一种微球荧光强度标准物质的定值方法
【专利摘要】本发明公开了一种微球荧光强度标准物质的定值方法，其包括如下步骤：(1)制备微球荧光强度标准物质；(2)测定荧光素粉末纯度，以备计算配制荧光素标准母液；(3)校准荧光分光光度计，建立仪器荧光响应值与荧光素浓度的校准曲线；(4)测定微球荧光强度标准物质的颗粒数量浓度；(5)测量样品荧光响应值，计算样品中的荧光素浓度和每个微球荧光强度标准物质颗粒所携带的荧光分子数MESF。本发明定值方法具有良好的准确性、可靠性和量值溯源性。
【专利说明】
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种标准物质的定值方法，特别是涉及一种微球荧光强度标准物质的 定值方法。 一种微球荧光强度标准物质的定值方法
【背景技术】
[0002] 流式细胞分析（Flow cytometry，FCM)是以高能量激光照射高速流动状态下被突 光色素染色的单细胞或微粒，测量其产生的散射光和发射荧光的强度，从而对细胞（或微 粒）的物理、生理、生化、免疫、遗传、分子生物学性状及功能状态等进行定性或定量检测的 一种现代细胞分析技术，可对单个细胞准确的定量分析和分类。
[0003] 流式细胞分析在医学基础、临床及科学研究中有着广泛的应用前景。在流式细胞 仪的绝对定量分析中，采用了定量荧光素分子微球法，在该方法中需要特制的包含有荧光 素分子的微球标准物质，再将包被不同分子数的微球混合，形成含不同数量荧光素分子的 混合微球；在流式细胞仪仪器设置相同的条件下测定此微球标准物质及待测细胞的荧光响 应值，根据微球上的荧光素分子数和与之对应的对数荧光响应值计算回归方程，得到待测 细胞的生理参数。可以看到，具有特定荧光响应值的微球标准物质是实现此项测量的关键 技术标准。目前流式细胞仪被广泛应用于国内外的临床医学检验、生物科学研究等重要领 域中，其主要计量性能包括仪器荧光分辨率、灵敏度、光路及液流准直行、光电倍增管稳定 性等。上述计量性能的好坏直接影响仪器测量结果的准确与否，在一些临床实验室需要对 上述性能参数进行必要的质量控制和评价。目前国内没有相关的计量标准和检定规程，无 法保证仪器量值的准确性和可靠性。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种微球荧光强度标准物质的定值方法。
[0005] -种微球荧光强度标准物质的定值方法，包括如下步骤：
[0006] (1)制备微球荧光强度标准物质；
[0007] (2)测定荧光素粉末纯度，以备计算配制荧光素标准母液；
[0008] (3)校准突光分光光度计，配制突光素标准母液，建立仪器突光响应值与突光素浓 度的校准曲线；
[0009] (4)测定微球荧光强度标准物质的颗粒数量浓度：用PBS溶液将微球荧光强度标 准物质稀释得到悬浊液，用移液器吸取所述悬浊液置于网格滤膜上，并进行抽滤，将所述悬 浊液中的颗粒物全部截留于所述网格滤膜上，然后对所述网格滤膜上的颗粒物进行计数， 利用公式I计算得到标准物质的颗粒数量浓度?:
[0010]
【权利要求】
1. 一种微球荧光强度标准物质的定值方法，其特征在于，包括如下步骤： (1) 制备微球荧光强度标准物质； (2) 测定荧光素粉末纯度，以备计算配制荧光素标准母液； (3) 校准荧光分光光度计,配制荧光素标准母液，建立仪器荧光响应值与荧光素浓度的 校准曲线； (4) 测定微球荧光强度标准物质的颗粒数量浓度：用PBS溶液将微球荧光强度标准物 质稀释得到悬浊液，用移液器吸取所述悬浊液置于网格滤膜上，并进行抽滤，将所述悬浊液 中的颗粒物全部截留于所述网格滤膜上，然后对所述网格滤膜上的颗粒物进行计数，利用 公式I计算得到标准物质的颗粒数量浓度(；： cn =^τκ/ 公式 I CN :微球荧光强度标准物质的颗粒数量浓度，πιΓ1 ; N :颗粒数量计数值； V :移液器吸取悬池液的体积，ml ; f :稀释倍数； (5) 测量样品荧光响应值，根据荧光响应值与荧光素浓度的校准曲线得到样品中的荧 光素浓度，再根据标准物质的颗粒数量浓度CN计算得到每个微球荧光强度标准物质颗粒所 携带的荧光分子数MESF。
2. 根据权利要求1所述微球荧光强度标准物质的定值方法，其特征在于，所述步骤（1) 具体步骤如下： 将异丙醇和蒸馏水按照重量比为〇. 2?2. 0的比例配制成异丙醇水溶液，然后向100g 所述异丙醇水溶液中加入5g?15g醋酸乙烯酯单体，0. 5g?2. 0g聚苯乙烯基批咯烧酮 和0. lg?0. 3g过硫酸钾，在40°C?80°C条件下反应10h后，在80°C下烘干得到微球；称 取4?1(^的所述微球，将其悬浮于30(^质量分数为5%?20%的似0!1甲醇溶液中，在 20°C?80°C条件下水解5h，然后用蒸馏水洗涤，再在80°C下烘干得到标称值为7 μ m的表面 携带轻基的微球；量取0. lg?5g的所述表面携带轻基的微球加入到50ml?1000ml的异 硫氰酸荧光素 FITC缓冲液中，在20°C?50°C下培养3h后用浓度为20mmol/L的PBS溶液 离心洗涤，得到荧光微球，所述离心转速为5000r/min?15000r/min ;最后将所述荧光微球 分散于l〇〇ml?500ml浓度为20mmol/L的PBS缓冲液中，得到微球荧光强度标准物质，并 用显微镜检验微球荧光强度标准物质上羟基携带情况。
3. 根据权利要求1所述微球荧光强度标准物质的定值方法，其特征在于，所述步骤（2) 具体步骤如下： 采用定量核磁共振法测定荧光素粉末纯度，所述定量核磁共振法的内标为尼泊金乙 酯国家标准物质，测定参数为：激发脉冲角度30°，时间域数据点为32k，扫描宽度为 9615. 385Hz，弛豫延迟32s，累计采样16次，探头温度为298K，滤波宽带为125kHz，频率 域数据点为16k。
4. 根据权利要求2或3所述微球荧光强度标准物质的定值方法，其特征在于，所述步骤 (3)具体步骤如下：校准荧光分光光度计；在25°C条件下配制pH为9. 54,浓度为0. lmol/ L的硼酸缓冲液，准确称取5. 796mg荧光素粉末溶解于271. 34g所述的硼酸缓冲液中，得到 浓度为58?61 μ mol/kg的荧光素标准母液，再用浓度为20mmol/L的PBS缓冲液将所述 荧光素标准母液稀释得到6种不同浓度的荧光素标准液，所述6种不同浓度的荧光标准液 浓度分别为：2 X lCT8mol/kg、1 X lCT8mol/kg、5 X lCT9mol/kg、2 X lCT9mol/kg、1 X lCT9mol/kg、 5 X lO^mol/kg，用荧光分光光度计分别测量所述6种不同浓度的荧光标准液的仪器荧光响 应值，以荧光标准液浓度值和仪器荧光响应值分别为X轴和Y轴，建立仪器荧光响应值与荧 光素浓度的校准曲线。
5. 根据权利要求1所述微球荧光强度标准物质的定值方法，其特征在于，所述步骤（4) 具体步骤如下：用浓度为20mmol/L的PBS溶液将微球荧光强度标准物质稀释10?1000 倍，得到悬浊液，用移液器吸取体积为〇. 2ml?5ml的所述悬浊液置于0. 1 μ m的网格滤膜 上，并进行抽滤，所述抽滤抽气流速为lL/min?10L/min，将所述悬浊液中的颗粒物全部截 留于所述网格滤膜上，然后将带有颗粒物的网格滤膜置于光学显微镜载物台上，逐格进行 成像，并对颗粒数量进行计数，利用公式I计算得到标准物质的颗粒数量浓度?。
6. 根据权利要求5所述微球荧光强度标准物质的定值方法，其特征在于，所述步骤（5) 具体步骤如下：用20mmol/L的PBS缓冲液将所述微球荧光强度标准物质稀释至2 X 105个/ ml?2X 106个/ml，用校准后的荧光分光光度计测量所述稀释后微球荧光强度标准物质的 荧光响应值，再根据仪器荧光响应值与荧光素浓度的校准曲线，得到所述微球荧光强度标 准物质的荧光素浓度C E ;最后根据公式II计算出所述微球荧光强度标准物质中每个颗粒携 带的荧光分子数MESF :
CE :根据校准曲线，得到的微球荧光强度标准物质的荧光素浓度，mol/kg ; CN :微球荧光强度标准物质的颗粒数量浓度，ml'
【文档编号】G01N15/06GK104101586SQ201410352524
【公开日】2014年10月15日 申请日期:2014年7月23日 优先权日:2014年7月23日
【发明者】刘俊杰, 修宏宇, 张伟 申请人:中国计量科学研究院