。一个单一的，由6.8Kb质粒(psFxv—2或pSFyv—2)携带的基因opt介导了 PEtN修饰 Sun Q，Y.A.Knirel，R.Lan, J.Wang, S.N.Senchenkova, D.Jin, A.S.Shashkov, S.XiaAV, Perepelov, Q.Chen, Y.Wang, H.Wang, J.JX.2012.A novel plasmid-encoded serotypeconvers1n mechanism through addit1n of phosphoethanolamine to the 0-antigenofShigella flexner1.PLoS 0ne7:e46095 ;Sun Q,Lan R,Wang J，Xia S,Wang Y，Jin D，YuB，Knirel YA, Xu J.2013.1dentificat1n and characterizat1n of a novel Shigellaflexneri serotype Yv in China.PLoS 0ne8:e70238 ；
[0008]Knirel YA, Lan R，Senchenkova SN，Wang J，Shashkov AS，Wang Y，PerepelovAV, X1ng Y，Xu J，Sun Q.2013.0-antigen structure of Shigella flexneri serotypeYv and effect of the Ipt-O gene variat1n on phosphoethanolamine modificat1nof S.flexneri O-antigens.Glycob1logy23:475-485))。质粒 pSFxv2 可以在福氏志贺菌不同血清型间通过结合作用转移(Sun Q，Knirel YA, Lan R，Wang J，SenchenkovaSN，Shashkov AS，Wang Y，Wan g Y，Lno X，Xu J.2014.Disseminat1n and serotypemodificat1n potential of pSFxv_2, an 0-antigen PEtN modificat1n plasmid inShigella flexner1.Glycob1logy24:305-313)，是示这种修饰在自然界中传播的可能。
[0009]除了先前研究发现的RhaI的2位的0_乙酰化修饰，最近发现，在血清型la，lb，2a，5a，Y 和 6 中 RhaIII 的 3 或 4 位碳原子(3/4-0-acetylat1n)，以及血清型 2a，3a，Y和Yv中GlcNAc的6位碳原子(6-0-acetylat1n)也存在O-乙酸化修饰(Perepelov AV,Shekht ME, Liu B，Shevelev SD, Ledov VA, Senchenkova SN，V Vov V L, Shashkov AS，Feng LiAparin PGiWang LiKnirel YA.2012.Shigella flexneri O-antigens revisited:final elucidat1n of the 0-acetylat1n profiles and a survey of the 0-antigenstructure diversity.FEMS Immunol Med Microb1l66:201-210 ;
[0010]Perepelov AV, Shevelev SD, Liu B，Senchenkova SN，Shashkov AS，Feng L,Knirel YA, Wang L 2010.Structures of the O-antigens of Escherichia coli 013，0129，and 0135related to the O-antigens of Shigella flexner1.Carbohydr Res345:1594-1599 ；Perepelov AV, Lf Vov V L, Liu B，Senchenkova SN，Shekht ME，ShashkovAS，Feng L，Aparin PG, Wang L，Knirel YA.2009.A similarity in the 0-acetylat1npattern of the O-antigens of Shigella flexneri typesla,lb, and2a.CarbohydrRes344:687-692 ；Kubler-Kielb J，Vinogradov E，Chu C，Schneerson R.2007.0-Acetylat1n in the 0-specific polysaccharide isolated from Shigella flexneriserotype2a.Carbohydr Res342:643-647 ；Wang J， Knirel YA, Lan R， SenchenkovaSN，Luo X，Perepelov AV, Wang Y，Shashkov AS，Xu J，Sun Q.2014.1dentificat1nof an 0-acyltransferase gene (oacB)that mediates3-and4-0-acetylat1n ofrhamnose III in Shigella flexneri 0 antigens.J Bacter1l196:1525-1531.)。3/4-0-acetylat1n干扰同一四糖骨架糖基上的糖基化修饰(群O-因子7，8)和磷酸乙醇胺修饰(群O-因子IV-1)，导致7，8决定簇消失和IV-1抗原性降低(Sim Q, KnirelYA, Lan R，Wang J，Senchenkova SN，Shashkov AS，Wang Y，Wang Y，Luo X，Xu J.2014.Disseminat1n and serotype modificat1n potential of psFxv_2, an 0-antigen PEtNmodificat1n plasmid in Shigella flexner1.Glycob1logy24:305-313)。进一步石开究表明一个转座子样结构携带一个命名为oacB的乙酰基转移酶基因介导了血清型la，lb, 2a, 5a 和 Y 中的 3/4-0-acetylat1n (Wang J，Knirel YA, Lan R，Senchenkova SN，Luo X，Perepelov AV, Wang Y，Shashkov AS，Xu J，Sun Q.2014.1dentificat1n of an0-acyltransferase gene (oacB)that mediates3-and4-0-acetylat1n of rhamnoseIII inShigella flexneri 0 antigens.J Bacter1ll96:1525-1531)，血清型6 中的3/4-0-acetylat1n是由一个和oacB同源的、嗷菌体样结构携带的命名为oacC的基因介导的(Wang J，Knirel YA, Lan R，Senchenkova SN，Luo X，Perepelov AV, Wang Y，ShashkovAS，Xu J，Sun Q.2014.1dentificat1n of an 0-acyltransferase gene(oacB)thatmediates3-and4-0-acetylat1n of rhamnose III in Shigella flexneri 0 antigens.J Bacter1ll96:1525-1531)。oacB 和 oacC 基因在血清型 la，lb，2a，5a，Y 和 6 中广泛存在，它赋予宿主一个新的抗原决定簇，命名为0-因子9(Wang J，Lan R，Knirel YA，LuoX，Senchenkova SN，Shashkov AS，Xu J，Sun Q.2014.Serological Identificat1n andPrevalence of a Novel 0-Antigen Epitope Linked to3-and4-0-Acetylated RhamnoseIII of Lipopolysaccharide in Shigella flexner1.J Clin Microb1l52:2033-2038)。oacB和oacC基因不介导在GlcNAc的6-0-acetylat1n，因为只有这种修饰的菌中没有检测到基因 oacB 和 oacC，并且携带 6-0-acetylat1n 和 3/4-0-acetylat1n 菌株中 oacB基因的失活并不影响 6-0-acetylat1n (Wang J，Knirel YA，Lan R, Senchenkova SN，Luo X，Perepelov AV, Wang Y，Shashkov AS，Xu J，Sun Q.2014.1dentificat1n of an0-acyltransferase gene (oacB)that mediates3-and4-0-acetylat1n of rhamnose IIIin Shigella flexneri 0 antigens.J Bacter1ll96:1525-1531)。因此福氏志贺菌0_抗原的6-0-acetylat1n有另外的机制。
【发明内容】
[0011]本发明的首要目的在于寻找福氏志贺菌O抗N-乙酰葡糖胺6位碳原子乙酰化修饰(6-0-acetylat1n)的决定因子，建立一种分子生物学检测福氏志贺菌O抗N-乙酰葡糖胺6位碳原子乙酰化修饰的方法。
[0012]本发明的进一步目的在于提供针对福氏志贺菌oacD基因或O抗N-乙酰葡糖胺6位碳原子乙酰化修饰抗原表位的检测试剂在用于制备福氏志贺菌O抗N-乙酰葡糖胺6位碳原子乙酰化修饰检测剂中的应用。
[0013]本发明的其他目的在于提供福氏志贺菌O抗N-乙酰葡糖胺6位碳原子乙酰化修饰检测用制剂，检测福氏志贺菌O抗N-乙酰葡糖胺6位碳原子乙酰化修饰的方法，以及区分福氏志贺菌因子10阴性和阳性血清型的方法。
[0014]福氏志贺菌中O-抗原的修饰发生在O抗合成的晚期，他导致同一个O-多糖骨架上多种多样的O-抗原决定簇的表达。目前为止，这些修饰包括如下几种分子因素:i)温和噬菌体携带gtr基因座介导糖基化修饰的，或者一个单一的Oac(OacA)基因介导的Rha1StJ 2-0-acetylat1n (Allison GEiVerma NK.2000.Serotype-converting bacter1phagesand 0-antigen modificat1n in Shigella flexner1.Trends Microb1l8:17-23)；ii)转座子样结构携带的oacB或者oacC基因介导Rhain的3/4-0-乙酰化修饰(WangJ, Knirel YA, Lan R, Senchenkova SN, Luo X, Perepelov AV, Wang Y, Shashkov AS,Xu J, Sun Q.2014.1dentificat1n of an 0-acyltransferase gene (oacB)thatmediates3-and4-0-acetylat1n of rhamnose III in Shigella flexneri 0 antigens.JBacter1ll96:1525-1531) ；iii)质粒携带的 optll 或 optIII 介导 Rha11 和 / 或 Rham 的PEtN 修饰(Sun Q, Y.A.Knirel, R.Lan, J.Wang, S.N.Senchenkova, D.Jin, A.S.Shashkov,S.Xia AV, Perepelov, Q.Chen, Y.Wang, H.Wang, J.JX.2012.A novel plasmid-encodedserotype convers1n mechanism through addit1n of phosphoethanolamine to the0-antigen of Shigella flexner1.PLoS 0ne7:e46095 ；Knirel YA, Lan R, SenchenkovaSN, Wang J, Shashkov AS, Wang Y, Perepelov AV, X1ng Y, Xu J, Sun Q.2013.0-antigenstructure of Shigella flexneri serotype Yv and effect of the Ipt-O genevariat1n on phosphoethanolamine modificat1n of S.flexneri O-antigens.Glycob1logy23:475-485)。本发明研究发现菌株Sf301和51581以及HN006中存在一个染色体基因SF0309，其编码蛋白介导GlcNAc上6_0_乙酰化修饰，本发明中命名这个SF0309编码的6-0-乙酰基转移酶为OacD (其氨基酸序列参见SEQ ID N0.2)，相应的基因命名为oacD基因(其核苷酸序列参见SEQ IDN0.1)。
[0015]GlcNAc上的6-0-乙酰化修饰赋予宿主一个额外的0_抗原表位,本发明中命名该新的抗原表位为因子10。
[0016]本发明通过一系列的实验证据阐明了 oacD基因在福氏志贺菌O-抗原修饰中的作用:i)0acD蛋白和其它乙酰基转移酶同源,都属于乙酰基转移酶家族(Acyl_transf_3)；ii)oacD基因的存在和O-抗原的GIcNAc上有6_0_乙酰化修饰有很明确的关联关系；iii)oacD的缺失导致6-0-乙酰化修饰的缺失,克隆的oacD能够介导转化子6_0_乙酰化修饰；iv)自然界分离的一些oacD缺失株缺失6-0-乙酰化修饰。
[0017]本发明首次报道了一个血清型转换噬菌体携带两个因子参与了不同O-抗原修饰。oacD基因位于SfII基因组中，可以在自然界中通过SfII感染机制与gtrll基因座一起转移。oacD基因的上游存在一个插入序列，表明这个基因可能通过早期的插入事件整合到SfII基因组中。gtrll基因座和oacD基因的共存在提示这两个因子在功能上可能互相影响，但是在一些gtrll基因座发生失活突变的菌株中仍有6-0-乙酰化修饰，表明oacD基因可以不需要gtr基因座的辅助而介导6-0-乙酰化修饰。转化一个oacD基因表达载体PSQZ6至血清型Y的菌株036 (基因组中没有任何血清型转换噬菌体)，得到6-0-乙酰化修饰阳性的表型，进一步证实了这个结论。
[0018]血清型转换噬菌体Sf II整合在宿主染色体保守基因proA和adrA之间的tRNA-thrff 位点(Allison GE, Verma NK.2000.Serotype-converting bacter1phagesand 0-antigen modificat1n in Shigella flexner1.Trends Microb1l8:17-23 ;Mavris M, Manning PA, Morona R.1997.Mechanism of bacter1phage SfI1-mediatedserotype convers1n in Shigella flexner1.Mol Microb1l26:939-950)。 之前的研究表明，介导Rham的3/4-0-乙酰化修饰的oacB基因位于adrA基因的上游(Wang J, Knirel YA, Lan R, Senchenkova SN, Luo X, Perepelov AV, Wang Y, ShashkovAS，Xu J，Sun Q.2014.1dentificat1n of an 0-acyltransferase gene (oacB)thatmediates3-and4-0-acetylat1n of rhamnose III in Shigella flexneri 0 antigens.JBacter1ll96:1525-1531)。因此，介导糖基化修饰和两种类型的O-乙酰基修饰均位于血清2型菌株的proA-adrA区域,说明这个区域是福氏志贺菌O-抗原修饰发生转化的热点。
[0019]众多的福氏志贺菌血清型中，O抗四糖骨架同一单糖上可能携带不同的化学基团，例如，在血清型X，2b和4av中RhaIII的3位上连接糖基、O-乙酰基或者PEtN基团从而形成不同的 O-因子(分别是 7，8;9;和 IV-l)(Wang J，Lan R，Knirel YA，Luo X，Senchenkova SN，Shashkov AS，Xu J，Sun Q.2014.Serological Identificat1n andPrevalence of a Novel 0-Antigen Epitope Linked to3-and4-0-Acetylated RhamnoseIII of Lipopolysaccharide in Shigella flexner1.J Clin Microb1l52:2033-2038 ;Sun Q，Y.A.Knirel，R.Lan, J.Wang, S.N.Senchenkova, D.Jin, A.S.Shashkov, S.Xia AV,Perepelov, Q.Chen, Y.Wang, H.Wang, J.JX.2012.A novel plasmid-encoded serotypeconvers1n mechanism through addit1n of phosphoethanolamine to the 0-antigenof Shigella flexner1.PLoS 0ne7:e46095 ；Kenne L，Lindberg B，Petersson K，Katzenellenbogen E，Romanowska E.1978.Structural studies of Shigella flexneriO-antigens.Eur J B1chem91:279-284)。早期已经证明在oacB基因转化后，血清型2b和XO抗RhaIII上3-糖基可以完全或者大部分(血清型X)被3-或4-0乙酰基取代(Wang J，Knirel YA, Lan R，Senchenkova SN，Luo X，Perepelov AV, Wang Y，ShashkovAS，Xu J，Sun Q.2014.1dentificat1n of an 0-acyltransferase gene (oacB)thatmediates3-and4-0-acetylat1n of rhamnose III in Shigella flexneri 0 antigens.J Bacter1lige:1525-1531)。本发明研究有一个相似的GlcNAc上糖基的取代，用oacD基因转化Ia和4b后都得到了 6-0-乙酰基。然而这样的取代只是部分的，而且6-0-乙酰化的程度(~25-30% )比自然界发生的福氏志贺菌的修饰(40-65% )低(Sun QiKnirelYA, Lan R，Wang J，Senchenkova SN，Shashkov AS，Wang Y，Wang Y，Luo X，Xu J.2014.Disseminat1n a nd serotype modificat1n potential of pSFxv_2, an 0-antigen PEtNmodificat1n plasmid in Shigella flexner1.Glycob1logy24:305-313 ；Perepelov AV,Shekht ME，Liu B，Shevelev SD, Ledov VA, Senchenkova SN，Lf Vov V L, Shashkov AS，Feng LiAparin PGiWang LiKnirel YA.2012.Shigella flexneri O-antigens revisited:final elucidat1n of the 0-acetylat1n profiles and a survey of the 0-antigenstructure diversity.FEMS Immunol Med Microb1l66:201-210)。因此，不同乙酉先基转移酶介导的O-乙酰化修饰和糖基化修饰的相互作用是有区别的:在GlcNAc上，oacD介导的6-0-acetylat1n和糖基化修饰是竞争的，而在Rhain上，oacB介导的3/4-0-acetylat1n抑制了同一位点的糖基化修饰。
[0020]像Rhain的3/4-0-乙酰化修饰一样，GlcNAc上的6_0_乙酰化修饰赋予宿主一个新的O-抗原表位，之前，这个抗原表位是被忽视的，因为没有特异的抗血清用于检测。这个新的抗原表位，本发明命名为因子10，在所有2型和携带SfII噬菌体残基的其它血清型中都表达。值得注意的是2型菌株是中国及其他国家最优势的血清型(yon Seidlein L，Kim DR, Ali M，Lee H，Wang X，Thiem VD, Canh do G，Chaicumpa W，Agtini MD，HossainA，Bhutta ZA，Mason C，Sethabutr 0，Talukder K，Nair GB，Deen JL，Kotloff K，ClemensJ.2006.A multicentre study of Shigella diarrhoea in six Asian countries:disease burden，clinical manifestat1ns，and microb1logy.PLoS Med3:e353 ；Ye C，Lan R，Xia S，Zhang J，Sun Q，Zhang S，Jing H，Wang L，Li Z，Zhou Z，Zhao A，Cui Z，Cao J，Jin D，Huang L，Wang Y，Luo X，Bai X，Wang P，Xu Q，Xu J.2010.Emergence ofa new multidrug-resistant serotype X variant in an epidemic clone of Shigellaflexner1.J Clin Microb1l48:419-426)，不排除 Rha1 的 4-糖基化修饰和 GlcNAc 的6-0-乙酰化修饰同时存在，赋予宿主菌II型抗原和群10抗原决定簇，导致这种血清型在自然界中的流行。
[0021]因子10抗原表位的存在并不影响其他抗原表位的表达，因此，将群O-因子10加入目前福氏志贺菌血清分型体系来检测携带oacD基因，即GIcNAc上携带6_0_乙酰化的修饰的菌是合理的。
[0022]从而，在上述研究基础上，一方面，本发明提供了针对福氏志贺菌oacD基因或
O-抗原6-0-乙酰化修饰抗原表位(因子10)的检测试剂在制备用于检测福氏志贺菌O抗N-乙酰葡糖胺6位碳原子乙酰化修饰的检测剂中的应用。其中，所述的福氏志贺菌oacD基因具有如SE ID N0.1所示核苷酸序列或其特异性片段。
[0023]本发明还提供了针对福氏志贺菌oacD基因或O抗N-乙酰葡糖胺6位碳原子乙酰化修饰抗原表位的检测试剂在制备用于检测福氏志贺菌的血清型的检测剂中的应用。
[0024]根据本发明的具体实施方案，上述针对福氏志贺菌oacD基因或O抗N-乙酰葡糖胺6位碳原子乙酰化修饰抗原表位的检测试剂包括针对福氏志贺菌oacD基因的检测引物或针对O抗N-乙酰葡糖胺6位碳原子乙酰化修饰抗原表位的抗血清。
[0025]根据本发明的优选具体实施方案，本发明中，所述针对福氏志贺菌oacD基因的检测试剂是采用生物技术例如PCR方法检测待测样品中oacD基因存在与否的试剂。更具体地，其包括本发明为检测oacD基因而专门设计的以下特异性引物:
[0026]SEQ ID N0.3 与 SEQ ID N0.4。
[0027]在本发明的一具体实施方案中，本发明还基于新发现的抗原表位制备了特异性的抗血清10，根据福氏志贺菌O-抗原是否存在6-0-乙酰化修饰，该抗血清10可以进一步将现有的血清型分为抗血清10阴性或阳性的血清型，从而可以进一步明确及规范福氏志贺菌的血清型分类。
[0028]另一方面，本发明还提供了一种用于检测福氏志贺菌O抗N-乙酰葡糖胺6位碳原子乙酰化修饰或用于检测福氏志贺菌血清型的检测剂，该检测剂包括针对福氏志贺菌oacD基因或O抗N-乙酰葡糖胺6位碳原子乙酰化修饰抗原表位的检测试剂。其中，优选地，所述针对福氏志贺菌oacD基因或O抗N-乙酰葡糖胺6位碳原子乙酰化修饰抗原表位的检测试剂包括针对福氏志贺菌oacD基因的检测引物或针对O抗N-乙酰葡糖胺6位碳原子乙酰化修饰抗原表位的抗血清。
[0029]另一方面，本发明还提供了一种检测福氏志贺菌O抗N-乙酰葡糖胺6位碳原子乙酰化修饰的方法，该方法包括利用针对福氏志贺菌oacD基因或O抗N-乙酰葡糖胺6位碳原子乙酰化修饰抗原表位的检测试剂进行检测。在本发明的一具体实施例中，该方法是包括利用引物对SEQ ID N0.3与SEQ ID N0.4进行扩增；优选所述扩增为聚合酶链式反应。
[0030] 另一方面，本发明还提供了一种福氏志贺菌O抗N-乙酰葡糖胺6位碳原子乙酰化修饰检测用试剂盒，该试剂盒包含针对福氏志贺菌oacD基因或O抗N-乙酰葡糖胺6位碳原子乙酰化修饰抗原表位的检测试剂；优选地，包含引物对SEQ ID N0.3与SEQ ID N0.4。
[0031]根据本发明的具体实施方案，本发明中所述检测剂(检测用制剂)是用于对分离的福氏志贺菌菌株进行检测，或者用于检测包含福氏志贺菌的鉴别诊断用样品，优选用于对分离的福氏志贺菌菌株进行检测。具体地，所述的检测剂可以是试剂盒。本发明的检测试剂具有较高的特异性，可应用于离体病人样品(例如排泄物、肠积液、呕吐物等)、可能混有福氏志贺菌的水样、土壤、食品、化妆品等样品的检测，这些样品可以经过或不经过任何富集。
[0032]本发明所设计的检测用引物具有较高的特异性，鉴定时只需要菌株或样品的DNA作为模板，不需要分离单菌落，根据扩增结果，可快速检测待测样品中oacD基因存在与否，从而进一步鉴别福氏志贺菌O抗N-乙酰葡糖胺6位碳原子乙酰化修饰，更进一步判别血清型。采用生物分子学检测的方法，结果判定简易、客观，避免了传统血清免疫凝集反应中的主观性、不稳定性等问题。
[0033]本发明促使对福氏志贺菌O抗变异及血清型转换机制有了进一步的了解，这对志贺菌的流行病学监测以及菌痢疫苗的发明有帮助。
【专利附图】
【附图说明】
[0034]图1A与图1B为oacD基因缺失及缺失子PCR鉴定示意图。其中，图1A.—步法缺失oacD基因；图1B.利用引物对oacD-Ι和oacD_2进行PCR扩增鉴定缺失株。
[0035]图2为不同菌株O-多糖结构的核磁共振波谱。
[0036]图3 为福氏志贺菌(Sf301，2457T，2747-71，HN006 和 51581)和大肠杆菌(KTE33，
1-176-05_S3_C2) oacD基因两翼的区域测序分析结构图。
[0037]图4A与图4B为实施例4中免疫印迹试验凝胶电泳图。
[0038]图5A~图5G为利用引物对oacD-lPCR检测672株菌的部分电泳图谱。
【具体实施方式】
[0039]为了更清楚地理解本发明，现参照下列实施例及附图进一步描述本发明。实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。实施例中未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照制造商所建议的条件。
[0040]材料与方法
[0041]伦理声明
[0042]本发明研究是经过中国疾病预防控制中心传染病预防控制所伦理委员会评估和批准的。
[0043]本发明各实施例中所采用的主要菌株、质粒和培养条件如下:
[0044]本发明中所用的主要菌株和质粒见表1。具有6-0-乙酰化修饰的福氏志贺菌Sf301 (血清型 2a) (Wang J, Knirel YA, Lan R, Senchenkova SN, Luo X, Perepelov AV,ffangY,Shashkov AS,Xu J,Sun Q.2014.1dentificat1n of an 0-acyltransferase gene(oacB)that mediates3-and4-0-acetylat1n of rhamnose III in Shigella flexneri 0antigens.J Bacter1ll96:1525-1531)作为oacD基因缺失和互补分析的参考菌株。福氏志贺菌 51571(血清型 la)和 51577 (血清型 4b) (Sun Q, Knirel YA，Lan R，Wang J,Senchenkova SN, Shashkov AS, Wang Y, Wang Y, Luo X, Xu J.2014.Disseminat1n andserotype modificat1n potential of pSFxv2,an 0—antigen PEtN modificat1n plasmidin Shigella flexner1.Glycob1logy24:305-313)用于宿主 oacD 基因功能分析。大肠杆菌JM109(TaKaRa，日本)用于质粒增殖。pMD20T载体(TaKaRa，日本)用于oacD基因克隆及DNA测序分析。质粒PRS551用于卡那抗性基因扩增。pKOBEG编码同源重组系统用于oacD基因缺失分析。已知O-抗原结构的31株福氏志贺菌(表2)用于oacD的PCR检测分析。另外641株包括18个血清型的福氏志贺菌用于PCR检测oacD基因和抗血清10的凝集分析(表3)。这些菌或者是分离自腹泻病人，来源于中国疾病预防控制中心2000-2012年的菌痢监测项目，或者是从NCTC购买，或者是由刘斌博士(天津南开大学，中国)捐赠，12株痢疾志贺菌(从1-12血清型各I株)，18株鲍氏志贺菌(从1-18血清型各I株)，14株宋内志贺菌(2株I相和12株II相)，10株大肠杆菌(包括血清型06，08，013，044，071，078，0127，0128，0157，0159各I株)，这些菌都用于oacD基因PCR扩增和抗血清10的特异性评价(表7)。菌株接种在LB培养基中，可以根据需要含有氨苄西林(lOOygmr1)、卡那霉素(40 μ gmr1)、氯霉素(50 μ gml—1)，在37°C温箱或者摇床孵育。
[0045]本发明各实施例中所采用的主要实验方法如下:
[0046]生物信息学分析
[0047]用BLASTP (http://www.ncb1.nlm.nih.gov/BLAST)将 Sf6 的 Oac 蛋白序列(Access1n N0.NP_958191.1), Sf301 的 OacB(NP_706267.1)和 CDC796-83 的0acC(WP_005054336.1)序列与福氏志贺菌Sf301 (NC_004337.1)的蛋白库进行比对。将比对得到的同源蛋白用BLASTn进一步在福氏志贺菌2002017 (CP001383)和036 (CP004056)(两者都缺少 6-0-acetylat1n on GlcNAc) (Sun Q, Y.A.Knirel, R.Lan, J.Wang,S.N.Senchenkova, D.Jin, A.S.Shashkov, S.Xia AV, Perepelov, Q.Chen, Y.Wang, H.Wang,J.JX.2012.A novel plasmid-encoded serotype convers1n mechanism throughaddit1n of phosphoethanolamine to the 0—antigen of Shigella flexner1.PLoSOne7:e46095 ；KnireI YA,Lan R,Senehenkova SN,Wang J,Shashkov AS,Wang Y,PerepelovAV, X1ng Y, Xu J, Sun Q.2013.0—antigen structure of Shigella flexneri serotypeYv and effect of thelpt—0 gene variat1n on phosphoethanolamine modificat1nofS.flexneri 0-antigens.Glycob1logy 23:475-485)，51581 (AZPG00000000)和HN006 (CP004057)(两者都携带 6-0-acetylat1n) (Knirel YA, Lan R, Senehenkova SN,Wang J, Shashkov AS, Wang Y, Perepelov AV, X1ng Y, Xu J, Sun Q.2013.0-antigenstructure of Shigella flexneri serotype Yv and effect of the Ipt-O genevariat1n on phosphoethanolamine modificat1n of S.flexneri 0-antigens.Glycob1logy23:475-485)的基因组进行搜索比对。
[0048]DNA 技术
[0049]用DNA提取试剂盒(Qiagen，德国)按照操作手册提取基因组和质粒DNA。本发明用的引物列于表4中。引物对oacD-l(SEQ ID N0.3与SEQ ID N0.4)用于检测oacD基因。引物对oacD-2(SEQ ID N0.5与SEQ ID N0.6)用于oacD基因功能分析。引物对oacD-3 (SEQID N0.7与SEQ ID N0.8)用于扩增福氏志贺菌51575和G1665 (两者都是3a血清型)的oacD基因两侧区域。引物对gtrll-l (SEQ ID N0.9与SEQ ID N0.10)用于扩增SfII特异基因。gtrll用于前噬菌体SfII基因组检测。引物对gtrI1-2(SEQ ID N0.11与SEQ IDN0.12)用于序列分析,其扩增产物是跨越整个gtr (gtrA, gtrB和gtrll)区域。oacD_2扩增的产物用于克隆到TA-pMD20T载体中，形成表达质粒pSQZ6。首先将此复合质粒转化到商业感受态细胞E.coli JM109中，然后用标准化学流程(29)转化到福氏志贺菌中。转化子在添加了氨节西林(10ygmr1)的LB平皿筛选,并用oacD基因PCR扩增的方法来验证。寡核苷酸引物是由生工科技公司(上海，中国)合成。PCR扩增是用TaKaRa的PCR扩增试剂盒(TaKaRa，日本)按照操作手册进行。
[0050]oaeD基因的功能性缺失和回补分析
[0051]用一步法(WangJ, Knirel YA, Lan R, Senehenkova SN, Luo X, Perepelov AV,Wang Y, Shashkov AS, Xu J, Sun Q.2014.1dentificat1n of an 0-acyItransferasegene (oacB)that mediates3-and4-0_acetylat1n of rhamnose III in Shigellaflexneri 0 antigens.J Bacter1l196:1525-1531 ;Datsenko KA, Wanner BL.2000.0ne-step inactivat1n of chromosomal genes in Escherichia coli K_12using PCRproducts.Proc Natl Acad Sci U S A 97:6640-6645)将福氏志贺菌 Sf301 的 oacD 基因敲除。用kan引物(表4，SEQ ID N0.13与SEQ ID N0.14)扩增质粒pRS551来得到氨基糖苷类3’ -磷酸转移酶编码的基因Kmlr。PCR产物通过电击转化携带pKOBEG质粒的Sf 301，然后在含有氯霉素(SOygmr1)和卡那霉素(40 μ gmr1)的LB平皿筛选。oacD基因缺失的突变株Sf 301 Δ oacD通过PCR扩增引物oacD_l和oacD_2来进一步确认(图1B)。将质粒 pSQZ6 转入 Sf301 Δ oacD, 51571 (Ia)，和 51577 (4b)分别得到 oacD 互补菌 Sf301 Δ oacD_pSQZ6，51571_pSQZ6，和 51577_pSQZ6。
[0052]针对乙酰葡糖胺上连接的6-0-乙酰化的特异的抗血清10的制备
[0053] 免疫和抗血清的制备是按照现有技术的描述进行(Freter R.1957.Agglutinating efficiency and combining capacity of Shigella and Vibr1 antiserafrom rabbits at different stages of immunizat1n.J Exp Medl05:623-634 ；Wang J, Lan R, Knirel YA, Luo X, Senchenkova SN, Shashkov AS, Xu J, Sun Q.2014.Serological Identificat1n and Prevalence of a Novel 0-Antigen Epitope Linkedto3-and4-0-Acetylated Rhamnose III of Lipopolysaccharide in Shigella flexner1.J Clin Microb1l52:2033-2038)。简单说，静脉注射福氏志贺菌Sf301免疫3只新西兰白兔(雌性，1.5-2kg)，连续三周，每周两次，注射剂量逐步增加(1X109，2X109，4X109，8X109，16X109，16X 19CFU)，，末次注射一周后心脏取血分离血清。用灭活的福氏志贺菌Sf301 AoacD来吸附与其他O-抗原表位交叉反应的非特异的抗体(Freter R.1957.Agglutinating efficiency and combining capacity of Shigella and Vibr1 antiserafrom rabbits at different stages of immunizat1n.J Exp Medl05:623-634)。只与Sf301凝集但是不与Sf301 AoacD凝集的血清，命名为抗血清10。
[0054]血清型分析
[0055]福氏志贺菌血清学特征是通过血清玻片凝集实验显示，使用的抗血清是商业购买的单价抗血清(Denka Seiken,日本)和单克隆抗体(Reagensia AB,瑞士), Rham上3/4-0-乙酰化修饰特异的抗血清9是之前制备的(Wang J, Lan R, Knirel YA, Luo X,Senehenkova SN，Shashkov AS，Xu J，Sun Q.2014.Serological Identificat1n andPrevalence of a Novel O-Antigen Epitope Linked to3-and4-0-Acetylated RhamnoseIII of Lipopolysaccharide in Shigella flexner1.J Clin Microb1l52:2033-2038)，本发明研究制备的抗血清10是用于检测GlcNAc6-0-乙酰化修饰连，用裸眼观察20秒内凝集的认为是阳性。
[0056]Western 杂交分析
[0057]LPS是用LPS提取试剂盒(iNtRON，韩国)提取，按照操作手册进行。LPS用15%的聚丙烯酰胺凝胶电泳并用银染检测(Morona R，Brown MH, Yeadon J，Heuzenroeder MW，Manning PA.1991.Effect of lipopolysaccharide core synthesis mutat1ns on theproduct1n of Vibr1 cholerae 0—antigen in Escherichia coli K-12.FEMS Microb1lLett 66:279-285 ；Daniels CiMorona R.1999.Analysis of Shigella flexneri Wzz(Rol)funct1n by mutagenesis and cross-linking:Wzz is able to oligomerize.MolMicrob1l34:181-194)。Western 杂交分析是按照之前的方法进行(Wang J, Lan RiKnirelYA, Luo X，Senchenkova SN，Shashkov AS，Xu J，Sun Q.2014.Serological Identificat1nand Prevalence of a Novel O-Antigen Epitope Linked to3-and4-0-AcetylatedRhamnose III of Lipopolysaccharide in Shigella flexner1.J Clin Microb1l52:2033-2038)。SDS-PAGE分离的LPS转移到PVDF膜上并用抗血清10孵育。洗膜后用抗兔的抗体标记焚光 IRDye?800 (Rockland)。然后用 Odyssey Infrared Imaging System(L1-COR)来检测。
[0058]O-多糖的分离和结构分析
[0059]野生型、突变株和转化株的脂多糖通过酚-水提取(Westphal 0.，K.J.1965.Bacterial Iipopolysaccharides.Extract1n with phenol-water and furtherapplicat1ns of the procedure.Methods Carbohydr Chem.5:83-90)。没有分层的原始提取物用自来水透析，在4°C通过添加含有50%水的CCl3CO2H至？!12来将核酸和蛋白沉淀，将上清用无菌水透析并冻干来得到菌体干重到7.6-9.6%的纯化的LPS。将LPS用含有2%乙酸的水溶液10i5C降解，通过G-50精细交联葡聚糖柱(Amersham B1sciences，瑞士)凝胶渗透层析，LPS分离到O-多糖的产率是18-51%，缓冲液是0.05M吡啶醋酸盐，pH4.5，通过差示折光计(Knauer，德国)监测。
[0060]用二维NMR核磁共振波谱来阐明O-多糖的结构(Knirel YAiLan R, SenchenkovaSN，Wang J，Shashkov AS，Wang Y，Perepelov AV, X1ng Y，Xu J，Sun Q.2013.0—antigen structure of Shigella flexneri serotype Yv and effect of the Ipt-Ogene variat1n on phosphoethanolamine modificat1n ofS.flexneri 0-antigens.Glycob1logy23 =475-485) 0 1H和13C NMR核磁共振波谱是用关联能谱法(COSY)和全关联能谱法(TOCSY)以及1H、13C异核单量子相干谱(HSQC)来检测。转化株的O-乙酰基位置是通过对比缺少O-乙酰基的O-多糖与O-乙酰基位置有H或C原子取代的信号方法来确定。6-0-乙酰化的程度是通过GlcNAc上有O-乙酰化修饰和没有O-乙酰化修饰的H的核磁共振波谱的相对积分强度得到。
[0061]实施例1、一个乙酰基转移酶基因oacD的鉴定，其只存在于GIcNAc上有6_0_乙酰化修饰的福氏志贺菌
[0062]目前，三个负责福氏志贺菌O-乙酰化的基因已经鉴定，包括Rhal-O-acetylat1n的 oac 基因(后改名为 oacA(Wang J, Knirel YA, Lan R, Senchenkova SN, Luo X,Perepelov AV, Wang Y, Shashkov AS, Xu J, Sun Q.2014.1dentificat1n of an0-acyItransferase gene(oacB)that mediates3-and4-0_acetylat1n of rhamnose IIIin Shigellaflexneri 0 antigens.J Bacter1l 196:1525-1531))，Rham3/4-0-乙酸化修饰的 oacB 和 oacC(Wang J, Knirel YA, Lan R, Senchenkova SN, Luo X, Perepelov AV,Wang Y, Shashkov AS, Xu J, Sun Q.2014.1dentificat1n of an 0-acy I transferasegene(oacB)that mediates3-and4-0-acetyIat 1n of rhamnose III in Shigellaflexneri 0 antigens.J Bacter1ll96:1525-1531 ；ffang J, Lan R, Knirel YA, Luo X,Senchenkova SN, Shashkov AS, Xu J, Sun Q.2014.Serological Identificat1n andPrevalence of a Novel O-Antigen Epitope Linked to3-and4-0-Acetylated RhamnoseIII of Lipopolysaccharide in Shigella flexner1.J Clin Microb1l52:2033-2038)。但现有技术并未有关于血清型2a，3a，Y和Yv中的6_0_乙酰化修饰的决定因子的报道。
[0063]本案发明人通过一系列的试验发现血清型2a，3a, Y和Yv中的6_0_乙酰化修饰是由一个oac同源的基因介导的。发明人在研究中通过将OacA, OacB和OacC蛋白序列与福氏志贺菌Sf301 (血清型2a)的基因组进行BLASTp和tBLASTn比对，Sf301的GlcNAc上有6-0-乙酰化修饰，找到几个和Oac蛋白同源的蛋白(表8)，并将它们进一步和福氏志贺菌HN006, 51581 (两者都含有GlcNAc的6-0-乙酰化修饰),2002017和036 (两者都缺少6-0-乙酰化修饰)的基因组进行比对。结果发现，Sf301和51581以及HN006中存在一个染色体上的基因SF0309编码的假定蛋白(基因序列:SEQ ID N0.1 ;蛋白序列:SEQ ID N0.2)，而2002017和036中不存在。它与OacC在氨基酸终端(13_93aa)有27% —致性和45%的相似性，初步推测它负责GlcNAc的6-0-乙酰化修饰。
[0064]SF0309编码的蛋白包括349个氨基酸，含有乙酰基转移酶或乙酰基转移酶家族(Acyl_transf_3or NolL)的保守结构域。BLASTP比对显示这个蛋白与基因组测序的福氏志贺菌 2457T(NP_706261.1)，SFL124 (AY900451.1)，K-1770 (WP_000282634.1)，2747-71 (WP_000613535.1)，血清型转换噬菌体 SfII (YP_008318503.1)，和大肠杆菌ΚΤΕ33(WP_016159269.1)，1-176_05_S3_C2 (EYD87781.1)，KTE-18(WP_001579928.1)，和UMEA3703-1 (WP_001579928.1)在蛋白和 DNA 水平有 98 % -100 % — 致性。与 Pantoeaananatis PA13(YP_005993804.1), Clostridium cellulovorans743Bv(YP_003844488.1),Leptospira kmetyi (WP_020986752.1)以及其它种来源的乙酰基转移酶蛋白有24%-41%一致性。遵循之前对介导2-0-acetylat1n和3/4-0-乙酰化修饰的oacA-oacC命名，，本发明中命名这个SF0309编码的6-0-乙酰基转移酶为OacD，相应的基因命名为oacD。
[0065]用引物对oacD-Ι来筛选其它31株已知O-抗原结构的福氏志贺菌(表2)。菌株51250，G1663 (都是血清型 2a) ,51251(血清型 2b)，51575，G1665 (都是血清型 3a)，51581，G1040 (都是血清型Y)，HN006，AHO12，和HNO11 (都是血清型Yv)都扩增出了预期的PCR产物(822bp)，除了 51251 都具有 6_0_ 乙酰化修饰(Perepelov AV, Shekht ME, Liu B, ShevelevSD, Ledov VA, Senchenkova SN, L1 Vov V L, Shashkov AS, Feng L, Aparin PG, Wang L,Knirel YA.2012.Shigella flexneri 0-antigens revisited:final elucidat1n ofthe 0-acetylat1n profiles and a survey of the 0—antigen structure diversity.FEMS Immunol Med Microb1l 66:201-210 ；Knirel YA, Lan R，Senchenkova SN，Wang J，Shashkov AS，Wang Y，Perepelov AV, X1ng Y，Xu J，Sun Q.2013.0—antigen structureof Shigella flexneri serotype Yv and effect of the Ipt-O gene variat1n onphosphoethanolamine modificat1n of S.flexneri 0-antigens.Glycob1logy23:475-485 ；Sun Q，Knirel YA, Lan R，Wang J，Senchenkova SN，Shashkov AS，Wang Y，WangYjLuo X，Xu J.2014.Disseminat1n and serotype modificat1n potential of pSFxv_2,an 0—antigen PEtN modificat1n plasmid in Shigella flexner1.Glycob1logy24:305-313)。相反，其它没有6-0-乙酰化修饰的菌oacD扩增都阴性(表2)。用oacD_2引物扩增10个oacD阳性的菌的oacD基因全长并测序，发现除了 51251外，所有检测菌株的oacD基因序列与Sf301的oacD基因一致。51251的oacD基因在191位有一个碱基(A)的缺失，导致编码蛋白在第64位氨基酸出现终止密码子。
[0066]实施例2、oacD基因介导了福氏志贺菌0_抗原的GlcNAe的6_0_乙酰化修饰
[0067]为了确定oacD的功能,本实施例用一步法将Sf301进行缺失和互补试验。oacD基因从168到902bp的一段735bp的序列被氨基糖苷类3’-磷酸转移酶编码基因(kan)序列(979bp)取代(图1A)。在氯霉素和卡那霉素抗性平皿筛选缺失株，并用oacD-Ι和oacD_2引物PCR扩增oacD基因缺失株Sf301AoacD来验证(图1B)。Sf301 Λ oacD扩增分别得到1066bp和2179bp的PCR产物，分别比其亲代菌株Sf301的扩增产物长(分别822bp、1935bp)(图1B)。
[0068]为了构建oacD基因表达载体，将来源于Sf301的oacD基因全长1050bp以及885bp的上游和下游含有启动子和终止子序列的一段序列克隆到PMD20T中得到pSQZ6。将这个质粒转化到Sf301AoacD缺失株以及两个野生型的没有oacD和6_0_乙酰化修饰却有同一糖基4-或者6-位碳原子糖基化修饰的福氏志贺菌(血清型Ia的菌51571和血清型4b的菌51577， 相关O-多糖结构见表5)。用生研福氏志贺菌抗血清和抗血清9 (Wang J, Lan R, Knirel YA, Luo X, Senchenkova SN, Shashkov AS, Xu J, Sun Q.2014.Serological Identificat1n and Prevalence of a Novel 0-Antigen Epitope Linkedto3-and4-0-Acetylated Rhamnose III of Lipopolysaccharide in Shigella flexner1.J Clin Microb1l52:2033-2038)血清凝集显示Sf301与其缺失株Sf301 Λ oacD和互补株Sf301AoacD_pSQZ6 没有不同(表 6)。同样的，51571 和 51577pSQZ6 转化子(51571_pSQZ6,51577_pSQZ6)和其亲代菌株血清凝集一致，但是51577_pSQZ6获得了一个III型抗原决定簇(表6)。当用特异性的、针对GlcNAc6-0-乙酰化修饰(称为10因子)的抗血清10检测，可以清楚的看到缺少这个抗原表位的oacD缺失株不能与抗血清凝集,而含有oacD基因、表达这个抗原表位的菌株能与抗血清10凝集(表6)。
[0069]从LPS分离到缺失和互补株的O-多糖，进行NMR分析，确定0_多糖结构(表5)。缺失株Sf301 Δ oacD的核磁共振波谱δ Η2.14缺少6_0_乙酰基团信号(图2中的Α，B)，SP6-0-乙酰化修饰的GlcNAc，特别是对于C-6和H_6a，6b，缺失菌株Sf301 Δ oacD的核磁共振波谱缺少了 S h2.14处6-0-乙酰基(图2中的A，B)和GlcNAc上6_0_乙酰化的信号。用同样的方法，亲代菌株Sf301这些信号存在于δ#4.8和δΗ4.21，4.33处。3-和4_0_乙酰基的信号分别位于Sh2.20和2.16，突变株和亲代菌株中Rham的乙酰残基含量一样(分别是~45%和~25% )。因此，突变株的O-抗原GlcNAc失去了 6_0_乙酰化修饰，而Rhain上的3/4-0-乙酰化修饰没有受到影响。Sf301 AoacD_pSQZ6中含有两个O-乙酰化修饰(图2中的C)，因此，通过携带oacD的质粒pSQZ6，缺失株中的6_0_乙酰化被回复。与亲代相t匕，转化株中6-0-乙酰化修饰没有差异(~65% )。
[0070]通过核磁共振波谱中呈现的δ η2.14处6-0-乙酰基较小的信号(图2中的D_G)，和 6-0-乙酰化的 GlcNAc(Sc64.4、δ Η4.30-4.31，4.41-4.42)，可以看出 pSQZ6 转化子51571_pSQZ6，51577_pSQZ6 的 GlcNAc 获得 6_0_ 乙酰基分别是~25% and ~30% (表 5)。GlcNAc上的糖基化修饰程度相应的从100%降低到了~75%和~70%。在51577_pSQZ6中，不完全的6-乙酰化修饰决定了 III型抗原决定簇，III型抗原决定簇是与Rha1上的2-0-acetylat1n相关的，但是在野生型的4b菌株51577中，III型抗原决定簇被GlcNAc上的糖基化修饰阻碍了。
[0071]实施例3、oacD基因是由血清型转换噬菌体SfII携带，它存在于福氏志贺菌血清型2 (2a，2b)和携带前噬菌体SfII但gtr基因座功能缺失的的的其他血清型中
[0072]将福氏志贺菌(Sf301，2457T，2747-71，HN006和 51581)和大肠杆菌(KTE33,l-176-05_S3_C2)oacD基因两翼的区域测序分析，基因结构图见图3。在所有细菌中，oacD位于前卩遼菌体SfII的gtr基因座(grtA, gtrB, gtrll)下游。一个插入序列(ISsfl3)和两个编码噬菌体尾丝蛋白基因分别位于oacD的上游和下游。这个gtr-1S-oacD-噬菌体尾丝基因结构在基因结构和DNA序列上都与SfII(NC_021857.1)上相应位置一致，SfII是一个从血清型2a菌株NCTC4诱导分离，具有感染转化功能的血清型转换噬菌体(George DT,Stephenson DP,Tran E, Morona R, Verma NK.2013.Complete Genome Sequence of SfII,a Serotype-Converting Bacter1phage of the Highly Prevalent Shigella flexneriSerotype2a.Genome Announcl:e00626_13)(图 3)。
[0073]血清型3a菌株51575和G1665的oacD周围区域用oacD_3引物对扩增并测序，其扩增引物分别位于基因gtrB和oacD上(图3)。两株菌扩增都得到2，295bp的PCR产物(SEQ ID N0.13)，比参考菌株Sf301的扩增产物3，775bp短，。与Sf301扩增产物相比，在gtrB和oacD之间有一个1，675bp的插入序列，导致gtrB基因部分缺失和gtrll至ISsfl3基因全部缺失(图3)。这个1，675bp的插入序列编码了两个假定蛋白，它们的功能未知，在NCBI中也没有找到任何同源序列。本实施例中还发现相似的基因结构也存在不完全测序福氏志贺菌K-1770基因组中(图3)。因此，这三个菌中含有SfII的残余部分。
[0074]这个保守的gtr-1Ssfl3-oacD结构在SfII基因组和oacD阳性菌株中都存在提示oacD基因可能最初由SfII噬菌体携带，在自然界中随着噬菌体感染，其基因组整合到宿主菌中形成前噬菌体保留下来，因此理论上应该在所有含有SfII前噬菌体基因组的菌株中。为了确认这一点，本实施例用oacD-Ι引物来PCR扩增oacD基因来检测183个血清型2的菌株(包括154个2a和29个2b)，结果发现所有的检测菌株oacD阳性(表3)。进一步筛选488株其他血清型的福氏志贺菌株，结果发现除了 31株菌属于3a (2株菌)，Xv (I) ,X(I),Y(14)和Yv (13)外，所有检测菌株都是oacD阴性(表4)。
[0075]以前研究证实这13个oacD阳性Yv血清型菌都携带一个失去功能的gtrll基因簇，由于gtrll基因1，222位碱基和/或gtrB基因560位碱基突变导致功能失活(Sun Q，Lan R, Wang J, Xia S, Wang Y, Jin D, Yu B, Knirel YA, Xu J.2013.1dentificat1n andCharacterizat1n of a Novel Shigella flexneri Serotype Yv in China.PLoS One,8:e70238)。因此，可以推断这些Yv血清型菌是来源于血清型2a的菌，所以携带了 SfII前噬菌体基因组或其残余。用引物gtrll-l来PCR检测SfII前噬菌体基因组特异的gtrll基因显示，除了 3a血清型菌株51575和G1665外(它们失去了 gtrll基因)，其他18个非血清2型的菌全部gtrll基因扩增阳性，。其中10株血清型Y的菌株，I株X和I株Xv其gtrll基因含有碱基缺失、插入或者取代突变，引起的移码突变，导致功能失活(见表3的注释)。4个gtrll阳性的Y，没有发现gtrll基因功能性突变，但是在gtrB基因有一个非同义替换突变，这导致GtrB蛋白187位的一个氨基酸的改变，可能导致gtrll基因簇功能失活。
[0076]因此，oacD是位于噬菌体SfII基因组并且分布于血清型2的菌株和其它携带SfII残基的血清型中。
[0077]实施例4、基因oacD介导的GlcNAc的6_0_乙酰化修饰赋予宿主一个新的抗原决定簇
[0078]本实施例通过血清学研究试验进一步证实了 oacD是位于噬菌体SfII基因组并且分布于血清型2的菌株和其它携带SfII残基的血清型中。
[0079]本发明制备了针对新抗原表位GlcNAc的6_0_乙酰化修饰的兔多克隆抗血清，用携带6-0-乙酰化修饰2a血清型菌Sf 301来免疫兔子，用没有6_0_乙酰化修饰的oacD基因缺失突变株来吸附血清。除了目标抗体外，吸附去掉了针对其他O-抗原抗体。反复进行吸附直至血清只与Sf301凝集而不与Sf301 A0acD凝集。本发明中称为群抗血清10。
[0080]通过免疫印迹试验来验证了血清10的特异性，提取Sf301、缺失突变株Sf301 Δ oacD、互补突变株Sf301 Δ oacD_pSQZ6以及血清型Ia菌51251及其互补株51571_PSQZ6的LPS，用15%的SDS-PAGE胶电泳并银染(图4A)。可以看到，所有的菌都有O-抗原典型的阶梯状带型，亲代菌株和突变株间没有明显的不同(图4A)。Western杂交显示，抗血清 10 只与 Sf301，51571_pSQZ6，和 Sf301 Λ oacD_pSQZ6 这些 GlcNAc 上含有 6-0-乙酰化修饰的菌反应，形成阶梯状带型，而与51571和Sf301 Δ oacD不反应(图4B)。因此，抗血清10是特异的针对O-抗原GlcNAc上6_0_乙酰化修饰相关的抗原表位。
[0081]PCR扩增oacD基因检测过的672株菌(部分PCR电泳图谱见图5A~图5G)再用玻片凝集检测，oacD基因阳性和抗血清10凝集反应两者显示出了很好的一致性。凝集的菌株(总共205株其中血清型2al54株，2b23株，3a2株，Xl株，Y12株，和Yvl3株)，全部oacD阳性(表3)。但有9株菌出株2b，I株Xv和2株Y) PCR阳性但凝集阴性；所有没有oacD基因的菌血清凝集阴性(表4)。9株异常菌的oacD基因用oacD-3扩增并测序。除了HN064(其oacD基因和Sf301中oacD基因序列完全一致)，其余都有191位一个碱基(A)的缺失，或177位一个碱基(T)插入，这导致64位或59位氨基酸出现一个终止密码子。
[0082]这些数据证明，GlcNAc上的6-0-acetylat1n赋予宿主一个新的O-抗原表位,这个抗原表位以前被忽略。遵循福氏志贺菌群O-因子3，4 ;6 ;7，8 ;和9，本发明中命名这个新的抗原决定簇为群O-因子10。可以将其加入到目前福氏志贺菌的血清型分型体系中。
[0083]54株其他种属的菌也做了血清凝集检测，包括12株痢疾志贺，18株鲍氏志贺，14株宋内志贺(2株I相，12株II相)以及10株大肠杆菌。结果发现除了大肠杆菌042 (血清型044)和G1237(血清型013)以及12株宋内II相菌外，所有抗血清10阴性。大肠杆菌013和抗血清10凝集是因为它有一个和福氏志贺菌2a血清型相似的O-抗原结构即GlcNAc上有6-0-乙酰化修饰。并且013的oacD基因PCR扩增确认了一个相似的oacD机制介导 013 中这一修饰 Perepelov AV，Shevelev SD, Liu B，Senchenkova SN，ShashkovAS，Feng L，Knirel YA, WangL 2010.Structures of the 0-antigens of Escherichiacoli 013，0129，and 0135related to the 0-antigens ofShigella flexner1.CarbohydrRes345:1594-1599.。大肠杆菌044的0-抗原没有GlcNAc上的6_0_乙酰化修饰Staaf M，Widmalm GiWeintraub AiNataro JP.1995.Structural elucidat1n of the 0—antigenicpolysaccharide from Escherichia coli 044:H18.Eur J B1chem233:473_477，而宋内II相没有0-抗原，因此其与抗血清10凝集可能有其他原因，需要进一步的研究。
[0084]表1本发明中所用菌株和质粒
[0085]
【权利要求】
1.针对福氏志贺菌OacD基因或O抗N-乙酰葡糖胺6位碳原子乙酰化修饰抗原表位的检测试剂在制备用于检测福氏志贺菌O抗N-乙酰葡糖胺6位碳原子乙酰化修饰的检测剂中的应用。
2.针对福氏志贺菌oacD基因或O抗N-乙酰葡糖胺6位碳原子乙酰化修饰抗原表位的检测试剂在制备用于检测福氏志贺菌的血清型的检测剂中的应用。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其中，所述针对福氏志贺菌oacD基因或O抗N-乙酰葡糖 胺6位碳原子乙酰化修饰抗原表位的检测试剂包括针对福氏志贺菌oacD基因的检测引物或针对O抗N-乙酰葡糖胺6位碳原子乙酰化修饰抗原表位的抗血清。
4.根据权利要求1或2所述的应用，其中，所述的检测剂是用于对分离的福氏志贺菌菌株进行检测，或者用于检测包含福氏志贺菌的鉴别诊断用样品。
5.根据权利要求4所述的应用，其中，所述包含福氏志贺菌的鉴别诊断用样品是来自排泄物、肠积液、呕吐物、土壤、水样、食品或化妆品。
6.一种用于检测福氏志贺菌O抗N-乙酰葡糖胺6位碳原子乙酰化修饰或用于检测福氏志贺菌的血清型的检测剂，该检测剂包括针对福氏志贺菌oacD基因或O抗N-乙酰葡糖胺6位碳原子乙酰化修饰抗原表位的检测试剂。
7.根据权利要求6所述的检测剂，其中，所述针对福氏志贺菌oacD基因或O抗N-乙酰葡糖胺6位碳原子乙酰化修饰抗原表位的检测试剂包括针对福氏志贺菌oacD基因的检测引物或针对O抗N-乙酰葡糖胺6位碳原子乙酰化修饰抗原表位的抗血清。
8.—种检测福氏志贺菌O抗N-乙酰葡糖胺6位碳原子乙酰化修饰的方法，该方法包括利用针对福氏志贺菌oacD基因或O抗N-乙酰葡糖胺6位碳原子乙酰化修饰抗原表位的检测试剂进行检测；优选所述针对福氏志贺菌oacD基因或O抗N-乙酰葡糖胺6位碳原子乙酰化修饰抗原表位的检测试剂包括针对福氏志贺菌oacD基因的检测引物或针对O抗N-乙酰葡糖胺6位碳原子乙酰化修饰抗原表位的抗血清。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述针对福氏志贺菌oacD基因的检测引物包含引物对 SEQ ID N0.3 与 SEQ ID N0.4。
10.一种福氏志贺菌O抗N-乙酰葡糖胺6位碳原子乙酰化修饰检测用试剂盒，该试剂盒包含针对福氏志贺菌oacD基因或O抗N-乙酰葡糖胺6位碳原子乙酰化修饰抗原表位的检测试剂；优选地，包含引物对SEQ ID N0.3与SEQ ID N0.4。
【文档编号】G01N33/569GK104164489SQ201410345012
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2014年7月18日 优先权日:2014年7月18日
【发明者】孙强正, 王建平, 罗霞 申请人:中国疾病预防控制中心传染病预防控制所